Vérplazma homociszteinszint csökkentő gyógyszerkészítmények formulálási vizsgálata

Semmelweis Egyetem Gyógyszerészeti Intézet Vérplazma homociszteinszint csökkentő gyógyszerkészítmények formulálási vizsgálata Ph.D. értekezés Írta : Budavári Zoltán Témavezető : Prof. Dr. Rácz István D.Sc. Budapest 2001

Vérplazma homociszteinszint csökkentő gyógyszerkészítmények formulálása Készült a Semmelweis Egyetem Gyógyszerészeti Intézetében Témavezető: Prof. Dr. Rácz István D.Sc. Összefoglaló Napjainkban egyre több klinikai vizsgálat számol be arról, hogy a folsav, B 6 - és B 12 -vitaminok ajánlott napi mennyiség feletti alkalmazása elsődlegesen jelentős a koronáriás szívbetegségek megelőzésében. A gyógyszerkészítmények minőségével, külső megjelenésével, gazdaságos, reprodukálható előállításával kapcsolatos egyre növekvő követelmények, valamint az a szükségszerűség, hogy a preformulálási, formulálási kísérlet a lehető legrövidebb idő alatt elvégezhető legyen, olyan módszerek kiválasztására ösztönöztek, amelyek ésszerű kísérleti tervezést és gyors objektív értékelést tesznek lehetővé. Munkám során ezért célul tűztem ki közvetlen préseléssel előállított, az irodalomban leírt klinikai vizsgálatok alapján legjobbnak ítélt folsav, B 6 - és B 12 - vitamin-kombinációt tartalmazó tabletták formulálását, kompatibilitási szempontból optimális segédanyag-összetételének kiválasztását. Preformulálási munkám során termoanalitikai (DTG, DSC), kromatográfiás (HPLC) és spektrometriás (NIR) módszereket alkalmaztam. Az esetleg fellépő interakciókat Ac-Di-Sol, Cellactose, Tablettose, Avicel PH101, Ludipress, magnézium-sztearát közvetlen préselésre alkalmas segédanyagokkal vizsgáltam. A vitaminok és a laktóz-tartalmú segédanyagok (Cellactose, Ludipress, Tablettose) 1+1 arányú fizikai keverékeinek preformulálási vizsgálatai során interakciókat tártam fel, amelyek destabilizáló hatását bizonyítottam. Preformulálási eredményeim alapján lehetővé vált a hatóanyag-segédanyag inkompatibilitás feltárása, valamint az adott hatóanyag-összetételhez kompatibilis segédanyag-rendszer kiválasztása, amelyek felhasználásával megfelelő stabilitással, reprodukálható gyárthatósággal és optimális hatékonysággal rendelkező gyógyszerkészítményt formuláltam. i

Formulation of tablets decreasing plasma homocysteine level Prepared under the guidance of Prof. Dr. István Rácz D.Sc. in the Pharmaceutical Institute of the Semmelweis University Summary Clinical studies confirm that intake of folate, vitamin B6 and B12 above the current recommended dietary allowance is of great significance in the primary prevention of coronary heart disease. In order to fulfil the ever increasing requirements concerning the external appearance, reproducible production of medicines and to decrease the time necessary for the preformulation and formulation experiments, I selected methods which enabled rational experimental design and fast objective evaluation. The objective of my thesis was to formulate tablets containing folic acid, vitamin B6 and B12 of optimal therapeutic concentration and of required stability in the presence of novel excipients applied in direct compression. In the course of my preformulation work thermoanalytical (DTG, DSC), chromatographic (HPLC) and spectrometric (NIR) methods were applied. Destabilising interactions were evaluated with directly compressible excipients, like Ac-Di-Sol, Cellactose, Tablettose, Avicel PH101, Ludipress. Interactions were detected in the 1+1 physical mixtures of vitamins and excipients containing lactose (Cellactose, Ludipress, Tablettose) and their destabilising effect was confirmed. The results of preformulation studies enabled detection of drug-excipients interactions and selection of compatible excipient system to the given drug composition to formulate dosage form of required stability, processibility and effectiveness. ii

BIBLOGRÁFIA Közlemények I. Zelkó, R., Budavári, Z., Marton, S., Rácz, I.: The effect of solid-liquid interfacial interactions on the content uniformity of tray-dried granule fractions Effet des interactions interfaciales des liquides solides sur le contenu en agent des fractions granulaires séchées sur plateau; S.T.P. Pharma Sciences, 9(2), 215-217, 1999 II. Budavári, Z., Zelkó, R., Rácz, I., Marton, S.: Folic acid and Vitamin B6 - Direct compression excipients: Preformulation stability screening using differential scanning calorimetry; Pharmazie, 54(11), 861-862, 1999 III. Budavári, Z., Zelkó, R., Marton, S., Rácz, I.: Interparticular Theophylline Distribution of Single Coated Particles Controlled by Gas Chromatography/Mass Spectrometry; Drug Development and Industrial Pharmacy, Accepted reference-no. UT2000-127, in print, 2000 IV. Budavári, Z., Zelkó, R., Antal, I., Marton, S., Rácz, I.: Comparison the Stability of Different Tablet Formulations Containing Folic Acid, Vitamin B6 and B12; Pharmazie, Accepted reference-no. P 1005, in print, 2001 Előadások V. Muskáth Zsolt, Budavári Zoltán, Plachy János, Máday Emőke, Rácz István: Lehetőségek a gázkromatográfia-tömegspektrometria alkalmazására a gyógyszerészi gyakorlatban; Magyar Kémikusok Egyesülete, Tömegspektrometriai Társaság Finnigan MAT GmbH, 1998 iii

VI. Budavári Zoltán: B 6, B 12, folsav, és közvetlen préselésre alkalmazott tablettázási segédanyagok kompatibilitási vizsgálata termikus elemzési módszerek segítségével; SOTE PhD Tudományos Napok, 1999 VII. Budavári Zoltán, Csóka Gabriella, Zelkó Romána, Rácz István, Marton Sylvia: B 6, B 12, folsav és közvetlen préselésre alkalmazott tablettázási segédanyagok kompatibilitási vizsgálata termoanalitikai módszerekkel; Gyógyszerészek Országos Kongresszusa IX. Congressus Pharmaceuticus Hungaricus XI., 1999 VIII. Orbán, Á., Zelkó, R., Dredán, J., Budavári, Z., Rácz, I., Marton, S.: Examination of polymer films by physico-chemical methods; Semmelweis Tudományos Fórum, Budapest, 1998 IX. Bihari, E., Zelkó, R., Dredán, J., Balogh, E., Budavári, Z., Szabó, A., Magyar, K., Lendvay, A., Rácz, I., Marton, S.: Application of dynamic surface tension and contact angle measurements in preformulation studies; Semmelweis Tudományos Fórum, Budapest, 1998 X. Budavári, Z., Balogh, E., Rácz, I., Marton, S.: Determination of glutamic acid by GC-MS analysis; Semmelweis Tudományos Fórum, Budapest, 1998 XI. Budavári, Z., Zelkó, R., Csóka, G., Fekete, R., Farkas, E., Antal, I., Rácz, I., Marton S.: Preformulation Study of Tablets Containing Vitamin B6, B12 and Folic Acid; The 6 th European Congress of Pharmaceutical Sciences, Budapest, 2000 XII. Farkas, E., Zelkó, R., Horányi, T., Fekete, R., Csóka, G., Antal, I., Budavári, Z., Rácz, I., Marton, S.: Drug Release Examination of Liquid Crystalline Gels in Relation to the Structure and Mechanical Properties; The 6 th European Congress of Pharmaceutical Sciences, Budapest, 2000 iv

XIII. Fekete, R., Antal, I., Farkas, E., Csóka, G., Zelkó, R., Budavári, Z., Rácz, I., Marton, S.: Application of Near Infrared Spectroscopy for the Determination of Coating Thickness; The 6 th European Congress of Pharmaceutical Sciences, Budapest, 2000 v

TARTALOMJEGYZÉK A. BEVEZETÉS 1 B. CÉLKITŰZÉSEK 2 C. IRODALMI HÁTTÉR 3 C.1. A HOMOCISZTEIN JELENTŐSÉGE A FIZIOLÓGIÁS 3 FOLYAMATOKBAN C.1.1. Homocisztein, tromboembólia és arterioszklerózis 3 C.1.2. A homocisztein metabolizmusa 5 C.1.3. Homocisztein előfordulása a plazmában és a vizeletben 7 egészséges humán egyedekben C.1.4. Mintavétel és analitikai módszerek 9 C.1.5. A vérplazma homocisztein szintjét befolyásoló hatóanyagok 11 C.1.6. A homocisztein metabolizmusát befolyásoló vitaminok 14 C.1.6.1. Vitaminok 14 C.1.6.2. Folsav 16 C.1.6.3. B 12 -vitamin 17 C.1.6.4. B 6 -vitamin 18 C.2. FOLSAV, B 6 -, B 12 -VITAMINOK FELSZÍVÓDÁSA 19 C.2.1. A folsav felszívódása 19 C.2.2. A B 6 -vitamin felszívódása 20 C.2.3. A B 12 -vitamin felszívódása 20 C.3. KÜLÖNBÖZŐ VITAMINOK ÉS ÖSSZETÉTELEIK 22 HOMOCISZTEIN-SZINT CSÖKKENTŐ HATÁSA C.3.1. Randomizált kontroll és betegcsoportok kiválasztása 23 C.3.2. Klinikai vizsgálatok eredményei 24 C.3.3. Eltérő mennyiségű folsav adagolások, és hatékonyságuk a vér 29 homociszteinszint csökkentésére C.3.4. A folsavval együtt adagolt B 12 - és B 6 -vitamin hatásai 29 C.3.5. Összefoglalás 30 vi

C.4. FOLSAV, B 6 -, B 12 -VITAMIN TARTALMÚ KÉSZÍTMÉNYEK 32 FORMULÁLÁSI LEHETŐSÉGEI C.4.1 Hatástani szempontok 32 C.4.2. Gyógyszertechnológiai szempontok 33 C.5. SZILÁRD GYÓGYSZERKÉSZÍTMÉNYEK 34 STABILITÁSVIZSGÁLATA C.5.1. Szilárd gyógyszerformák stabilitási egyensúlya 35 C.5.2. A bomlássebességi állandó és lejárati idő meghatározása 36 C.6. PRÉSELÉSI GÖRBÉK ELEMZÉSE HECKEL MÓDSZERREL 37 D. MÓDSZEREK 40 D.1. ANYAGOK, ESZKÖZÖK 40 D.1.1. Hatóanyagok 40 D.1.1.1. A hatóanyagok fizikai tulajdonságai 42 D.1.1.2. A hatóanyagok fizikaikémiai jellemzői 45 D.1.1.3. Kompatibilitási adatok 47 D.1.1.4. Stabilitási jellemzők 47 D.1.2. Segédanyagok szerkezete és tulajdonságai 49 D.1.2.1. Közvetlen tablettázási segédanyagok 49 D.1.2.1.1 Közvetlen tablettázási segédanyagok fizikai tulajdonságai 50 D.1.2.2. Granulátumok előállításához, tablettázáshoz és bevonáshoz 53 felhasznált segédanyagok D.1.2.2.1. Granulátum előállításához használt segédanyagok 53 D.1.2.2.2. Bevonáshoz és tablettázáshoz felhasznált segédanyagok 53 D.1.2.3. A készítmények vizsgálatához alkalmazott vegyszerek és 54 reagensek D.1.3. Készülékek, eszközök 54 D.2. GYÓGYSZERTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK 56 D.2.1. Minták előállításának módszerei 56 D.2.1.1. Ható- és segédanyagok fizikai keverékeinek elkészítése 56 D.2.1.2. Ható- és segédanyag préselmények előállítása, tárolási 56 paraméterek D.2.1.3. Granulátumok előállítása 56 D.2.1.3.1. A granulátumok nedvességtartalmának meghatározása 57 vii

D.2.2. Tabletta-előállítás 57 D.2.2.1. A tabletták szilárdságának meghatározása 58 D.2.2.2. Tablettázás préselést szimuláló készülékkel 58 D.2.3. A tabletták fludizációs bevonása 58 D.2.4. Különböző fizikai keverékek és tabletták tárolása 59 D.3. AZ ELŐÁLLÍTOTT MINTÁK VIZSGÁLATÁRA ALKALMAZOTT 59 MÓDSZEREK D.3.1. Analitikai vizsgáló módszerek 59 D.3.1.1. Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) 59 D.3.1.1.1. Farmakonok kinyerése fizikai keverékekből és tablettákból 59 D.3.1.1.2. A készülék hatékonyságának ellenőrzése 60 D.3.1.2. Közeli infravörös spektrometria (NIR) 65 D.3.1.2.1. A készülék hatékonyságának ellenőrzése 65 D.3.1.3. Termoanalitikai módszerek 67 D.3.1.3.1. Differenciál termoanalitikai mérések 67 D.3.1.3.2. Differenciál szkenning kalorimetria 67 D.4. ANYAGÁTMENETI FOLYAMATOKAT VIZSGÁLÓ MÓDSZEREK 68 D.4.1. Farmakonok membrántranszport vizsgálata Sartorius 68 Resorptionsmodell készülékkel D.4.2. A farmakonok kioldódásának vizsgálata bevont és bevonatlan 71 tablettákból Sartorius Lösemodell készülékkel E. MEGBESZÉLÉS 74 E.1. PREFORMULÁCIÓS VIZSGÁLATOK EREDMÉNYEI 74 E.1.1. Termoanalitikai vizsgálatok eredményei 75 E.1.2. NIR vizsgálatok eredményei 81 E.1.3. HPLC vizsgálatok eredményei 82 E.2. PRÉSELÉSI VIZSGÁLATOK EREDMÉNYEI 84 E.3. HATÓANYAG-FELSZABADULÁS ÉS MEMBRÁNTRANSZPORT 89 VIZSGÁLATOK E.3.1. Hatóanyagok in vitro felszívódási tulajdonságai 89 E.3.2. Bevont és bevonatlan tabletták hatóanyagainak in vitro felszívódása 92 viii

E.4. STABILITÁSI VIZSGÁLATOK 94 E.5. ÖSSZEFOGLALÁS, ÚJ EREDMÉNYEK 99 F. KÖSZÖNETNYILVÁNITÁS 101 G. IRODALOMJEGYZÉK 102 ix

A. BEVEZETÉS Számos klinikai tanulmány bizonyítja, hogy a vér megemelkedett homocisztein-koncentrációja az okkluzív kardiovaszkuláris betegségek nagyobb kockázatával, valamint a folsav, a B 6 - és a B 12 -vitamin alacsonyabb vérplazmaszintjével jár együtt. Terápiás megoldást jelenthet a három vitamin megfelelő arányban és mennyiségben történő pótlása. Jelenleg a forgalomban levő vitaminkészítmények nem tartalmazzák a klinikai vizsgálatok során terápiás szempontból legjobbnak ítélt összetételt. Összetett vitaminkészítmények sokféle gyógyszerformában terjedtek el, ezen készítmények döntő része szilárd gyógyszerforma. Statisztikai adatok szerint az extravaszkuláris gyógyszerkészítmények között a tabletta gyógyszerforma teszi ki a jelenleg forgalmazott gyógyszerkészítmények 80%-át. Elterjedt képviselőjük a filmtabletta, amely jelenleg a piacon levő készítmények egyre nagyobb hányadát képezi. A vitaminkészítmények általánosságban egyedülállóan sok hatóanyagot tartalmaznak, amelyek különböző fizikai és kémiai tulajdonságokkal rendelkeznek. Ezen molekulák egymással és a jelenlevő segédanyagokkal is kölcsönhatásba léphetnek, ami a destabilizáló hatás mértékétől függően a hatóanyagok gyors bomlásához vezethet. A készítmény stabilitásán kívül igen fontos a megfelelően szabályozott hatóanyag-leadás és ezzel kapcsolatos hatékonyság, amelyek együtt meghatározzák a készítmény minőségét. A készítmény minősége mellett alapvető szempont a gyárthatóság, amelyet elsősorban a ható- és segédanyagok fizikai-kémiai tulajdonságai valamint a megfelelő gyártási technológia együttesen biztosítanak. 1

B. CÉLKITŰZÉSEK 1. A jelenleg rendelkezésre álló klinikai adatok alapján a vérplazma homocisztein-szintjét leghatékonyabban csökkentő folsav, B 12 és B 6 vitaminokat a terápiás célnak megfelelő arányban és mennyiségben tartalmazó összetett tabletta formulálása korszerű, közvetlen préselésre alkalmas tablettázási segédanyagok felhasználásával, 2. A tabletta megfelelő stabilitásának biztosítása kompatibilis korszerű segédanyag-rendszer kiválasztásával, valamint a tabletta öregedési folyamatának gátlása polimer filmbevonat alkalmazásával, 3. Az előállított tabletták in vitro hatóanyag-leadásának és abszorpciójának tanulmányozása, 4. Az in vitro membrántranszport vizsgálatok eredményei alapján a megfelelő biohasznosíthatóságot eredményező összetétel kiválasztása. 2

C. IRODALMI HÁTTÉR C.1. A HOMOCISZTEIN JELENTŐSÉGE A FIZIOLÓGIÁS FOLYAMATOKBAN A homociszteint 1932-ben fedezte fel De Vigneaud, mint a metionin demetilációjából keletkező terméket, a következő évben pedig tisztázták a homocisztein szerepét a transz-szulfurációs folyamatban [1]. 1962-ben Carson és Neil tanulmányozták és leírták két 4, illetve 6 éves mentálisan zavart testvérpárnál fellépő homociszteinémiát. Ugyanebben az időben Gerritsen és Waisman homociszteint mutatott ki veleszületett szellemileg elmaradott gyermekek vizeletéből. A betegeknél kimagaslóan magas arányban fordulnak elő a következő kórképek: trombózis, korai arterioszklerózis, szellemi fogyatékosság, homocisztein által kiváltott keringési zavar, szerepe van a szellemi folyamatokban és az epilepsziában is. 1974-ben feltárták a homocisztein teljes metabolizmusát, amely kibővítette a kutatásokat. A 80-as években jelentős előrelépés történt a homocisztein biológiai mintából való meghatározása terén, új eredményeket adott, mivel eddig úgy gondolták, csak az előzőekben említett betegeknél található a plazmában, illetve a szövetekben homocisztein. Jelentősen bővült azoknak a betegségeknek, valamint azok terápiájában felhasznált gyógyszereknek és egyéb környezeti tényezőknek a száma, amelyek kiváltó tényezői lehetnek a magas homocisztein-szint kialakulásának [2]. Azonban számos egészséges egyén szervezetében is találtak magas homocisztein szintet, amelyek később kóros elváltozásokhoz, betegségekhez vezethetnek. C.1.1. Homocisztein, tromboembólia és arterioszklerózis Az arterioszklerózis kialakulásában egyebek mellett 3 kéntartalmú aminósav is hozzájárul, a metionin, homocisztein-tiolakton és homociszteinsav, amelyek a májban, vörösvértestekben képződnek. Arterioszklerotikus (érelmeszesedés) plakkokat találtak nyulak aortájában és artériáiban homocisztein-tiolakton, metionin és homociszteinsav parenterális, illetve táplálékbevitellel történő adagolása során. Igen magas parenterális adagolásnál a 3

kísérleti állatok tüdőembóliában vagy tüdőinfarktusban pusztultak el. Ez nem figyelhető meg táplálékkal bevitt anyagoknál, valószínűleg a lassabb abszorpciós folyamatok miatt. B 6 -vitamin adagolásával (1 mg/ttkg/nap) végzetes kimenetelű tüdőembólia és infarktus nem alakult ki, bár az arterioszklerotikus plakkok megmaradtak. 12 heti vizsgálat eredményei mutatták, hogy a különböző kéntartalmú aminosavak és módosulataik jelentősebb mértékben károsították az érfalat, szklerotikus jellegük kiterjedtebb és jelentősebb, mint a kontrollcsoportnál, amelyet 2-szer annyi ideig tápláltak vajjal, koleszterinnel a kísérlet során [3]. A homocisztein metabolizmusának rendellenes működése során felgyorsulnak az arterioszklerotikus és értrombotikus folyamatok. Trombózis és embólia kialakulása, amely csak nagy dózisú parenterális bevitelnél figyelhető meg, valószínűleg a metioninhomocisztein-tiolakton termék kialakulásával magyarázható. Páviánoknál parenterális úton előidézett trombózis endotel sérülést és fibrózus (szálas) arterioszklerotikus lerakódásokat okozott, jelentősen csökkentette a vérlemezkék számát. Gyermekeknél magas homocisztein szintnél kialakuló trombózis, embólia során a vérlemezkék, amelyek aggregációs és véralvadási képessége normál értéket mutat, száma csökkent. A csökkenés oka visszavezethető a homociszteinben és vérlemezkékben gazdag vérplazma ADP (15 µm) hatására indukálódó kollagének (0,16 mg/ml) aggregációjára. A szerzők továbbá a homocisztein S-nitrozálásával S-nitrozo-homociszteint állítottak elő, amely vérplazmában való koncentrációjának emelésével az aggregációt teljesen visszaszorította [4]. Megfigyelték, hogy cisztation-β-szintetáz hiányos sejtkultúrákban a homociszteintiolakton megnövelte és tulajdonságaiban és felépítésében megváltoztatta az aggregált proteoglikán mátrixot. Az érbetegségek kialakulása során a homocisztein valószínűleg gátolja a keresztkötések kialakulását, az elasztin és kollagén szintézist. Csökkenti a prosztaglandin szintézist a vérlemezkékben és a vörösvértestekben. Toxikus hatását a homocisztein oxidációjából származó H 2 O 2, ΗΟ, O - 2 ionoknak tulajdonítják, amelyek károsítják az érfalat alkotó endotel sejteket [5, 6]. Szerepet játszhat a koleszterinészterek felhalmozódásában, hogy a homocisztein-tiolok redukált fémek jelenlétében oxidálják az LDL-t, aminek során annak szerkezete megváltozik és nem tud receptoriálisan kötődni [2]. 4

C.1.2. A homocisztein metabolizmusa A homocisztein az S-adenozil-metionin ciklusban (metionin szintézis) keletkezik. A C 1 -transzfertől (metil-transzfer) kapott metilcsoport B 12 -vitamin és metil-thfhomocisztein-metiltranszferáz jelenlétében metioninná (metil-homocisztein) alakul [6]. A metilált B 12 -vitamin metilálja a homociszteint, majd az N 5 -metil-thf újra metilálja a cobalamint [7, 8]. Kisebb mértékben, és főleg az emlősöknél, elterjedt másik úton cisztationná is alakul B 6 -vitamin, biológiailag aktív piridoxál-5-foszfát, szerin és cisztation-β-szintetáz kölcsönhatásából. Ez utóbbi folyamat irreverzibilis, a cisztation a későbbiekben már nem lehet a metionin prekurzora, mint a homocisztein az S-adenozilmetionin ciklusban [9]. A cisztation a cisztation-liáz által katalizált reakcióban ciszteinné, majd piridoxál-5-foszfát jelenlétében α-ketobutiráttá alakul. Ezt nevezik transz-szulfurációs útnak [10]. Ritkán a májban (kis mennyiségben, a vesében is) homocisztein metilálása betain, mint metildonor, N,N-dimetil-glicin betainhomocisztein metiltranszferáz jelenlétében is végbemegy. A metabolikus folyamatokban legjelentősebb és egyben a leggyorsabb metilálást a C 1 transzfer nyújtja. A folsav szerin-glicin átalakulás jelenlétében 5,10-metilén-THF-tá alakul, mely dihidrofoláttá timidilát szintetáz jelenlétében, illetve 5,10-metilén-THF-reduktáz kapcsolódásával N 5 -metil-thf tá alakul, amely az S-adenozil-metionin ciklusnak a metilcsoportot szolgáltatja. Izolált sejtkultúrákban megfigyelték, hogy a homocisztein biológiai felezési ideje intracellulárisan rövid, áramlása az extracelluláris tér felé gyors. A homocisztein intracelluláris koncentrációjának emelkedésével a kiáramlás fokozódik, csökkenésével lassul [2, 11]. A homocisztein eliminációjában tehát kimagasló szerepe van a folsavnak, mint köztes anyagcsere-terméke a C 1 -transzfernek és a B 12 -vitaminnak, amely a kapcsolatot jelenti a homocisztein metilációjában. Lényegesen kisebb, de nem elhanyagolható a B 6 - vitamin szerepe a transz-szulfurációs folyamatban. Az 1. ábra különböző irodalmakból összegyűjtött metabolikus folyamatok közötti összefüggéseket mutatja, különös tekintettel a koenzimek jelentőségére [2, 6, 7, 8, 9, 11, 12]. 5

Lizin -CH3 (aktív) MT 2+ Fe, C-vitamin Piridoxál-5 -foszfát Glicin S-Adenozilmetionin S-Adenozillhomocisztein SA Adenozin Mg2+ ATP HO 2 Foszfatidil-kolin Kolin Betainaldehid Metionin (CH -homocisztein) 3 Homocisztein B 6 Cisztation -CH3 Szerin CS MH 12 DHF DR Folát dump dtmp TS 5 N -CH 3-THF (5-metil-THF) Szerin B 6 5,10-metilén-THF MR Glicin 5,10-metenil- THF 5-formil-THF (Leucovorin) 10-formil- THF 6 Karnitin 2+ Fe, C-vitamin Betain aldehid dehidrogenáz Pantetein CAMP Betain BH N,N-dimetilglicin Glicin B 6 Szerin Homocisztein Metionin Homoszerin CL CS MT SA CL BH Cisztation-β-szintetáz Metiltranszferáz S-Adenozilhomocisztein hidroláz Cisztation-γ liáz Betain-Homocisztein-metiltranszferáz Koenzim A B 6 B 6 Cisztein SO 4 2- MR DR 5,10-metilén-THF reduktáz Dihidrofolát-reduktáz Pantoténsav Cisztamin CAMP Taurin B 6 Más aciklikus vegyületek (méregtelenítés) TS MH Timidilát-szintetáz Metil-THF-homocisztein-metiltranszferáz 1. ábra Koenzimek szerepe a homocisztein metabolizációjában 6

C.1.3. Homocisztein előfordulása a plazmában és a vizeletben, egészséges humán egyedekben Sokáig azt gondolták, hogy a homocisztein normál körülmények között nincs jelen a plazmában, szövetekben és a vizeletben, mivel nem álltak rendelkezésre megfelelő érzékenységű aminosav analizáló berendezések. Először 1978-ban Gupa és Wilcken találták meg normál körülmények között a vérben a homocisztein-cisztein összetett diszulfidot, amely kötést savval szakították fel (amely a 2. ábrán dupla keretes területtel van jelölve) [13]. Mudd és Poole elsőként állapították meg, hogy egészséges férfiak esetében 3,3 ± 0,8 µg/l, nők esetében pedig 2,4 ± 0,7 µg/l értéknél nem magasabb a homocisztein szint [14]. Kang demonstrálta először, hogy a homocisztein proteinekkel kötődik a plazmában [15]. A plazmában a fő homocisztein hordozó az albumin. További vizsgálatok, amelyeket először patkányokon, majd nagyszámú humán csoporton végeztek, azt mutatták, hogy a plazmakötődés során a cisztein nem válik le a homociszteinről. A meglehetősen jó kötődő képességet szintén leírták még 167 szérum mintában 17 betegnél. Megfigyelték, hogy a homocisztein nagy része (78 %) alacsony koncentrációnál kötődik, ami azt mutatja, hogy heterogén populációknál a plazmában a kötés telíthető. Ezzel szemben a cisztein kötődésnél telíthetőséget nem tapasztaltak. Úgy tűnik bonyolult kapcsolat van a szabad homocisztein, cisztein és plazmafehérjék között, ami azt sugallja, hogy a cisztein jelentős szerepet játszik a szérum homocisztein eloszlásában. 7

NH 2 NH 2 NH 2 NH 2 COOH COOH COOH COOH S S protein Homocisztein-protein diszufid S S H 2 N COOH Homocisztein cisztein diszulfid SH Homocisztein S S HOOC NH 2 Dimer homocisztein Teljes homocisztein Savoldékony homocisztein NH 2 O S Homocisztein-tiolakton 2. ábra Feltételezett vázlat a homocisztein dinamikusan változó típusairól a vérplazmában [2] Több publikáció foglalkozik a homociszteinszint nemtől való függésétől. Az értéke férfiaknál magasabb, bár jelentősen befolyásolja az életkor is. Kang megállapította, hogy nőknél 50 év felett jelentősen növekedett a plazma teljes homocisztein szintje. Mások különbséget találtak post- és pre-klimaxos nőknél, de az értékek jelentős eltérést nem mutattak [6, 16]. A homocisztein elsődlegesen előforduló formája egészséges emberekben ma még ismeretlen. 30 évvel ezelőtt Perry bemutatta magas homocisztein szinttel rendelkező betegeken, hogy in vivo a homocisztein jelentős része redukált formában létezhet [17]. Frissen vett vért reagáltatta jód-ecetsavval, amelynek következtében egy stabil S- karboximetil-homocisztein módosulat keletkezett. Ez a megfigyelés azt sugallja, hogy a homocisztein egy része élettani körülmények között szabad tiol formában keringhet a vérben [2]. Frissen nyert plazmában a homocisztein diszulfidkötésben, nyomokban tiol formában és jelentős részben szérum albuminnal kötve található meg. A plazmában a fehérje kötésben levő homocisztein hányad sav hozzáadására kicsapódik, a homocisztein diszulfid-forma, homocisztein és maradványok oldatban maradnak. Az 8

utóbbiak a szabad homocisztein állományhoz tartoznak. A szabad homociszteinállományt tovább vizsgálva megfigyelték, hogy magasabb hőmérsékleten előkészített plazmában a szabad homocisztein azonnal kötést létesít a plazmafehérjével, míg több hétig 20 C-on tárolva lassabban, de itt is teljes mértékben kialakul a kötődés, szabad homocisztein csak nyomokban található. A homocisztein vizeletből történő analízisét emberből és kísérleti állatokból a közelmúltban végezték el [18-22]. A homocisztein renális clearence értéke 3,5 10 µmol / 24 h, a kreatinin clearence 0,3 %-a, amely a metilációs ciklus 1:1000 része emberben. Ennél fogva a homocisztein kiválasztása (főleg nőknél) igen kis hányada a teljes homocisztein szintnek. C.1.4. Mintavétel és analitikai módszerek Mivel meglehetősen sok előfordulási formája létezik a homociszteinnek (fehérje, diszulfidkötés), amelyek eloszlása nem életkorfüggő, így a minta tárolása a származékképződés miatt nehezen oldható meg. A pontos meghatározáshoz gyors mintavétel szükséges. Gyorsan preparált plazma is kevesebb, mint 10 20 % -át tartalmazza a vérszérum homocisztein szintnek. Ezt az indokolja, hogy szobahőmérsékleten a vörösvértesteknek lassú homociszteinleadása van a vérbe [2, 10]. Szobahőmérsékleten történő, hosszabb, 4 órás inkubáció után a vérszérum homocisztein szintje 35 %-kal, 24 óra elteltével 70 %-kal emelkedik. Ubbink szerint ez a növekedés akár 188 %, Anderson szerint 175 % is lehet [10]. A sejtek homocisztein leadása jég hozzáadásával retardizálható [2], 4 C-on minimálisra csökken [10], 0,5 óra elteltével a leadás megszűnik. Előkészítés során a mintákat gyorsan lehűtik, savval kezelik, így a minta 20 C-on hónapokig tárolható marad. Igen sok vizsgálati eljárást dolgoztak ki a homocisztein szint meghatározására: a leggyakrabban HPLC módszert [11, 19, 21, 23], újabban pedig nagyobb érzékenység és szelektivítás érdekében GC-MS eljárást [20], és immunoenzimatikus vizsgálatokat alkalmaznak. HPLC vizsgálat során, klinikai laboratóriumokban a homociszteinnek származékát állítják elő tiol specifikus SBD-F (ammónium-7-fluorobenzol-2-oxa-1,3-diazol-4- szulfonát) segítségével. A származékképzés során hatékony, stabil származék 9

képeződik, amely meglehetősen érzékeny a kromatográfiás vizsgálatnál, ellentétben az elterjedt monobromidos származékképzéshez képest. Alapoldatok: NaBH 4 (3 mol/l) + 0,1 M NaOH: DMSO (dimetil-szulfoxid) = 2: 1 4 C-on tárolva Származékképző oldat: 1 mg SBD-F 1 ml 0,2 mólos borsav (ph=9,5) és 4 mmol/l EDTA oldatban oldva Belső standard: merkaptopropionil oldat 7,5 µmol/l koncentrációban alkalmazva Minta előkészítés: 100 µl plazmát 50 µl belső standdarddal keverték, majd hozzáadtak 20 µl NaBH 4 ot Inkubálták 50 C-on 30 percet 100 µl 0,6 mol/l perklórsav és 1 mmol/l EDTA oldatát adták hozzá, centrifugálták 100 µl felülúszót összekevertek 200 µl 0,2 mol/l borátpufferrel (ph=9,5), 20 µl 2 mol/l NaOH és 50 µl SBD-F származékképzővel 60 C-on 1 óráig inkubálták, majd mérték HPLC készülékkel. Kromatográfiás körülmények: Fluorimetriás detektor, detektálás 385 és 515 nm-en 5 µm-es Beckman Ultrasphere OSD kolonna Mobil fázisok: 0,2 M Na-acetát (ph = 4) 2 % metanol tartalommal (A), és 0,2 M Na-acetát 30 % metanol tartalommal (B) A szerzők ezzel az eljárással normál és patológiás körülmények között vizsgálták a vérplazma homocisztein szintjét. A vizsgálat előnye a fluorimetriás detektor által nyújtott nagy érzékenység, de az összetett származékképzés és grádiens elúciós eljárás a vizsgálatot körülményessé teszi, nem alkalmas mindennapi rutinszerű vizsgálatok elvégzésére. Jobb és általánosíthatóbb megoldásnak tűnik a GC-MS eljárás. A homocisztein gázkromatográfiásan nem aktív. Származékképzéssel és a mintavételhez alkalmazott szilárd fázisú mikroextraktor (SPME) segítségével a mérés egyszerű és könnyen kivitelezhetővé válik [20]. 10

A szabad homocisztein kinyerése a diszulfidkötésből: 500 µl plazmát 500 µl desztillált vízben elkeverik, majd 100 µl dithiotheriol (12,5 % v/v) oldattal 30 percig 40 C-on inkubálják. Az inkubációs idő elteltével a fehérjéket 100 µl triklóecetsavval (72 % v/v) kicsapják és rázatják. 5 perc centrifugálás után a felülúszót összegyűjtik. Általános gázkromatográfiás eljárással: 400 µl propilalkohol és piridin 4:1 arányú oldatát 600 µl vizes mintához adják, utólagosan 50 µl kloroformot adnak még hozzá. A keveréket 3 percig szobahőmérsékleten rázatják, majd hozzáadnak 1 ml 1% kloroformot tartalmazó kloroformot. A származékot 5 percig centrifugálják és 1 ml szerves fázist öntenek a reakcióedénybe. Az oldatot nitrogén atmoszféra alatt bepárolják, majd a beszáradt mintához 100 µl 1 % kloroformot tartalmazó oldatot adnak. 2 µl mintát injektálnak mérésenként. SPME módszerrel: 400 µl propilalkohol és piridin 4:1 arányú oldatát 600 µl vizes mintához adják, utólagosan 50 µl kloroformot adnak még hozzá. A keveréket 3 percig szobahőmérsékleten rázatják. 2 ml desztillált vizet adnak hozzá. Ebből az oldatból veszi az SPME adagoló vékony szála a mintát, amiről későbbiekben, az adagolóban (inlet) válik szabaddá a minta. A minta összetevőit szelektív ion módszerrel (SIM) vizsgálták, metioninnál m/z: 61, 129, 189, ciszteinnél m/z: 74, 146, 220, homociszteinnél m/z: 56, 128, 189 ionizációs detektor használatával [20]. C.1.5. A vérplazma homocisztein-szintjét befolyásoló hatóanyagok Folsav: Folsav hiányban szenvedő betegeknél megfelelően nagy dózisban, orálisan adagolt folsav pár napon belül a vérplazma homocisztein szintjét jelentősen csökkenteni képes [24-27]. Csökkent veseműködés, illetve veseátültetés után folsavpótlással a betegek homocisztein szintje 2 4 héten belül jelentősen csökkent [28]. Ugyanezt figyelték meg érbetegségben szenvedő betegek folsavpótlása esetében is. B 6 - és B 12 - vitaminok külön-külön adagolása során azonban homocisztein-szint csökkentő hatást nem találtak [2]. Brattström állapította meg először, hogy azok a betegek, akik nem folsavhiányból adódóan rendelkeznek magas homocisztein szinttel, eredményesen kezelhetők további folsavpótlással. Napi 5 mg folsavpótlással 14 nap alatt a homociszteinszint megközelítőleg a felére (52 %) csökkent. A homocisztein 11

metabolizmusában résztvevő többi aminosav mennyisége csak kis mértékben csökkent. Az előzőkhöz hasonlóan B 6 - és B 12 -vitaminokat külön-külön hatástalannak találták. A folsav homociszteinszint csökkentő hatása valószínűleg az intracelluláris metabolikus folyamatok sebességének növelésében nyilvánul meg. A folsav megnöveli az 5-metil-THF képződését, amely több metilcsoportot képes adni a metioninszintézis számára. Valószínűleg ennek hatására növekszik a transzmetilációs folyamat, amelyet tömeghatásnak neveznek. Megerősíti a feltételezést, hogy folsavadagolás után a sejtek szerintartalma csökken, amely részt vesz az 5-metil-THF on keresztül a metioninszintézisben. Összefoglalva elmondható, hogy a homociszteinémia és az arterioszklerotikus érbetegségek kialakulásának csökkentésére a folsav megfelelő farmakológiai beavatkozásnak tűnik, mivel nagyon kevés, pl. csalánkiütés, mellékhatással rendelkezik. Metotrexát: Metotrexát egy folsavantagonista, amelyet a citosztatikus kemoterápiában, akut leukémiában, sok más tumoros megbetegedésben és napjainkban, kis dózisban pszoriázisban, reumatoid artritiszben gyakran használnak. A hatóanyag intracellulárisan metabolizálódik poliglutamáttá miközben gátolja a dihidrofolát enzimet, mely a DHF THF reakciót katalizálja. A metotrexát ezáltal csökkenti a sejt folsavtartalmát és még sok más folyamatot, mint pl.: timidilát-szintetáz működést, mely a DNS szintézishez szükséges. Különösen jól megfigyelhető a homociszteinszint emelkedés a vérplazmában és vizeletben daganatos betegeknél kemoterápiás infúzió adásakor. A megemelkedett homociszteinszint hosszabb kezelés során érelváltozásokat, trombózist okozhat. Nitrogén-oxid: Az érzéstelenítés során alkalmazott, NO képes kölcsönhatásba kerülni a B 12 -vitamin kobalt ionjával. A kölcsönhatás eredménye, hogy a NO oxidálja a Co(I)-et Co(II)-vé, mely módosult B 12 -vitamin már nem képes a C 1 -transzfertől kapott metil csoport fogadására. Kezdetben a kötődés lassú, 2-órán belül 50 %-ot ér el. A metionin redukciója figyelhető meg 8 ill. 24 órás kezelés alatt. A homocisztein igen jelentős emelkedése figyelhető meg a vérplazmában és vizeletben egyaránt. 6-Azauridin-triacetát: Pszoriázisellenes szerként kezdték alkalmazni az 1970-es években, az FDA azonban 1976-ban betiltotta, mert kapcsolatot talált a terápia és a kezelés alatt gyakran kialakult tromboembóliák között. A tromboembólia kevesebb, mint 6 hét alatt kialakult, amely gyakran vénás és artériás nem kívánt hatásokkal társult. 12

A hatóanyag megnövelte a vizeletbe kiválasztott aminosavak mennyiségét, többek között a homocisztein mennyiségét. Közleményekben leírták, a tromboembólia oka valószínűleg a magas homociszteinszint volt, mely a B 6 -vitamin biológiailag aktív piridoxál-5-foszfátjával lépett kölcsönhatásba, annak inaktiválásával. Penicillamin: Metabolikusan stabil cisztein analóg (D-ß,ß-dimethylcysteine), amelyet nehézfém mérgezés során alkalmaztak, Wilson betegségben. Az alkalmazott penicillamin erőteljesen csökkentette a vér szabad és fehérjekötésben levő homocisztein-diszulfid szintjét homociszteinuriában. A homocisztein albumin csökkenés 50 % volt reumatoid artritiszben szenvedő betegeknél. Diszulfidkötésben levő homociszteint nem találtak a plazmában penicillaminnal való kezelés után, amely a jelentős renális úton történő kiválasztásra utal. Görcsgátlók (antikonvulzív szerek): Az ide sorolható anyagok általános folsavhiányt képesek előidézni. Legjelentősebb közöttük a fenitoin, de nem elhanyagolható a fenobarbitál, pirimidon, karbamazepin, és a valproát. Folsavantagonista hatásuk szorosan összefügg görcsoldó hatásukkal, amelyet a folsavpótlás nem befolyásol. Hatásuk a folsav abszorpciójának a vékonybélből és májban történő metabolizációjának gátlásán érvényesül. A terápia során a májban a metilén tetrahidrofolát-reduktáz gátlásával nem keletkezik biológiailag aktív 5-metil- THF, ennek eredménye a megemelkedett homocisztein szint. Az I. táblázat összefoglalja az előzőekben tárgyalt hatóanyagok vérplazma homocisztein-szintjét befolyásoló hatását. 13

I. táblázat A vérplazma homocisztein-szintet befolyásoló hatóanyagok egészséges Hatóanyagok egyéneknél [2] Feltételezett mechanizmus Megjegyzés Homociszteinszintet befolyásoló hatás folsav csökkenti megnövelt remetiláció hatékonyan csökkenti a folsavhiányt metotrexát növeli 5-metil-THF elfogyása 10 mg 13 mg a hatékony dózis nitrogén-oxid növeli B 12 inaktivációja 1 órán belül észrevehető változás 6-azauridin- növeli B 6 -antagonista triacetát 2-Deoxicoformicin csökkenti indirekt inaktiválása az AdoHcy hidratáznak D-Penicillamin csökkenti összezavarodott diszulfid hidak Görcsgátlók (fenitoin, karbamazepin) növeli képződése nem kívánt kölcsönhatás a folát metabolizmusban normál és emelkedett homocisztein szint csökkentés C.1.6. C.1.6.1. A homocisztein metabolizmusát befolyásoló vitaminok Vitaminok A vitaminok a táplálék útján kis mennyiségben a szervezetbe jutó szerves anyagok, amelyek jelenléte nélkülözhetetlen az emlős szervezetek számára fontos élettani folyamatok fenntartására. Vitaminok a szervezetben lejátszódó biokémiai folyamatok katalizátorainak, enzimeknek a koenzimjei. 14

A szervezet nem képes a vitaminok előállítására, alapvetően fontos felvételük a napi táplálkozás során. 13 alapvető, nélkülözhetetlen vitamin van. A, C, D, E, K és nyolc B-vitamin féleség, thiamin (B 1 ), riboflavin (B 2 ), niacin (B 3 ), folsav (B 4 ), biotin (B 7 -vitamin, H-vitamin), pantoténsav (B 5 ), piridoxin (B 6 ) és kobalamin (B 12 ). Legtöbbjük egészen kis mennyiségben fontos a szervezet számára, melyek különböző élelmiszerekben megtalálhatók. A vitaminokat két csoportba sorolják: vízben oldódó és zsírban oldódó vitaminokra. Kiegyensúlyozott táplálkozás során a szervezet megkapja a szükséges vitaminmennyiséget. Nem megfelelő vitaminfelvétel során idővel megjelennek a vitaminhiány tünetei. Ilyenkor vitaminpótlás, és az okozott tünetek gyógyítása a megoldás. Az élelmiszerekben ezen anyagok mind megtalálhatók. Hiányos táplálkozás esetében, fogyókúra, alkoholizmus, szélsőséges táplálkozás mint pl. vegetáriánusok, a szervezet vitamintartalékai elsősorban a vízoldékony vitaminok kimerülnek és kialakul a vitaminhiány okozta betegség. Más, nem vitaminhiányból bekövetkezett betegségekben a vitaminokat gyógyító hatásukért is alkalmazzák: megfázás elkerülésére, enyhe influenzás megbetegedésekben nagyobb 0,5-1 g/napi C-vitamin adagolásával, más vitaminokat szívinfarktus, érelmeszesedés és rák prevenciójaként. D-vitamint, amely a szervezetben is képes termelődni, napfény hatására a bőrben, alkalmaznak csontritkulás ellen, niacint lipidcsökkentő hatása miatt, A-vitamin különböző származékait (retinoidok) többek között a faggyúmirigy és szőrtüszőgyulladás ellen. A vitamin-túladagolás átlagos táplálkozás mellett nem jön létre, de vitamintartalmú készítmények túladagolásával napi többszöri dózis adása, orvos által előírt periódus lehetséges. A vitaminok a szervezetben aránylag sokáig képesek raktározódni, bár az eltérés vitaminonként igen jelentős. A C-vitamin felezési ideje 382 óra, folsav 432±55,2 óra, B 12 -vitamin 123 óra, D-vitamin 960 óra, A-vitamin 9,1 óra [149]. Amennyiben a vitaminok leginkább a zsíroldékonyak felhalmozódnak a szervezetben, kifejtik nem kívánt mellékhatásaikat, melyek sokszor igen súlyosak is lehetnek. Például: a D- vitamin nagymennyiségű kalciumot épít be az érfalakba, s így az erek rugalmatlanná válnak, a C-vitamin pedig vesekőképződést okozhat. 15

Napjainkban azonban egyre inkább az érdeklődés középpontjába kerülnek a vitaminok és jelentős kutatási munka folyik molekuláris biológiai szerepük tisztázására, mint pl.: a szervezet elöregedése, az érelmeszesedés, daganatos betegségek. A jelenlegi vitaminkutatás főbb irányai: Fizikaikémiai tulajdonságok vizsgálata Vitaminok okozta betegségek tisztázása Vitamin - túladagolás következményeinek felismerése Természetes forrásaik meghatározása Széleskörű vizsgálatok igazolták, hogy az érelmeszesedéses folyamatok, tüdőembólia és szívinfarktus kialakulásának közel egyharmadáért egy testazonos aminosav, a homocisztein felelős. Jó megoldásnak tűnik a B vitaminok egy csoportjának alkalmazása (folsav, B 6 -, B 12 -vitaminok), amely jelentős mértékben csökkenti a vér homocisztein koncentrációját [29, 30]. C.1.6.2. Folsav Más elnevezései: folacin, M-vitamin, B 4 -vitamin. Esszenciális a C 1 -transzfer számára és sok más metabolikus folyamathoz, mint a purin és pirimidinszintézishez [31]. Ebből adódóan nélkülözhetetlen a nukleinsavszintézisben, növekedésben. Szerepet játszik a csontvelőben a vörösvértestképzésben, az idegrendszer fejlődésében és normális működésében [30]. Legjelentősebb természetes forrásai a zöld levelekkel rendelkező zöldségfélék, gombafélék és a máj, gyümölcsök (narancs), hüvelyesek (borsó), tojás sárga (lásd 3. ábra). Ajánlott napi vitaminbevitel (RDI): 1 éves korig 50 µg, 1-3 éves korig 70 µg, 4-6 éves korig 100 µg, 7-10 éves korig 150 µg, 11 éves kor fölött 200 µg. Terhesség és szoptatás során ez 60-100 µg-mal növelhető [30]. Számos publikáció számol be arról, hogy időskorban is szükséges a folsav pótlása [18, 32-34]. Folsav külön adagolása gyakori terhességben, koraszülötteknél, alacsony születési súly esetén. Ajánlatos folsav szedése hemodialízissel kezelt betegeknél, 16

vérszegénységben, pszoriázisban, a gasztrointesztinális rendszer rossz vitaminabszorpciójakor, alkoholizmus során, májbetegeknél. Fontos a folsavbevitel alkoholistáknál és olyan gyógyszerek szedése mellett, amelyek csökkentik a folsav hatékonyságát, az abszorpció és metabolizmus befolyásolásával, pl.: antiepileptikumok, antimaláriás szerek, ösztrogéntartalmú fogamzásgátlók, kortikoszteroidok és szulfonamidok mellé. Ajánlják még olyan kismamáknak, ahol fenn áll a nyitott hátgerinccel születés (spina bifida) veszélye. Hiánybetegség kialakulásával alacsony vörösvértestszámmal járó vérszegénység lép fel, amelyet folsav és B 12 -vitamin együttes adagolásával kezelnek. Legfőbb tünetei: fáradékonyság, étvágytalanság, hányinger, hasmenés, hajhullás. Nagy mennyiségben történő túladagolás során sem vettek észre toxicitást. C.1.6.3. B 12 -vitamin Egyes származékai: kobalamin, cianokobalamin, hidroxokobalamin, stb. Két enzimatikus folyamatban vesz részt a szervezetben: a timidilát-szintézisben (DNS szintézis) és a metionin-szintézisben, ahol C 1 -transzfer S-adenozil-metionin ciklus közötti metilszállításban vesz részt [35]. A folsavhoz hasonlóan szintén alapvető szerepe van a vöröscsontvelőben a vörösvértest-szintézis során, fontos a megfelelő idegrendszeri működéshez [30]. Az emberi vérszérum nem tartalmaz szabad kobalamint, csak annak származékait (hidroximetil-5-deoxiadenozil-kobalamin). Legfontosabb természetes forrásai állati eredetűek, mint a máj. Jelenleg csak egy tengeri moszat fajból sikerült kimutatni, zöldségfélékben nem található meg. A B 12 -vitamin már egészen kicsiny mennyiségben is hatékony. Napi ajánlott bevitel (RDI) 6 hónapos korig 0,3 µg, 7 hónaptól 1 éves korig 0,4 µg, 1-3 éves korig 0,5 µg, 4-6 éves korig 0,8 µg, 7-10 éves korig 1 µg, 11-14 éves korig 1,2 µg, 15 éves kor felett 1,5 µg, terhesség alatt 2 µg. A táplálék általában több B 12 -vitamint tartalmaz a kívántnál, így hiánybetegség csak rossz gasztrointesztinális abszorpció vagy tartós éhezés során alakul ki. Kialakulásához több hónap kell, a máj nagy készleteket képes tárolni. Előfordul azonban vitaminhiány olyan vegetáriánusok körében, akik mindenféle állati terméket mellőznek, mint pl. a tojást. Ilyenkor fontos a napi B 12 -vitamin pótlás. Hiányában 17

anémia pernicióza (vészes vérszegénység) alakulhat ki, amely az emésztőrendszerben egy úgynevezett intrinsic faktor csökkent termelődésére vezethető vissza. Hiányának tünetei az agy és gerincagy csökkent működése folytán emlékezetvesztés, zsibbadtságérzet a végtagokban, depresszió. Kezelése intravénás B 12 -vitamin adagolással felnőtteknek kezdetben hetente kétszer 1000 µg az első héten, majd havonta 100-200 µg, míg az anémia meg nem szűnik. Gyermekek kezelése napi 30-50 µg B 12 -vitamin adásával, vagy intrinsic faktor bevitelével oldható meg. B 12 -vitamin túladagolásánál még nem találkoztak toxikus tünetekkel, kivéve az intravénás adagolást követő allergiás reakciót. Más szerzők szerint a B 12 -vitamin túlzott mennyiségének következtében a vérplazma kálium tartalma leeshet, amely kardiális dekompenzációt okozhat [30]. C.1.6.4. B 6 -vitamin Egyéb elnevezései: piridoxin, piridoxin-hidroklorid. Nagyon sok biokémiai folyamatban vesz részt, mint koenzim. Alapvetően fontos a fehérjék, szénhidrátok lebontásában, a zsíranyagcserében, az izmokban és a májban raktározott szénhidrátok felszabadításában. Részt vesz a vörösvértestképzésben, az egészséges bőr kialakításában és az emésztésben. Szerepe fontos az idegrendszeri működésben és a hormonháztartásban is [30]. A B 6 -vitaminok csoportja foszforilált és nem foszforilált (piridoxin, piridoxál, piridoxamin) tagból áll, amelyek a szervezeten belüli biológiai aktivitást mutatnak és egymásba alakulnak. Bomlástermékük a 4-piridoxin sav, amely a vizelettel távozik, egészen kis mennyiségben található meg a vérplazmában és a szövetekben [36]. Napi ajánlott bevitel (RDI) születéstől 6 hónapos korig 0,2 mg, 7-9 hónapos korig 0,3 mg, 10 hónapostól 1 éves korig 0,4 mg, 1-3 éves korig 0,7 mg, 4-6 éves korig 0,9 mg, 7-10 éves korig fiúknak és 7-14 éves korig lányoknak 1 mg, 11-14 éves korig fiúknak 1,2 mg, 15-18 éves korig fiúknak 1,5 mg, 15 év felett lányoknak 1,2 mg és 19 év feletti férfiaknak 1,4 mg. A táplálék túlnyomó része tartalmazza a szükséges mennyiségű B 6 -vitamint, amely kis mértékben, a bélben baktériumok által is termelődik. Kiegészítő mennyiségre 18

szoptatós anyáknál és időskorban lehet szükség. További pótlásra szükség van rossz vitamin felszívódással rendelkező betegeknél, alkoholizmus során kialakult vitaminhiány esetében, és azoknál a betegeknél, akiket penicillaminnal, hidralazinnal kezeltek. Csökkenti a depressziót és hányingerérzetet, ösztrogéntartalmú fogamzásgátlók szedése után kialakult vitaminhiányt. Hiánytünetei: gyengeségérzet, ingerlékenység, idegesség, depresszió, bőrbetegségek, száj és nyelvgyulladás, repedezett ajkak. Kezelése függ a hiány mértékétől, és a kialakult tünetek súlyosságától. Általánosságban napi 5-25 mg B 6 - vitamint adnak orálisan 3 hétig, majd ezt követően 1,5-2,5 mg-ot multivitaminkészítményekben. Genetikai rendellenesség következtében kialakult betegségeknél gyermekkorban 2-15 mg/nap, felnőttkorban 10-250 mg/nap a kívánt mennyiség. Napi 50 mg B 6 -vitamin adagolásával a menstruációs ciklus 10. napjától a következő ciklus 3. napjáig alkalmazva enyhíteni lehet a premenstruációs szindrómát. Hosszú időn keresztül napi több mint 500 mg B 6 -vitamin adásával túladagolást lehet elérni, amely idegrendszeri károsodáshoz, kiegyensúlyozatlansághoz vezet, zsibbadást és inkordinációt okoz a kezekben. C.2. C.2.1. FOLSAV, B 6 -, B 12 -VITAMINOK FELSZÍVÓDÁSA A folsav felszívódása A folsav nemionos diffúzióval szívódik fel az emésztőrendszerből a vékonybél kezdeti szakaszán (jejunum). A folsav transzport ph optimuma 5,5-6,0 közé esik, normál vérszérum szintje 3-14 ng/ml [37]. Tanulmányozták a folsav jejunumból történő felszívódását és megállapították, hogy a preparált bélfalsejtek ph=5,9 en vették fel a legtöbb folsavat, jelentősen többet, mint ph=6,9-en [38]. Vizsgálták a folsav felszívódását antacid készítmények jelenlétében [39]. A folsav felszívódását tríciummal jelzett pteroil-glutamáttal (folsav) figyelték meg 30 egyénen. Cimetidin és alumínium-, magnézium-tartalmú antacid készítmények a folsav felszívódását csökkentették. Az antacid készítmények ph=4 fölött (ph=7-en 75%-ban) kicsapták a folsavat. A vizsgálat mutatja, hogy kontrol csoporttal összehasonlítva Ranitidin alkalmazásával a folsav 19

felszívódásának mértéke csökkent. A folsav felszívódása 51,6±1,1% volt üres gyomorból, míg táplálék jelenlétében 50,2±1,2% volt. Cimetidin jelenlétében a felszívódás kismértékben változott. C.2.2. A B 6 -vitamin felszívódása A B 6 -vitamin abszorpciójával foglalkozó tanulmányok megállapították, a felszívódás nem telített, energianélküli passzív diffúzióval történik a vékonybél kezdeti szakaszán [40-42]. In vivo a felszívódás mértékét a vizeletben kiválasztott B 6 -vitamin mennyiségével, illetve izotóppal jelzett piridoxinnal mérték, in vitro abszorpciót preparált proximális jejunum vagy annak izolált sejtjeivel végezték. Megállapították, hogy a B 6 -vitamin felszívódása során a jejunum falában enzimatikus úton foszforilálódik. Feltételezhető, hogy számos enzim, mint a piridoxál-kináz részt vesz a folyamatban. Ebből kiindulva az in vitro vizsgálatok nehezen végezhetők el. Megállapították, hogy a B 6 -vitamin kezdeti felszívódása a bélfalon (serosal-mucosal felszívódás) gyors, elsőrendű kinetikát mutat. Többszöri dózis adagolása után a 30 45 perc elteltével a felszívódás mértéke a lumenből csökkent, ami a bélfalban található enzimműködés telítésével magyarázható [43]. C.2.3. A B 12 -vitamin felszívódása A B 12 -vitamin molekula méretéből adódóan a pórusokon keresztüli diffúzióra nem képes, felszívódása facilitált diffúzióval történik, de aktív transzportját is említik, amelynek helye az ileum terminális szakaszára tevődik [44, 45]. A B 12 -vitamin normál vérszérum szintje 220-940 pg/ml között van. Vészes vérszegénység esetén ez a szint alacsonyabb, mint 170 pg/ml [37]. Megfigyelték, hogy egyes daganateltávolító műtét során, amikor az ileum 50-70 cm-es szakaszát eltávolították, B 12 -vitamin hiányos állapot alakult ki [44]. Átlagosan 10% alattinak mérték a B 12 -vitamin felszívódást Schilling teszttel (vizelettel kiválasztott B 12 - vitamin meghatározása radioaktív módszerrel). Normál esetben 15,17±5 %, intrinsic 20

faktor nélkül az abszorpció mértéke (21 beteg 84%-a) 6,64±1,57% volt. Az ileum 50 cm-es eltávolításánál a vizsgált egyéneknél a felszívódás mértéke 6 % alatt volt. Megállapították, hogy a B 12 -vitamin a terminális ileum szakaszán intrinsic faktor segítségével tud csak felszívódni. A B 12 -vitamin abszorpciója és a végbél hossza között egyenes arányosság áll fenn. Egyes szerzők javasolják a plusz B 12 -vitamin bevitelét azoknál a betegeknél, ahol a terminális ileum szakasza több, mint 50 cm-rel csökkent. 1 évig az operáció után intramuszkuláris (100 µg/nap) kobalamin adagolását javasolják. Húgyúti kiválasztásának alapján vizsgálták a B 12 -vitamin abszorpcióját, ahol pankreatin és intrinsic-faktor adagolásával befolyásolták az felszívódás mértékét. Megállapították, hogy a B 12 -vitamin abszorpciója már 2 g pankreatin adagolással jelentősen növekszik, de csak pankreatin hiányban szenvedő betegeknél. A leghatékonyabb B 12 -vitamin abszorpciót B 12 -vitamin+pankreatin+intrinsic faktor együttes adagolása mellett érték el. Csekély mértékben nőtt a felszívódás a bélflóra túlnövekedésekor [46]. Jelentősen módosul a B 12 -vitamin felszívódása H 2 receptor antagonisták alkalmazása során. Az Omeprazol egy benzimidazol származék, amely hatásos, hosszan tartó inhibitora a gyomor sósavelválasztásnak. Megfigyelték, hogy 3-4 éves Omeprazol szedés csökkentette a vér cianokobalamin szintjét. A gyógyszert szedő betegeknél hematológiai rendellenességeket figyeltek meg, de a vér B 12 -vitamin szintjét nem vizsgálták. A cianokobalamin vízoldékony vitamin, amelyet meghatározott, bélflóra állományhoz tartozó baktériumokban lehet megtalálni, szilárdan kötődik a táplálékban található fehérjékhez. A gyomorban található sósav és pepszinek által a B 12 -vitamin felszabadul a kötés alól és kötődik egy nyálból származó R-proteinnel. A hasnyálmirigy enzimeinek hatására az R-protein módosul, a cianokobalamin gyorsan átalakul, komplexet képez az intrinsic faktorral, amely megvédi a proteolitikus enzimekkel szemben. Az intrinsic-faktor-cianokobalamin komplex a jejunum felső szakaszában alakul ki, komplex formáját a disztális jejunumban specifikus receptorokon való felszívódásáig megőrzi. Az Omeprazol gátolja a specifikus gyomorfal perietális sejtjeiben található H+, K+, ATP proton pumpákat. A hosszan tartó Omeprazol kezelés a következőképpen járulhat hozzá a B 12 -vitamin hiányhoz: 21