Használati útmutató a Cell Lab Quanta SC (Beckman Coulter) áramlási citométerhez Tartalom A citométerek általános működési elve... 1 A Cell Lab Quanta SC áramlási citométer sajátosságai... 2 A Cell Lab Quanta SC citométer bekapcsolása... 5 Mérés... 7 Kikapcsolás... 7 Takarítási és karbantartási protokoll... 8 Irodalomjegyzék... 9 A citométerek általános működési elve Az áramlási citométerek szuszpenzióban lévő sejtek fényszórási (méret, granuláltság) és fluoreszces paramétereinek vizsgálatára alkalmasak. Leggyakrabban sejtfelszíni antigének, vagy intracelluláris fehérjék vizsgálatára, sejtciklus-analízisre, sejtek életképességének/ apoptózisának vizsgálatára, intracelluláris ionkoncentrációkban bekövetkező változások mérésére (pl. Ca 2+ jel mérése), illetve membránpotenciál-változások (plazmamembrán-, mitokondrium membránpotenciál) mérésére használják. Előnyük a nagy sebesség: másodpercenként több száz, vagy akár több ezer egyedi sejtről gyűjthetünk adatokat. Az egyedi sejtek vizsgálatát a mérőcella speciális kialakítása, illetve az úgynevezett hidrodinamikai fókuszálás teszi lehetővé. Ennek során egy kettős keringési rendszerben a sejtszuszpenziót koncentrikusan körbefogja egy másik, úgynevezett köpenyfolyadék. Ez a 1
koncentrikus elrendeződés pozícionálja a sejteket a mérőcella középső területére. A sejtszuszpenzió áramlási sebessége változtatható, amely a hidrodinamikai fókuszálással együtt biztosítja, hogy egyszerre csak egyetlen sejt haladjon át a mérőcella közepére fókuszált gerjesztő lézernyalábon. Lézerforrásként legelterjedtebbek a 488 nm-es kék gerjesztő fényt biztosító, 15-20 mw-os argon lézerek, de esetenként - kiegészítő fényforrásként előfordulnak vörös gerjesztő fényt biztosító He-Ne lézerek, vagy higanygőz lámpa is 1. A lézeres gerjesztést követően háromféle jelet detektálhatunk. Az előre irányuló fényszórást (FSC forward scatter) a gerjesztő fény irányában álló detektor érzékeli. Ez a paraméter a sejtek méretével, illetve alakjával arányos. Az oldalirányú fényszórást (SSC side scatter) a gerjesztő lézernyalábra merőlegesen elhelyezett detektor regisztrálja. Ez esetben a gerjesztő fény a sejtekbe jutva, a sejtorganellumokon törik meg, szóródik, így ez a paraméter a sejtek granuláltságáról, organellumokbani gazdagságáról ad információt. A harmadik paramétert, a fluoreszcenciát (FL) akkor tudjuk detektálni, ha a sejtet, vagy annak valamely alkotóját fluoreszcens festékkel, vagy fluoreszcensen jelzett ellenanyaggal megjelöljük. A legtöbb készülék egy 488nm-es lézerrel szerelt és egyszerre három különböző hullámhosszú fluoreszcens jelet tud detektálni, három csatornában (FL1, FL2, FL3) 1. Ugyanakkor a legmodernebb, három lézerrel felszerelt készülékek egyidejűleg akár 10 fluoreszcens csatornában is képesek detektálni. A Cell Lab Quanta SC áramlási citométer sajátosságai A legtöbb citométer folyamatos szívóhatást fejt ki a mintavevő fejen keresztül, így tehát a mintavétel a mintatartó csőből folyamatos. A Cell Lab Quanta SC készülék ezzel szemben egy hamilton fecskendővel rendelkezik, melybe egyszerre 250 µl térfogatú mintát képes felszívni, majd adagolni az áramlási kamrába. Ha a minta elfogy, a készülék újratölti a fecskendőt és folytatja a mérést. A másik lényeges eltérés, hogy a többi készülék általában pozitív nyomást generál, és ennek segítségével mozgatja a folyadékot a rendszerben. A Cell Lab Quanta SC ezzel szemben vákuumszivattyút használ a folyadék továbbításához. A harmadik különbség, hogy a Cell Lab Quanta SC nem tud előre irányuló fényszórást (FCS) mérni. Ehelyett két elektród között méri az impedanciát. Az elektródok között áthaladó sejtek impedanciaváltozást okoznak, amely változás arányos a térfogatukkal. A paramétert ennek megfelelően nem FSC, hanem EV (electronic volume) néven tünteti fel a készülék szoftvere. A készülék az EV mellett méri továbbá az oldalirányú fényszórást (SS), valamint három 2
csatornában a fluoreszcenciát (FL1-3). Ugyancsak egyedi az áramlási kamra alakja. amely háromszög keresztmetszetű. Mivel a kamra falainak hatására változik a folyadék áramlási sebessége, így a háromszög keresztmetszet segít a folyadék hidrodinamikai fókuszálásában (1. ábra). A Cell Lab Quanta SC felépítését a 2. ábra szemlélteti. 1. ábra: A Cell Lab Quanta SC citométer áramlási kamrája, illetve a hidrodinamikai fókuszálás 2. 2. ábra: A Cell Lab Quanta SC citométer vázlatos felépítése 2. 3
A Cell Lab Quanta SC citométerben a 488 nm-es hullámhosszú lézer mellett található egy higanygőzlámpa is. Ennek segítségével jelenleg 365, 404 és 435 nm-es hullámhosszon lehet gerjeszteni. A filterkonfigurációkat a 3. és a 4. ábrák szemléltetik. 3. ábra: Filterkonfiguráció 488 nm-es hullámhosszú lézer alkalmazása esetén 2. 4. ábra: Filterkonfiguráció higanygőz lámpa alkalmazása esetén 2. 4
A Cell Lab Quanta SC készülék méret szerinti méréstartománya 3-40 µm közötti (az áramlási kamra nyílása 125 µm). A legtöbb készülékben az FSC-t detektáló fotodiódát a szoftverben elvégzett beállításokkal a sejtek méretéhez lehet hangolni. A Cell Lab Quanta SC citométerben ezt a készülékben elhelyezett, úgynevezett EV jumper segítségével lehet megtenni. A jumper-nek három állása van, Small, Medium és Large (5. ábra). Az S állásban 3-10, az M állásban 10-15, míg az L állásban 15-40 µm közötti sejteket célszerű mérni. A jumper pozícióját a szoftverben is rögzíteni kell! 5. ábra: A mérési tartomány változtatását lehetővé tevő jumper 2. A Cell Lab Quanta SC citométer bekapcsolása 1. A mérést megelőzően a felhasználó köteles beírni magát az Élettani Intézet online műszernaptárába. A számítógép bekapcsolása után az adatgyűjtő szoftverből (6. ábra), az Instrument Start Up menü segítségével helyezzük üzembe a műszert. 2. A szoftver utasításait követve kapcsoljuk be és helyezzük a műszert áram alá a műszer hátsó részén a főkapcsoló gombbal. 3. Ellenőrizzük, hogy a Használt folyadéktároló (Waste) tartály üres legyen, valamint a Köpenyfolyadék (Sheath fluid) tartály a jelig legyen töltve. Ezt követően be lehet kapcsolni a vákuumpumpát (a kapcsoló a pumpán található, az aljzati dugaszhoz közel). 5
4. Ellenőrizzük a készülék belsejében lévő nyomásmérőn, hogy a rendszerben a nyomás elérte a -10 Hgmm-t. 5. Kapcsoljuk be a lézert, vagy a higanygőz lámpát (a lézert a szoftverből, a higanygőz lámpát manuálisan, a lámpa burkolatán elhelyezett kapcsolóval lehet bekapcsolni. 6. Egy mintacsőbe tisztító folyadékot (5%-os Hypo oldat, sterilre szűrve) kell rakni, mellyel a készülék átmossa a felszívó tűt. 7. Egy újabb mintacsőbe desztillált vizet töltünk, majd bármely mérési protokoll segítségével egy új mérést indítunk, amit legalább 5 percig futtatunk átöblítve ezzel a készüléket. 8. Az adott napon az első mérést megelőzően úgynevezett Flow Check reagenssel ellenőrizni kell a készülék optikai beállításait. Ehhez behozzuk a Flow Check Laser488 mérési protokollt, a jumpert Small állásba állítjuk, és 10 µl/min sebességgel futtatjuk a mintát (a Flow Checkből elegendő 10-15 cseppet csepegtetni a mintacsőbe, hígítani nem kell). Az SS erősítését 3.00-ra kell állítani. Az FL1-3 erősítéseket úgy állítjuk be, hogy a kapott hisztogramok a megadott markerek alatt legyenek. Ilyen beállítások mellett az FL hisztogrammok HPCV értékének 3% alatt kell lennie. Ekkor megfelelőek az optikai beállítások, a készülék készen áll a mérésre. 6. ábra: A Cell Lab Quanta SC adatgyűjtő szoftvere 2. 6
Mérés A méréshez be kell állítani a sejtek méretének megfelelő jumper-állást. Beállítani, vagy a meglévő listából választani egy mérési protokollt. Ebben tudjuk megadni, hogy milyen paramétereket szeretnénk regisztrálni (EV, SS, FL1, FL2, FL3, Time), illetve megjeleníteni, milyen lézer teljesítményt, áramlási sebességet, illetve erősítéseket kívánunk alkalmazni. A lézer maximális teljesítménye 22 mw, ezen általában nem szükséges változtatni. Az áramlási sebességet úgy célszerű megváltoztatni, hogy a képernyőn látható Rate érték 300-500 körüli, illetve ez alatti legyen. Így biztosítható, hogy az áramlási kamrában az egymást követő sejteket a készülék külön eseményekként értelmezze. Az EV és SS erősítéseket úgy célszerű beállítani, hogy az úgynevezett EV-SS dot plot-on a sejtpopuláció az ábra bal alsó részén helyezkedjen el, a minta teljes tartománya a dot plot-on legyen, a sejttörmelék/zaj ne legyen zavaró mértékű, és a sejtpopuláció a 45 -hoz közeli tartományban szóródjon. A sejttörmelék/zaj, illetve egyéb kis, vagy nagyméretű zavaró részecskék (pl összetapadt sejtek) kizárására egy alsó, és egy felső küszöb beállítása biztosít lehetőséget. Ezt mindig egy adott paraméterhez lehet hozzárendelni (pl EV), és külön lehet állítani a felső, és az alsó küszöbértéket. A szoftver lehetővé teszi, hogy akár egy adott dot plot ábrán, akár hisztogramon kikapuzzuk egy, vagy több sejtpopulációt. Ugyancsak beállítható, hogy a készülék mikor hagyja abba a mérést: amikor elért egy adott eseményszámot, amikor elért egy adott eseményszámot egy megadott kapun belül, amikor eléri egy adott hisztogram csúcsmagasságát, vagy egy adott futási térfogatot, vagy egy meghatározott időtartamot. A szoftverben lehetőség van sejtszámolás beállítására is, melynek eredményeként megkapjuk a mintában mért sejtkoncentrációt. A mérést a szoftverben található kezelőgombokkal lehet vezérelni. Minden minta után szükséges a mintacsövet egy üres csőre cserélni, és a Rinse gombbal egy mosási lépést indítani. Lehetőség van továbbá a már felszívott, de áramlási kamrába még nem továbbított minta Hamilton fecskendőből való visszanyerésére is. Kikapcsolás 1. A műszer és a számítógép kikapcsolása előtt el kell végezni a teljes Kikapcsolási protokollt az adatgyűjtő szoftver segítségével. A műszer kikapcsolása nem szükséges, ha 1-2 óráig használaton kívül van, utána azonban egy Öblítési ciklus szükséges a mintamérés előtt. 7
2. A citométert a szoftver utasításait követve kell kikapcsolni (Instrument ShutDown). 3. Tisztító folyadékot tartalmazó mintacsövet kell a felszívó tű alá helyezni és a műszert a Köpenyfolyadék tároló tartályról a Lekapcsolási tartályra (Shut Down Bottle - legalább 150ml lekapcsoláshoz szükséges folyadékot tartalmazzon) kell csatlakoztatni. Ezután meg kell várni, míg a rendszer befejezi a Tisztító ciklust. 4. Az utasításokat tovább követve ki kell kapcsolni a vákuum pumpát, majd ki kell üríteni a Használt folyadéktároló tartályt. 5. A készülék főkapcsolójának kikapcsolása után a szoftvert be lehet zárni és kikapcsolni a számítógépet. A Lekapcsolási tartályról le kell választani a csövet, amit egy erre kihelyezett edényben (főzőpohár) kell tárolni. A Leállítási tartályt és a Köpenyfolyadék tartályt fel kell tölteni, a pipettahegyeknek, mintacsöveknek kihelyezett ledobót ki kell üríteni. Végezetül minden felhasználó köteles a készülék mellett elhelyezett műszernaplót kitölteni és aláírni. Mivel a készülék szoftvere a napi bekapcsolási és kikapcsolási, valamint a tisztítási protokollt tartalmazza, a további pontok csak javaslatok a felhasználók számára: Takarítási és karbantartási protokoll 1. A készüléket használat után, kikapcsolás előtt érdemes Tisztító folyadékkal átmosni, ami megelőzi a szennyeződések lerakódását. 2. A készüléket célszerű Tisztító folyadékkal átmosni hetente legalább egyszer, ha napi rendszerességgel használják azt. 3. Dugulás esetén a szoftver által felkínált tisztítási lépéseket érdemes először elvégezni, majd ha továbbra is fennmarad a probléma, Tisztító folyadék használatával mossuk a készüléket 5 percig. 8
4. A készülékhez tartozó Használt folyadéktároló tartályt napi vagy heti rendszerességgel érdemes üríteni a felhasználás gyakorisága szerint. 5. a készülék belső terében látható sárga, veszélyt jelző feliratokkal jelzett részeket a lézer vagy a higanygőz lámpa üzemelése alatt nem szabad kinyitni (7. ábra). 7. ábra: A Cell Lab Quanta SC készüléken feltűntetett figyelmeztető jelzések 2. Irodalomjegyzék 1 Erdei Anna, Immunológiai Módszerek (Budapest: Medicina Könyvkiadó Zrt., 2006). 2 Cell Lab Quanta TM SC, 'Instructions for Use', Beckman Coulter, Inc., (2005) <http://www.coulterflow.com/bciflow/documents/instruments/cell%20lab%20quant a%20sc%20mpl/cell%20lab%20quanta%20sc%20instructions%20for%20use%2 0(721742).pdf>. Készítette: Csépányi-Kömi Roland, műszerfelelős Semmelweis Egyetem, Élettani Intézet 2013 Az oktatási segédanyag készítése a TÁMOP 4.2.4.A/1-11-1-2012-0001 Nemzeti Kiválóság Program című kiemelt projekt keretében zajlott. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósul meg. 9