Leucosep-csövek LTK.615 KEZELÉSI ÚTMUTATÓ In vitro diagnosztikai célra PI-LT.615-HU-V3
Használati útmutató Javasolt alkalmazás A Leucosep-csövek a periferiás vérből nyert mononukleáris sejtjek (Peripheral Blood Mononuclear Cells. PBMC) gyűjtésére és elkülönítésére szolgálnak teljes vérből. A csövek a PBMC elkülönítését könnyítik meg teljes vérből, a FICOLL-PAQUE* PLUS eljárás segítségével, e sejteknek az ELISPOT tesztekben történő alkalmazását megelőzően. Bevezetés Az ELISPOT eljárás a PBMC sejtekből szeparált T-sejteket használ, teljes vérből. E sejtek elkülönítésére szolgáló egyik eljáráshoz szükséges a FICOLL-PAQUE PLUS teszt. Az eljárás egy sor olyan lépést foglal magában, amelyeket az optimális teljesítmény biztosítása érdekében körültekintően kell elvégezni. A Leucosep-csövek alkalmazása csökkenti a lépések számát, megbízhatóbbá teszi az eljárást és csökkenti az elkülönítésre szolgáló időt. Az eljárás alapelve A Leucosep-csövek a PBMC sejtek gyűjtésére és elkülönítésére szolgálnak teljes vérből, sűrűséggradiens centrifugálással. A Leucosep-csövek porózus gátat tartalmaznak átlátszó polipropilén csőben. Ez a biológiai szempontból inaktív gát jó minőségű polietilénből áll. A Leucosep-cső révén kiküszöbölhető a mintaanyagnak az idő- és munkaigényes felvitele a FICOLL- PAQUE PLUS közegre. Az antikoagulánssal kezelt teljes vért táptalajjal vegyítjük, majd a Leucosep-csőbe öntjük. A porózus gátnak köszönhetően a vér nem keveredik az elválasztóközeggel (FICOLL-PAQUE PLUS). A centrifugálás során a PBMC sejtek eltérő sűrűségüknek köszönhetően elkülönülnek a nemkívánt eritrocitáktól és az elválasztóközeg feletti határfelületi rétegben gyűlnek össze. Az elválasztás végeztével a gát védi a periferiás vérből nyert mononukleáris sejtréteget az újrafertőződéstől ez utóbbinak az eltávolítása során. Figyelmeztetések és előírások 1. Kizárólag in vitro diagnosztikai célra. 2. Csak szakképesített személyek használhatják; a tesztet végző személynek megfelelő kiképzésben kell részesülnie. 3. A vérmintákat potenciálisan veszélyes anyagnak kell tekinteni. A humán eredetű anyaggal elővigyázatosan kell bánni. 4. A teljes vér minták és a tesztkomponensek felhasználása, tárolása és ártalmatlanítása a biológiailag veszélyes anyagokra vonatkozó, megfelelő nemzeti irányelvekben és szabályozásokban meghatározott módon kell történnie. 5. Bármilyen eltérés az ajánlott pipettázási, mosási, centifugálási időbeli és/vagy hőmérsékletbeli eljárásoktól hatással lehet a periferiás vérből nyert mononukleáris sejtek izolálására és befolyásolhatja a további tesztelési eredményeket. 6. Tilos a vért a sejtpreparálási csövekben (CPT, Cell Preparation Tubes, Becton Dickinson) vagy az EDTA tartalmú vérgyűjtő-csövekbe gyűjteni, mivel e két csőtípus nem kompatibilis a Leucosep-csövekkel. 7. Ne hűtse és ne fagyassza a teljes vér mintákat. A vérminták 18 C és 25 C közötti hőmérsékleten szállítandók és tárolandók a laboratóriumban, vagy pedig 10 és 25 C között ha T-Cell Xtend reagenssel kell a mintákat kezelni. 8. A vért nem szabad 8 órával tovább tárolni, vagy pedig 32 órával tovább ha később T-Cell Xtend reagenssel kezelik azt. 9. Kizárólag egyszer használatos tartályokat szabad alkalmazni a vénás vérminta vételre. 10. Ne használja a lejárati időn túl. 11. E terméket csíramentes technikával kell kezelni. 12. Tilos a Leucosep-csöveket közvetlen fényben tárolni. 13. Tilos sérült Leucosep-csövet vagy rossz FICOLL-PAQUE PLUS közeget használni, ezt a megszokottól eltérő sárga szín vagy szemcsés anyag megjelenése jelzi az átlátszó oldatban. Leucosep kezelési útmutató 2 / 6 PI-LT.615-HU-V3
Szállított anyagok Minden egyes doboz tartalma: 50 db FICOLL-PAQUE PLUS közeggel töltött Leucosep-cső. Kezelési útmutatót és adatbiztonsági adatlapot tartalmazó CD. Tárolás és stabilitás 4 C és 30 C közötti hőmérsékleten, a dobozon feltüntetett lejárati időpontig tárolandó. A megbontott termék szobahőmérsékleten (18 C és 25 C között) tárolandó és a külső zacskó felbontását követően 12 héten belül, vagy a dobozon feltüntetett lejárati időpontig használható fel (mindig ami előbb történik). Szükséges de nem szállított anyagok és berendezés 1. Heparinizált vérvételi csövek. 2. AIM V és RPMI sejtkultúra-táptalaj. 3. 15 ml-es centrifugacsövek. 4. Centrifuga a PBMC sejtek frakcionálásához, legalább 1000 RCF (g) teljesítménnyel és amely a mintákat szobahőmérsékleten (18 C és 25 C között) képes tartani. 5. 2-es biológiai biztonsági szintű (BL2) fülke (ajánlott). 6. Pipetták és steril pipettahegyek. 7. ELISPOT-készlet. 8. Ha a minta 8 óránál tovább lett tartva, akkor lehet, hogy T-Cell Xtend-et kell használni Eljárás Megjegyzés: A helyes laboratóriumi gyakorlat elveinek megfelelően az alábbi lépéseket kell elvégezni: 1. Bizonyosodjon meg arról, hogy a szükséges számú Leucosep-csövet használat előtt szobahőmérsékletűre (18 C és 25 C közötti hőmérsékletre) hozta. 2. Ha FICOLL-PAQUE PLUS közeg gyűlt fel a porózus gát (szemcsék) felett, centrifugálja a Leucosep-csöveket 1 percig 350 x g sebességen, hogy a FICOLL-PAQUE PLUS a keverék a gát alá kerüljön. 3. A teljes vérmintát forgassa meg, majd 15 ml-es centrifugacsőben hígítsa 5 rész vér és 3 rész AIM V vagy RPMI táptalaj arányban. A centrifugacsövet néhányszor forgassa meg, hogy felkeveredjen a tartalma. 4. A felhígított vért öntse közvetlenül a Leucosep-csőbe és 10 percig, 18-25 C fokon 1000 x g sebességen, fék nélkül centrifugálja. 5. Szívja fel PBMC sejtek zavaros rétegét és 15 ml-es centrifugacsőben egészítse ki AIM V vagy RPMI táptalajjal ~10ml-ig. A centrifugacsövet forgassa meg, hogy tartalma felkeveredjen. 6. Centrifugálja 7 percig 600 x g sebességen. Dobja el a felülúszót. 7. A sejtüledéket AIM V vagy RPMI táptalajjal szuszpendálja újra, ~10 ml-ig AIM V vagy RPMI táptalajjal egészítse ki és centrifugálja további 7 percig 350 x g sebessgégen. 8. A felülúszót dobja el és a sejtüledéket az ELISPOT teszt szerint előírt AIM V térfogatban (nem RPMI) táptalajjal szuszpendálja újra. 9. Ha az ELISPOT tesztben a sejtek antigén stimuláláshoz kellenek, ezeket AIM V (nem RPMI) táptalajjal hígítsa fel. Korlátozás 1. A többi elkülönítési eljáráshoz hasonlóan, a Leucosep-csövek módosíthatják egyes PBMC sejtek részegységeinek (pl. a T- és B-sejteknek) az arányát, a nem szeparált, teljes vérben levőkhőz viszonyítva. Ez az eltérés normális esetekben vélhetően viszonylag jelentéktelen. Leucosep kezelési útmutató 3 / 6 PI-LT.615-HU-V3
Minőségellenőrzés A gyártó által elvégzett belső tesztek során nem tapasztaltak jelentősebb csökkenést a PBMC hozamban a Leucosep-csövek és a FICOLL-PAQUE PLUS eljárás összehasonlítása során. Az egyéni, laboratóriumban végzett minőségi ellenőrzés részeként a sejtszámláló módszereket úgy kell tervezni és jóváhagyni, hogy azokból az adott tesztrendszer számára elegendő számú PBMC sejtet kapjanak. A minőségellenőrzési tevékenységnek továbbá a T-sejtek várt teljesítményének az adott tesztrendszeren belüli biztosításához kifejlesztett pozitív és negatív ellenőrzést is alkalmaznia kell. Teljesítményjellemzők T-Cell Xtend reagenssel tárolt vér Két-két 6 ml-es vérmintát vettek 46 személytől. Az egyik mintát 8 órán belül kézi FICOLL* rétegezéssel kezelték. A második mintát pedig 29-32 órás tárolás után Leucosep cső és T-Cell Xtend segítségével kezelték. Mindkét esetben elég sejtet kaptak egy ELISPOT vizsgálat elvégzéséhez, és ebben a vizsgálatban az összes mintából származó sejt normálisan viselkedett. Friss vér Két-két 6 ml-es vérmintát vettek 52 személytől. A mintákat a vérvételtől számított 8 órán belül kezelték. Az egyik mintát 8 órán belül kézi FICOLL rétegezéssel, a második mintát pedig Leucosepcső segítségével. Mindkét esetben elég sejtet kaptak egy ELISPOT vizsgálat elvégzéséhez, a vizsgálatban az összes mintából származó sejt funkcionális maradt. Hibaelhárítási útmutató a PBMC begyűjtésére és elkülönítésére vonatkozóan az ELISPOT céljára Probléma Lehetséges ok Lehetséges megoldás Kevés sejtmennyiség Leucopenia Adjon hozzá egy további vérvételi csövet Nem megfelelő vérmintagyűjtés A vérvételi cső nincs szobahőmérsékleten (18 C és 25 C között) A vért nem a megfelelő hőfokon tárolták Az előírttól eltérő térfogat vagy hígítás alkalmazása Az EDTA-t tartalmazó CPT (sejtpreparálási) és a vérvételi csövek nem kompatibilisak a Leucosep-csövekkel Hagyja felmelegedni szobahőmérsékletűre a vérvételi csövet vér szállítása 18 C és 25 C közötti hőmérsékleten történt, vagy pedig 10 és 25 C között ha T-Cell Xtend-et használtak Ellenőrizze, hogy az előírásokat betartották Leucosep kezelési útmutató 4 / 6 PI-LT.615-HU-V3
Szennyeződés vörösvértesttel Nem jól meghatározott vagy különálló mononukleáris sejtréteg Érvénytelen eredmény A vért nem a megfelelő hőfokon tárolták A vérvételi cső nincs szobahőmérsékleten (18 C és 25 C között) A vért nem hígították A vérminta megfordult a Leucosep-csőben Nem megfelelő centrifugálás A mintában az elkülönítés nem teljes A mintában az elkülönítés nem teljes A centrifuga nem megfelelően kalibrált Nem megfelelő centrifugálás Nagy mennyiségű vérzsírt tartalmazó minta A nem megfelelő mintakezelés érvénytelen eredményhez vezethet vért 18 C és 25 C közötti hőmérsékleten szállították, vagy pedig 10 és 25 C között ha T-Cell Xtend-et használtak Hagyja felmelegedni szobahőmérsékletűre a vérvételi csövet vért az előírásoknak megfelelően hígították Leucosep-cső a centrifugálás előtt álló helyzetben marad Ellenőrizze, hogy a centrifugálási előírásokat betartották Ellenőrizze, hogy a centrifuga képes a hűtésre 18 C és 25 C között Ellenőrizze, hogy a centrifugafék ki legyen kapcsolva. Növelje a centrifugálási lépés idejét 10 perccel. Növelje a centrifugálási lépés idejét 10 perccel. Kalibrálja a centrifugát Ellenőrizze, hogy a centrifugálási előírásokat betartották A vérvétel éhgyomorra kell, hogy történjék További információt a előzőrészben talál Leucosep kezelési útmutató 5 / 6 PI-LT.615-HU-V3
A szimbólumok jegyzéke» Felhasználás/Lejárati idő (év-hónap-nap) 3 Gyártási szám 4 Katalógusszám Figyelem, kövesse a használati utasítást Ó Gyártó i n számú tesztre elegendő 1 In vitro diagnosztikai készülék j Hőmérsékletkorlátozás/Tárolás ² Nézzen utána a használati utasításban A T-Cell Xtend és az Oxford Immunotec logo az Oxford Immunotec Limited cég védjegye. A AIM V a Invitrogen cég védjegye. A CPT a Becton Dickinson cég védjegye. * A FICOLL és a FICOLL-PAQUE a GE Companies cégek védjegye. A T-Cell Xtend reagens használatát az alábbi szabadalmak és folyamatban lévő szabadalmak védik: EP2084508; US13/253,598, CN101529221, AU2007-303994, JP2009-530943, IN2165/DELNP/2009, CA2665205. Oxford Immunotec Limited, 2013. Minden jog fenntartva. Gyártó cég: Oxford Immunotec Ltd 94C Innovation Drive, Milton Park, Abingdon Oxfordshire, OX14 4RZ, UK +44(0)1235 442796 www.oxfordimmunotec.com Leucosep kezelési útmutató 6 / 6 PI-LT.615-HU-V3