TERÁPIAREZISZTENCIA FEHÉRJ RJÉK K MŐKÖDÉSÉNEK M VIZSGÁLATA FLOWCYTOMETRIA ALKALMAZÁSÁVAL Szendi Eszter V. évfolyam Témavezetı: Dr. Vajdovich Péter TDK konferencia, 2008.11.26.
Terápiarezisztencia alapvetı sejtes védekezési mechanizmusok terápiarezisztencia: a sejtek legtöbbször a betegségek ellen használt terápiás készítményeket is idegen anyagként kezelik, azokat szervezetükbıl eltávolítják, csökkentve vagy akár kioltva ezzel a kezelés hatékonyságát kemoterápia! két forma: 1) eredendı 2) szerzett egyik ilyen mechanizmus: membránpumpa-fehérjék (effluxpumpák)
Két család: Membránpuma npuma-feh fehérj rjék major vault protein-ek (MVP-k) ATP binding casette transporters (ABC transzporterek) ATP függı, primer aktív transzporterek mőködésük: ATP-hidrolízis E-felszabadulás citotoxikus anyagok kipumpálása
MDR1 - multidrug resistance-1 Pgp - permeability-glükoprotein ABCb alcsalád jelen vannak: bél, máj, vese hámsejtek; mellékvese, tüdı, placenta, csontvelı, perifériás vér sejtjei, vér-agy /vér-here gát szubsztrátjai: vinblasztin, vinkrisztin mitoxantron doxorubicin, daunorubicin etopozid, paclitaxel
MRP1 - multidrug resistance associated protein-1 ABCc alcsalád GSH dependensek, hiányában elvesztik funkciójukat jelen vannak: tüdı, vékonybél, izom, vér, máj sejtjeiben; gyulladásos folyamatok szabályozása szubsztrájai: ua.mint az MDR1 + metotrexát
Effluxpumpák azonosítása sa Calcein-próba: funkcionális teszt fluoreszcencia mérésen alapul eredmények kifejezése: multidrog rezisztencia aktivitási faktor (MAF) calcein-am: nem-fluoreszkáló, lipofil vegyület IC észterázok calcein: fluoreszkáló, hidrofil vegyület, MDR szubsztrát magas MDR szám/maf alacsony IC calcein szint alacsony IC fluoreszcencia és fordítva
Effluxpumpák gátl tlása cél: az MDR pumpát a megfelelı antagonistával gátolva a gyógyszer a célsejtben maradjon gátló vegyületek: verapamil MDR-ek MK-571 MRP1 mechanizmus: (ONT-093 blokkolón keresztül bemutatva)
Flow Flow Áraml ramlás-citometria min alapul?: a sejtek fényszórási tulajdonságain mesterségesen elıidézett IC fluoreszcenciájuk mérésein képes több paraméter szimultán mérésére a sejteket egyesével, egymástól különállóan elemzi lamináris áramlás
a flowcytométer mőködése: High angle detector Cell két lézerfej kék 488nm (calcein) piros 633nm (TP3) négy fénydetektor- FL FL1 520nm (calcein) FL4 660nm (TP3) FSC; SSC Laser Low angle detector 0
a flowcytométer mőködése: két lézerfej kék 488nm (calcein) piros 633nm (TP3) négy fénydetektor- FL FL1 520nm (calcein) FL4 660nm (TP3) FSC; SSC
Célkit lkitőzésünk eredeti célkitőzésünk: különbözı tumoros szövetekbıl nyert biopsziás mintákból szeparáljunk el daganatosan elfajult sejteket, melyekben ezt követıen vizsgálhassuk a memebrán-transzport fehérjék funkcióját a calcein-próba segítségével vérbıl szeparált egészséges lymphocyták kérdés: változott-e a beteg kutyák keringı mononukleáris sejtjeinek multidrog rezisztencia aktivitási faktor (MAF) értéke a kemoterápiás kezelés hatására a kontroll kutyák vérében keringı hasonló sejtek MAF értékeihez képest?
Anyag és s módszer m Vizsgált állatok: 9 kezelés alatt álló lymphomás átlagéletkor: 8,27 év 4 szuka, 5 kan. 6 egészséges Beagle átlagéletkora: 4,75 év 3 kan, 3 szuka. Minta: alvadásban gátolt vénás vér Szükséges oldatok: Calcein -AM oldat Verapamil oldat (jelölés: V) Mk-571 oldat (jelölés: M) HBSS oldat (jelölés: H) To-Pro (TP3) oldat A minták elıkészítése: egészséges mononukleáris sejtek elkülönítése Ficollreagenssel az elkülönített sejtek felvétele HBSS-ben
Áramlás-citometriás mérés: FacsCalibur flowcytométer és Cellquest program minden mintából 5000 sejt kapuzás : R1 : méret és granuláltság alapján különítettük el a szükséges sejteket (lymphocyták és monocyták) R2 : azokat a sejteket szőrtük ki, melyeknél magas volt az 520 nm-es emittálás magas volt az IC calcein szintjük R3 : az élı sejteket válogattuk ki, melyeknél alacsony volt a 660 nm-es emittálás nem vették fel a TP3-at (ok: ép a sejtmembránjuk)
kapuzás R1 R2 R3 marad: mononukleáris, magas IC calcein szintő, élı sejtek
IC calcein szintek: Eredmények IC calcein szint = IC fluoreszcencia értékek IC calcein (VP) > IC calcein (MK) > IC calcein (HBSS) beteg IC calcein szint < a kontroll (p<0,05)
s MAF értékek kiszámítása: MAF: IC flc.(gátolt) - IC flc.(gátlás nélküli) / IC flc.(gátolt)*100 beteg átlagos MAF (mrp1+mdr1) értékek > kontroll (p<0,01) beteg átlagos MAF (mrp1) értékek > kontroll (p<0,06) nincs szignifikáns különbség a kontroll-beteg átlag MAF(mdr1) értékekben P<0,01
Következtet vetkeztetések a betegek esetében az effluxpumpa mechanizmus fokozottabban mőködik, és/vagy az effluxpumpák száma (mennyisége) nıtt a kemotrápia hatására a kemoterápiás kezelés hatására az MRP1 aktivitása jelentısebb mértékben okozott effluxfunkció erısödést, míg az MDR1-é nem változott számottevıen
Kösz szönetnyilv netnyilvánítás Témavezetımnek: Dr. Vajdovich Péternek Dr. Karászi Évának és Dr. Várady Györgynek (Országos Gyógyintézeti Központ Haematológiai és Immunológiai Intézet) Dr. Szécsényi Dórának Belgyógyászati Tanszék és Klinikának Családomnak
Kösz szönöm a figyelmet!