DNS molekulák elválasztása agaróz gélelektroforézissel és kapilláris elektroforézissel Gyakorlat helye: BIOMI Kft. Gödöllő, Szent-Györgyi A. u. 4. (Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont épülete) Gyakorlatvezető: Szántó-Egész Réka, Mohr Anita, A biológiai, biokémiai munkák során az elektroforézis az egyik leggyakrabban alkalmazott elválasztástechnikai módszer, mely során egyenáramú elektromos erőtérben, annak törvényszerűségei alapján megy végbe a töltéssel bíró molekuláknak az ellenkező polaritás irányába történő elmozdulása. Elmozdulásuk mértéke lehetőséget ad elválasztásukra, azonosításukra. A molekuláris biológiai munkák során elengedhetetlen, hogy információt kapjunk a mintában jelenlévő DNS fragmentumok méretéről, amelyhez a mindennapi gyakorlatban az agaróz gélelektroforézist alkalmazzuk. A DNS molekula szekvenciájának meghatározására a kapilláris elektroforézis nyújt megfelelő technikai lehetőséget. A gyakorlat célja, hogy megismerkedjenek ezen elválasztástechnikai módszerekkel DNS molekulákat tartalmazó minták vizsgálata esetén. Agaróz gélelektroforézis Az agaróz gélelektroforézis különböző makromolekulák méret vagy töltés szerinti elválasztására alkalmas. A gyakorlaton DNS fragmentek méret szerinti elválasztását fogjuk elvégezni. Az agaróz gél pufferből és agarózból tevődik össze. Az agar-agar (agaróz) egy tengeri vörös algából kivont poliszacharid, mely melegítés hatására feloldódik az elektroforézis pufferben. Az így kapott oldatot megfelelő formába öntjük, mely 32-40 C körüli hőmérsékletre hűlve megszilárdul, térhálós szerkezetet alkot oly módon, hogy a lineáris polimer szálak dupla helikális szerkezetbe rendeződnek, melyeket a jelen lévő vízmolekulák stabilizálnak, hidrogén-híd kötésekkel (1. ábra). 1. ábra: Az agaróz térhálós szerkezete
Szilárdulás után a puffertankba tesszük a gélt, ezután felvisszük a mintákat az erre a célra kialakított un. zsebekbe. A mintákat közvetlenül a betöltés előtt egy speciális töltő pufferrel kell összekeverni, mely rendszerint kétféle festékanyagot (ált. brómfenol-kéket és xiléncianolt), valamint glicerint tartalmazó vizes oldat. A nagy sűrűségű glicerin a mintákat a zsebek alján tartja, amíg a DNS bevándorol a gélbe, a két festék segítségével pedig megállapíthatjuk hol tart az elektroforézis. A brómfenolkék mobilitási tuljdonságai a legjobbak, ezért ez a sötétkék szín a futási frontot jelzi, míg a világosabb xilén cianol igen lassan halad a gélben így a futás legvégét mutatja meg. Ezután elektromos térbe helyezzük a gélt, melyben a DNS mivel semleges ph közelében negatív töltésű az anód (+) felé vándorol. A nagyobb méretű fragmentumok lassan, míg a rövid méretűek gyorsan haladnak a gélben így ezek vándorolnak legtávolabb a zsebektől. A DNS mozgási sebességét több faktor is befolyásolhatja, ezek a következők: A DNS mérete: Nagyobb molekulák lassabban mozognak, mint a kisebbek. Ez a nagyobb súrlódási ellenállással magyarázható, valamint azzal, hogy a nagyobb molekulák átjutása a gél pórusain nehezebb. Az agaróz koncentrációja: Ez határozza meg a gél sűrűségét és a pórusok méretét. (Általában 0,5-3% között). Agaróz mennyisége a gélben (% w/v) Elválasztási tartomány (lineáris, dsdns-re, kilobázispár) 1,0 0,5-7 1,5 0,2-3 2,0 0,1-2 A DNS szerkezete: Azonos molekulasúlyú gyűrűs, szuperhelikális gyűrűs, valamint lineáris DNS molekulák eltérő sebességgel vándorolnak agaróz gélben (2. ábra). 2. ábra: Különböző szerkezetű és méretű Nukleinsav molekulák képe agaróz gélben Elektroforézis puffer összetétele: A DNS elekrtoforetikus mobilitása függ az elektroforézis puffer összetételétől és ionerősségétől is. Ionok hiányában (pl. ha tévedésből valaki nem elektroforézis puffert használ a gél elkézítéséhez) az elektromos
vezetőképesség minimális és a DNS csak lassan, vagy egyáltalán nem mozog. Ha a puffer ionerőssége túl magas (pl. ha tévedésből valaki 10x töménységű elektroforézis puffert használ), a vezetőképesség nagyon nagy lesz, ami jelentős hőképződéssel jár. Legrosszabb esetben a gél megolvadhat, és a DNS denaturálódhat. A DNS láthatóvá tehető egy speciális fluoreszcens jelölő molekulával, mely interkalálódik a kettős szálú nukleinsav molekulákba és UV fénnyel gerjesztve látható fényt emittál (3.ábra). A talán leginkább elterjedt ilyen molekula az Etídium-Bromid (EtBr), mely pont e miatt a tulajdonsága miatt erősen mutagén, ezért újabban egyre inkább elterjednek a sokkal modernebb, egészségre kevésbé ártalmas dsdns festékek használata. A festéket kétféle módon alkalmazhatjuk: a gél utólagos festésével vagy közvetlenül gélöntéskor adjuk az elegyhez. 3. ábra: EtBr interkalálódása a dsdns molekulába. Az ábrán látható, hogy az EtBr beépülésekor eltorzítja a DNS cukor-foszfát gerincét, ezzel megváltoztatva annak számos tulajdonságát. A láthatóvá tett DNS fragmentumok méretét molekulasúly markerekhez történő viszonyítással határozhatjuk meg. A molekulasúly markerek egyszerre több, ismert méretű fragmentumokat tartalmaznak (5. ábra). Mivel a mobilitás fordítottan arányos a molekulasúly 10-es alapú logaritmusával, az ismeretlen fragmentumok méretét úgy határozhatjuk meg, ha vonalzó segítségével lemérjük az ismert méretű molekulasúly fragmentumok vándorlásának hosszát a zsebektől kezdődően, majd ennek 10-es alapú logaritmusát véve kalibrációs görbét készítünk. A görbe alapján a kérdéses fragmentum vándorlási hossszának ismeretében meghatározható a mérete. Az agaróz gélből a DNS fragmentek kinyerhetők és további molekuláris biológiai munkákhoz felhasználhatók. Gyakorlat menete Feladat: 1. Készítsen 1%-os agaróz gélt 2. Vigye fel a mintákat és a molekulasúly markert a gélre 3. Futtassa meg a gélt 4. Fotózza le a gélt
5. Elemezze az egyes minták futása során kapott képet, határozza meg a fragmentumok méretét. 6. Készítsen jegyzőkönyvet A gyakorlathoz szükséges anyagok, eszközök 1xTBE puffer (89mM Tris-Borát, 2mM EDTA) 6x loading puffer (10 mm Tris-HCl ph 7.6, 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mm EDTA) agaróz fluoreszcens gélfesték molekulasúly marker elektromos tápegység elektroforézis tank gélöntő forma gélöntő tálca fésű mikropipetta géldokumentáló rendszer vizsgálni kívánt minta A gyakorlat menete: 1. Állítsa össze a gélöntő tálcát. Illessze be a műanyag fésűt az öntőmintába. (4. ábra). (A megszilárdult gélben, a fésű eltávolításával létrejött mélyedésekbe un. zsebek kerül majd a minta.) 2. Erlenmeyer lombikba mérjen 0,6 g agarózt, adjon hozzá 60 ml 1xTBE puffert, mikrohullámú sütőben melegítse óvatosan, gyakran kevergetve, míg az agaróz teljesen felolvad. (ált. pár másodperc forralás szükséges) Ezután hűtse vissza kb. 60 C-ra, és adjon hozzá 6 µl fluoreszcens festéket, alaposan keverje össze. 3. Ezt követően óvatosan, buborék-mentesen öntse az agaróz oldatot az előkészített gélöntő tálcába. 4. 30-40 perc alatt az agaróz gél megszilárdul, ekkor nagyon óvatosan, hogy a minta felvitelére szolgáló zsebek ne sérüljenek, távolítsa el a fésűt. 5. Töltse fel az elektroforézis tankot (4. ábra) 1xTBE pufferrel, tegye bele a gélt a gélöntő tálcával együtt, úgy hogy a minta felvitelére szolgáló zsebek a katód (+) felé helyezkedjenek el, majd öntsön még a tartályba annyi puffert, hogy a gélt 1-2 mm magasan ellepje. 6. A kapott mintákból 5 mikrolitert pipettával keverjen össze 3 µl töltő pufferrel, majd az így előkészített mintákat egyenként óvatosan pipettázza a gélzsebekbe. (Minden mintához új hegyet használjon és vigyázzon, hogy a felvitelnél a minták ne keveredjenek!) SORREND FELJEGYZÉSE!! 7. Vigyen fel 2μl molekulasúly markert a minták után. A molekulasúly marker: 100 bp léptékű, amely 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 bp nagyságú DNS fragmenteket tartalmaz (5. ábra). 8. A puffertartályra helyezze rá a tetejét, és az elektromos vezetékekkel csatlakoztasa a tápegység kimeneteihez, kapcsolja be a tápegységet, és állítsa be 100 V-ra a
feszültséget. Addig futtassa a gélt, amíg a futási frontot jelző festék a gél kb. kétharmadáig elér. 9. A tápegység kikapcsolása után vegye ki a gélt a tálcával együtt, majd UV megvilágítás alatt fotózza le a gélt és csatolja a jegyzőkönyvhöz. 10. A molekulasúly fragmentumok vándorlási hosszának lemérésével készítsen kalibrációs görbét (ahol az x tengelyen a fragmentek vándorlási hosszát /mm/, az y tengelyen a fragmentumok méretének 10-es alapú logaritmusát ábrázolja). Határozza meg az egyes minták DNS fragmentumainak méretét. A kapott eredményeket csatolja a jegyzőkönyvhöz. 4. ábra: agaróz gél és a puffer tank 5. ábra: gyakorlaton alkalmazandó 100 bp-os molekulamarker
Fluoreszcensen jelölt DNS molekulák elválasztása kapilláris gélelektroforézis segítségével - DNS szekvenálás 1. Kapilláris gélelektroforézis A kapilláris gélelektroforézis (CE) viszonylag új elválasztási technika. Előnye, hogy töltéssel rendelkező és töltés nélküli molekulák elválasztására egyaránt alkalmas, jellemző rá a nagy elválasztási hatékonyság, rövid analízis idő, kis mennyiségű minta (ng-pg-nyi mennyiségek) és puffer térfogat, kevés hulladék képződés, egyszerű szerkezeti felépítés és kezelhetőség, valamint az automatizálhatóság. Egy CE berendezés leegyszerűsítve (1.ábra) két, elektródát tartalmazó pufferkádból áll, amelyhez az ömlesztett kvarc kapilláris végei csatlakoznak. A kapilláris 10-100 µm belső átmérőjű, 20-50 cm hosszú, amelynek szilárdságát külső polimer bevonat biztosítja. Az elválasztani kívánt minta feszültség hatására jut be a kapilláris belsejébe, amely polimerrel van feltöltve. Nagyfeszültség (5-30 kv) hatására az elválasztani kívánt molekulák elektroforetikus mobilitásuk különbözősége miatt a kapilláris vége felé vándorolnak, így elválaszthatók töltésük/méretük alapján. Mielőtt elérnék a külső puffertartályt detektálásra, kerülnek a kapillárison belül. 1. ábra Kapilláris elektroforézis berendezés felépítése 2. DNS szekvencia meghatározás lépései 2.1. Mintaelőkésztés, a jelölő PCR reakció összeállítása A DNS szekvenálás célja ismeretlen DNS molekula nukleotid sorrendjének meghatározása. A szekvencia sorrend meghatározás első lépése egy speciális összetételű PCR reakció összeállítása, amelyet először Sanger alkalmazott 1977-ben. A reakcióban a DNS templáton, primeren, deoxi-nukleotid keveréken (dntp mix) és DNS polimerázon kívül limitált mennyiségben fluoreszcens festékkel jelölt dideoxi-nukleotidok (ddntp mix) is jelen vannak. A dideoxi-nukleotid 3 vége nem tartalmaz OH csoportot, így a DNS szálhoz kapcsolódva leállítja a képződő szál növekedését. Mivel mind a négy nukleotidnak megfelelő dideoxi-nukleotid részt vesz a reakcióban, ezért mindegyik bázis pozíciójában megakadhat a DNS szál szintézise. Miután a dideoxi-nukleotidok beépülése véletlenszerű, ezért a meghatározandó szekvencia teljes méret tartományában kapunk rövidebb-hosszabb DNS fragmenteket, melyek 3 végükön fluoreszensen festékkel jelöltek. A készülék ezeket a
végjelölt fragmenteket a kapilláris elektroforézis útján elválasztja egymástól, és a detetektálja a floureszcens festék típusát. A PCR reakció lépései a következők (2.ábra): 1. Denaturálás: 94 ºC-on az egymáshoz tapadt DNS láncok szétnyílnak, és minden más enzimatikus reakció leáll. 2. Primer feltapadás (annealing): 50 ºC-on hidrogén-híd kötések alakulnak ki az egyszálú primer és az egyszálú DNS lánc bázisai között. A szekvenálási reakciókban csak egy primert használunk, így a DNS egyik szála íródik át. A primer feltapadás helyét a bázissorrend határozza meg. 3. Lánchosszabbítás (extension): A nukleotidok a primer 3 végéhez kapcsolódnak, és a polimeráz enzim elkezdi a DNS szál szintézisét. De véletlenszerüen a fluoreszcensen jelölt dideoxi-nukleotidokat is beépülnek a képződő szálba, megakadályozva további nukleotidok kapcsolódását. 2. ábra A szekvenáláshoz szükséges PCR reakció Az előzőleg ismertetett három lépés 30 cikluson keresztül ismétlődik. 2.2. A szekvenálási reakció termékek tisztítása A PCR reakciótermékeket az elválasztás előtt meg kell tisztítani a reakcióban jelenlévő puffer, MgCl 2, Taq polimeráz enzim és be-nem-épült dntp és ddntp maradványoktól. Erre a rutinszerűen alkalmazott módszer az un. etanolos DNS precipitálási módszer. A PCR termékek beszárítását követően, nagy tisztaságú/deionizált formamidban való feloldás következik, így biztosítható a DNS molekulák negatív töltését és megakadályozható a DNS szálak összetapadása a denaturálás után. 2.3. A DNS fragmentek elválasztása és detektálása, az adatok feldolgozása A DNS molekulák kapillárisba történő injektálása után elkezdődik az elválasztás, amelynek paraméterei a készülék vezérléséhez használt programban állíthatók be, az
elválasztás körülbelül 2,5 óra szükséges. A negatív töltésű DNS darabkák a pozitív elektród (anód) felé vándorolnak. A kis méretű fragmensek gyorsabban, míg a nagy méretűek lassabban haladnak az elektromos térben, így azok méretük szerint elválnak egymástól (3. ábra). 3. ábra: Az elválasztás folyamata az idő függvényében A detektáló cellán keresztül haladó különböző típusú fluoreszcens festékkel jelölt DNS molekulákat 488-515 nm hullámhossz tartományban argon-ion lézerfény gerjeszti. A visszasugárzott 500-650 nm hulláhosszú sugarakat egy CCD kamera érzékeli és digitális információkká alakitja át. (4. ábra) 4. ábra: A detektáló egység felépítése Az elválasztás detektálása on-line módon történik. A nyers adatokat a szekvenáló berendezéshez kapcsolt számítógép menti el A speciális kiterjesztésű minta file-ok tartalmazzák az elválasztási paramétereket, az elektroferogram-ot és magát a szekvencia sorozatot.
GYAKORLAT A gyakorlathoz szükséges anyagok és eszközök: BigDye Terminator v3.1 szekvenáló mix M13rev primer pgem 3Zf templát DNS 3M Nátrium-Acetát (ph 5.20) 96%-os és 70%-os etanol oldatok Hi-Di Formamid 96 mintahelyes PCR reakció plate PCR reakció plate tető PCR reakció plate septa PCR készülék Juan CR12-es plate centrifuga 3100 ABI Gentetikai Analizátor Vákum bepárló berendezés A gyakorlat menete 1. A PCR reakció összemérése: A reakció egy 96 mintahelyes PCR reakció plate-ben fog végbemenni. Első lépésként a PCR reakció összetevőket kell bemérni a plate adott pozíciójába (well-be) A reakcióhoz szükséges anyagok és mennyiségük: 0,3 l templát DNS pgem 3Zf plazmid (1 µg /µl, Promega) 0,5 l primer - M13rev (10 pmol/µl) 1,2 l BigDye Terminator v3.1 mix 8,0 l H 2 O Annak érdekében, hogy a reakcióedény falán ne maradjanak cseppek, egy gyors centrifugálást végzünk. 2. PCR reakció elindítása A plate-t behelyezzük a PCR készülékbe és elindítjuk az előre megírt programot, ami az alábbi hőprofil szerint fog működni. 3. Etanolos precipitálás A PCR lefutását követően a keletkezett PCR termékeket meg kell tisztítani a reakcióban jelenlévő puffer, MgCl 2, Taq polimeráz enzim és be-nem-épült dntp és ddntp maradványoktól. Ehhez a kövekező vegyszerek és azok mennyiségek kell a a PCR termékekhez hozzákeverni: 1,5 µl 3 M-os Nátrium-Acetát (ph 5.2) 7,5 µl H 2 O 31 µl 96%-os etanol
A 15 perces szobahőmérsékleten történő inkubálás után, a plate-t 15 perc alatt lecentrifugáljuk 3500 rpm-en. A centrifugálás után a felülúszót óvatosan leöntjük, egy papírtörülközö felületére. A mintát tartalmazó well-be ezt követően 200 µl 70%-os etanolt pipettázunk és felszuszpendáljuk a benne lévő DNS-t. Ezt a lépést az előzől lépésben ismertetett centrifugálási lépés követi, a felülúszót ismét leöntjük. A DNS-t tartalmazó plate-et 15 percre vákuum bepárló berendezésbe helyezzük, az alkohol maradékok eltávolítása céljából. 4. Minták feloldása Hi-Di Formamid-ban: A beszárított DNS mintákat 11 µl Hi-Di Formamid-ban felszuszpendáljuk és a plate-et egy speciális tetővel (septa) lezárjuk. Annak érdekében, hogy a well falán ne maradjanak cseppek, egy gyors centrifugálást végzünk, majd a PCR készülékben 96 C-on 3 percig denaturáljuk. 5. Szekvenálás a genetikai analizátoron: A plate-t egy speciális tartóba fogatjuk és a Applied Biosystems 3100-as típusú genetikai analizátorba helyezzük. A Data Collection vezérlő software segítségével megadjuk a szekvenálni kívánt mintá nevét,pozícióját, a használt fluorezcens festék komibáció és elválasztáshoz használt program típusát. Ezt követően elindítjuk a gélelektroforéztist. 6. Adatok elemzése: A szekvenáló program lefutását követően a minta adatotak az Applied Biosystem Sequencing Analysis v 3.7 software automatikusan kiértékeli. Ennek ellenére szemrevételezéssel ellenőrizni kell a kapott erednényt. 7. A szekvencia adatok adatbázisban történő ellenőrzése A mintafile-ból kimásolt szekvenciát a National Center for Biotechnology Information honlapján (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) található BLAST adatbázis segítségével ellenőrizzük FELADAT: A gyakorlaton kapott szekvencia BLAST adatbázisban történő ellenőrzése és a kapott eredmény rögzítése a mérési jegyzőkönyvben.