1 Kezdetek 2 Tömegspektrometria J. J. Thomson, 1910, 1912 Kisülési csőbe különböző gázokat vezetett 20 Ne/ 22 Ne Izotópok létezésének bizonyítéka Szabó Pál MTA Kémiai Kutatóközpont (szabop@chemres.hu) Kezdetek 3 Az MS felépítése 4 F. W. Aston, 1919 Első spektrográf Ne, Cl, Hg, N izotópok Adatgyűjtő rendszer Mintabevitel Ionforrás Analizátor Vákuumrendszer Detektor Interface Ionforrás 5 Elektron ionizáci ció 6 Cél: Töltött részecskék előállítása Ionizációs módok: elektron ionizáció (EI) kémiai ionizáció (CI) gyors atom bombázás (FAB) lézerdeszorpció (LDI, MALDI) ionizáció légköri nyomáson (API) electrospray ionizáció (ESI) légköri nyomású kémiai ionizáció (APCI) légköri nyomású photoionozáció (APPI) deszorpciós electrospray (DESI) mágnes filament (fűtőszál) Filament (fűtőszál): W, Re T fil = 2000 C M repeller trap mágnes Kamra: p= 10-5 Torr T= 100-200 C Repeller: U= néhány V 1
Elektronionizáció 7 Az elektronenergia hatása 8 Vizsgálhatóság feltétele: illékonyság Tömeghatár: 1000 Dalton (Da) Kationok, gyökkationokképződnek Fragmentáció: gyakori és jellegzetes (spektrumkönyvtár) Sok esetben nincs molekulaion Az elektron energiának a szerepe Kémiai ionizáci ció 9 Kémiai ionizáci ció 10 CI forrás: az EI forrásnál zártabb Ion-molekula reakciók: Reagens gáz: metán, izobután, ammónia Nyomás: 0.1 Torr (EI 10-6 Torr) Minta parciális nyomása: 10-4 Torr Lágy ionizáció Fragmentáció: elhanyagolható Kvázi-molekulaion Metán: CH 4 e - CH 4 2 e - CH 4 CH 4 CH 3 CH 5 Izobután: CH 3 CH 4 C 2 H 5 H 2 CH 5 M CH 4 [MH] C 2 H 5 M [MC 2 H 5 ] (CH 3 ) 3 CH C 3 H 7 CH 3 C 3 H 7 C 4 H 10 C 4 H 9 C 3 H 8 C 4 H 9 M [MH] C 4 H 8 C 4 H 9 M [M C 4 H 9 ] CI reagens gázokg 11 Tipikus EI spektrum 12 Metán: szerves vegyületekre általánosan jó [MH] [MC 2 H 5 ] ionokat ad az adduktok intenzitása kicsi [M-OH] M Izobután: Ammónia: enyhe fragmentáció figyelhető meg [MH] [MC 4 H 9 ] ionokat ad az adduktok intenzitása nagy nem olyan univerzális, mint a metán fragmentációnincs bázikus molekuláknál [MH] iont ad poláris vegyületeknél [MNH 4 ] iont ad egyéb vegyületekre nem jó 2
Tipikus CI I spektrum 13 Gyors atom bombázás 14 [MH] [2MH] Cél: kiterjeszteni a vizsgálható vegyületek körét Megoldás: mátrix bevonása az ionképzésbe Mátrix: glicerin, NOBA Tömeghatár: néhány ezer Da Fragmentáció: kismértékű Gyors atom/ion: Xe, Cs Kvázi-molekulaion: [MH], [MNa], Gyors atom bomb atom bombázás 15 zerdeszorpció 16 Lézerdeszorpci Matrix Assisted Laser Desorption Ionization- Time of Flight Mass Spectrometry Leggyakoribb mátrixok: 4-hidroxi-a-ciano fahéjsav (CHCA) 2,5-dihidroxi benzoesav (DHB) Mátrix-minta kristályok a targeten 3,5-dimetoxi-4-hidroxi fahéjsav (SA) 17 18 Mintatartó pződés Mintatart MALDI ionképz Mintatartó 20 kv hn AH Rács Laser Rács 1. A mátrix-minta oldatot rászárítjuk a mintatartóra. 2. Laserimpulzus hatására molekulák lépnek ki a gázfázisba. 3. A minta molekuláit a mátrix ionizálja, majd az elektrosztatikus tér felgyorsítja. 4. Repülési idő (TOF) tömegspektrometriás detektálás. 3
A MALDI előnyei 19 Tipikus MALDI spektrum 20 Lágy ionizáció: intakt biomolekulák vizsgálata lehetséges Széles tömegtartomány: nagy móltömegű biomolekulák (> 300 kda) vizsgálata Keverékek egyidejű vizsgálata lehetséges, nem igényel bonyolult tisztítást, elválasztást Nagy érzékenység (fmol tartomány) Könnyen értelmezhető spektrumok (kis töltöttség) Sók, pufferek hatása kisebb Gyors % Intensity 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 24607 [M3H] 3 49813 [M2H] 2 74667 Voyager Spec #1=>NR(2.00)=>RSM100[BP = 149089.4, 3562] [MH] 149131 [2M3H] 3 99694 1 pmol lineáris mód 25 kv gyors. fesz [2MH] 298434 3562.3 0 0 20000 80000 140000 200000 260000 320000 Mass (m/z) Ionizáci ció légköri nyomáson 21 Electrospray ionizáci ció 22 Poláros ESI IonSpray: Pneumatikusan segített electrospray Nagyfeszültség (5-6 kv) hatására töltött cseppek kerülnek a gázfázisba (koncentrációérzékeny!). Polaritás Apoláros APPI APCI 10 1 10 2 10 3 10 4 10 5 Móltömeg Ionforrások koncentrációtartományai: TurboV (2µL/min 3mL/min) Turbo-IonSpray (2µL/min 1mL/min) IonSpray (2 to 200µL/min) Micro-IonSpray (50 to 1000 nl/min) NanoSpray (~1µL-5µl in tip, 20-50 nl/min) Kis áramlás fi nagyobb érzékenység! IonSpray TM 23 TurboIonSpray TM 24 Áramlási tartomány: 2 200 µ L/min Áramlási tartomány: 2 1000 µ L/min 4
Turbo V TM 25 Microelectrospray 26 Áramlási tartomány: 2 3000 µl/min Áramlási tartomány: 50 1000 nl/min Nanospray 27 Nanospray 28 Áramlási tartomány: 20 50 nl/min Microtechnikák másként 29 30 nt pződés Sprayképz légköri nyomás 1. töltött cseppek képződése 3. Coulomb robbanás vákuum 2. oldószereltávolítás 5
Többszörösen sen töltt ltött tt ionok 31 Móltömegszámítás 32 minden egyes csúcsra igaz: Lysozyme MW = 14,305.14 m/z = (MW nh) n m/z = tömeg/töltés értékek a spektrumban MW = a fehérje móltömege n = töltésszám (egész) H = a hidrogén ion tömege(1.008 Da) Móltömegszámítás 33 Rekonstruált tömegspektrumt 34 A töltés és a móltömeg is ismeretlenek Két szomszédos csúcs töltöttségi foka közti különbség:1 14305.7 1431.6 = (MW nh) n 1301.4 = (MW [n1]h) [n1] 2 ismeretlen két egyenlet először n-re oldjuk meg n = 1300.4/130.2 = 10 majd behelyettesítve a móltömeg: MW = 14316 - (10x1.008) = 14305.9 14,305.14 14402.8 Eluensmódos dosítók 35 Sóhatás 36 Szerves savak (hangyasav, ecetsav) elősegítik a bázikus vegyületek (sp 3 N-tartalmú) protonálódását. Semleges együletek kationok (alkálifém, ammónium) segítségével is képezhetnek ionokat. 0.1 % hangyasav vagy ecetsav a legjobb adalék pozitív módban peptidek, fehérjék vizsgálatára, a 0.1% TFA HPLC-MS méréseknél kedvelt. Ammónium-formiát vagy-acetát javasolt puffernek 2-10 mm koncentrációban. Foszfátpuffer, TEA kerülendő!!! 6
APCI 37 Ionképz pzés s mechanizmusa 38 Az APCI nagy áramlást is (0.1-2.0 ml/min.) tolerál Poláros, termikusan stabil vegyületek vizsgálatára Molekulatömeg MW < 1000 Da Intenzív fűtés hatására az oldószer elpárolog Porlasztó- és segédgáz alkalmazása szükséges Korona kisülés hatására következik be az ionizáció primer folyamat: N 2 e - N 2 2e - szekunder folyamat:n 2 H 2 O H 2 O N 2 H 2 O H 2 O H 3 O OH adduktképződés: H 3 O M [MH] H 2 O APCI ionképz pződés 39 Kombinált forrás 40 légköri nyomás vákuum 1. 1. oldószermolekulák ionizációja Forrásház ESI probe 2. adduktképződés, klaszterképződés APCI probe Légköri nyomású fotoionizáci ció 41 Photospray forrás 42 Eluens áramlási sebessége:100µl-2ml/min Fordított fázis MeOH/víz előnyös ACN csökkenti az érzékenységet Normál fázis Izooktán/Izopropanol/Diklórmetán Dopant: Toluol (HPLC grade) 5-15% külön pumpával Hőmérséklet: 300-450 C (APCI) 7
XIC of M RM (4 pairs): 28 9.3/97.2 amu from Sample 3 (SM 4 100-10p g/ul 10 ul inj NP APCI) of SM4 Q1... Max. 2.0e4 cp s. 500 0.00 1.00e 5 9.50e 4 9.00e 4 8.50e 4 8.00e 4 7.50e 4 7.00e 4 6.50e 4 6.00e 4 5.50e 4 5.00e 4 4.50e 4 4.00e 4 3.50e 4 3.00e 4 2.50e 4 2.00e 4 1.50e 4 1.00e 4 XIC of M RM (4 pairs): 27 9.5/133.0 am u from Sample 1 ( SM4 10 0-10 pg/ul 10u L injnp PI) of SM4 Q1 M... Max. 2.0e4 cp s. 900 0.0 800 0.0 700 0.0 600 0.0 500 0.0 400 0.0 300 0.0 200 0.0 100 0.0 2.0e4 1.9e4 1.8e4 1.7e4 1.6e4 1.5e4 1.4e4 1.3e4 1.2e4 1.1e4 1.0e4 0.00 0.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 Tim e, min 1 2 3 4 5 6 7 8 Tim e, min PSI alkalmazás 43 Deszorpciós Electrospray 44 Intensity, cps Testosterone PhotoSpray Source CH 3 OH CH3 H APCI H H O Ethynyl Estradiol PhotoSpray Source H CH 3 OH CH Intensity, cps H H HO APCI DESI alkalmazások sok 45 volítás 46 Oldószerelt szereltávol Nitrogén gázfüggöny Gázfügg ggöny interface 47 48 interface Robusztusság Robusztuss légköri nyomás CUR DP SK vákuum Q0 2.00E05 1.80E05 1.60E05 Methomyl3.1% Carbaryl 3.3% Aldicarbsulfone 3.6% Aldicarb 3.6% 1.40E05 FP Response 1.20E05 1.00E05 8.00E04 6.00E04 4.00E04 N 2 2.00E04 0.00E00 0 200 400 600 800 1000 1200 Injection Number Szpájkolt talajminta (50ng/mL); 1200 injektálás(3.5nap) 8
Karbantartás 49 volítás 50 Karbantart Oldószerelt szereltávol Fűtött kapilláris HPLC eluens Párologtató gáz Spray Fűtőegység Szárítógáz Fűtött kapilláris Analizátorok 51 Mágneses analizátor 52 Cél: Töltött részecskék szétválasztása Analizátor típusok: mágnes (B) elektrosztatikus (ESA) kvadrupol (Q) ioncsapda (trap) repülési idő (TOF) lineáris ioncsapda (LIT) Fourier transzformációs ion ciklotron rezonancia MS (FT-ICR) Orbitrap Lorentz erő: 1. ½ mv2 = eu 2. veb =mv 2 /R v= erb/m 1. 2. Pásztázás (scan) : mágnesáram gyorsító feszültség m e = B2 R 2 2U Tömegspektrometria alapegyenlete Mágneses analizátor 53 54 tor tor Elektrosztatikus analizátor Szektormező 1. ½ mv2 = eu 2. mv 2 /R = ee ϕ 1. 2. R = 2U / E Független a tömegtt megtől!!! - 9
ESA 55 kuszálás 56 ESA Kettős s fókuszf Cél: a mágnes és az ESA kölcsönös hiányosságainak kiküszöbölése A forrásból kilépő ionok sebesség- és irányszoródást szenvednek Mágnes: impulzus szerint szeparál. Azonos tömeg, különböző energia kiszélesedik a csúcs Rések: érzékenység csökken Nagyfelbontás!! Kettős s fókuszf kuszálás 57 Felbontás 58 mágnes Z-rés ESA m Felbontás: R = m 10 % völgy Full Width at Half Mass m Dm (50% magasságnál) forrásrés kollektorrés ionforrás detektor 10 % Dm m Kvadrupol analizátor 59 Kvadrupol analizátor 60 Felbontás: egységnyi A rendszer méréshatára: néhány ezer DC = 0 - ±500 V RF = 6000 V 1. 2. 3. 4. 5. 6. Egy Electrical Ion RF-voltage Movement... adott enters AC repulsion the of / changes of DC quadrupolesystem the érték ion and polarity into esetében attraction, direction and csak electrical respectively, of of egy the nearest repulsion ion between nearest and quadrupolerod számára attraction, quadrupolerods stabil respectively, az with ionpálya. the with opposite and between the ionopposite charge quadrupole charge rods and ion 10
Kvadrupol analizátor tor 61 tor 62 Ioncsapda analizátor belépő ionok belépő elektróda gyűrűelektróda kilépő elektróda kilépő ionok Előny: érzékenység, kis méret, MS n Ioncsapda analizátor 63 RF pásztázás kilépő potenciálgát Lineáris ioncsapda: Q TRAP EXB változtatása 64 Radiális csapdázás Ionok mozgása: az elektródákra kapcsolt egyenilletve váltófeszültség hatására Az összes ion egyszerre tartózkodik a csapdában Kis méret, könnyű kezelhetőség MS n funkció (n=10, elméletileg!) Q2 Axiális csapdázás Axiális csapdázás Segéd RF pásztázás. Radiális csapdázás Kilépő oldali háló Repülési idő analizátor 65 Repülési idő analizátor 66 Konstans potenciál (U) m 1, m 2 D m 1 m 2 Idő (ns) Detektor m 1 >m 2 azonos töltés esetén ½ mv 2 = eu m 1 v 1 v= (2eU/m) 1/2 m 2 v 2 t = D/v = (D 2 m/2eu) 1/2 m= 2U D 2 t 2 Az ionok energiaszórása miatt a felbontás kicsi Megoldás: iontükör (reflektor) késleltetett ionkieresztés (delayed extraction) 11
A felbontást befolyásol soló tényezők 67 Felbontást növeln velő megoldások 68 Forrás Eltérő helyen képződő ionok Detektor Az ionképződés helyének szórása Iontükör (Reflectron) R= m/dm=t/2dt Sebességszórás Dt t Sebességeloszlás (energiaszórás) Delayed extraction (MALDI) orthogonal TOF Dt Iontükör 69 Iontükör r a valóságban 70 Iontükör detektor U gyorsító deflektor U=0 forrás U tükör Delayed Extraction (DE) 71 A DE hatása a felbontásra 72 20 kv A potenciálgradiens a lassabb ionokat jobban gyorsítja delayed extraction R=1,100 Linear mode continuous extraction R=125 delayed extraction R=11,000 Reflector mode continuous extraction R=650 20 kv A detektorig a lassabb ion utóléri a gyorsabbat 10600 10800 11000 11200 11400 m/z Minta: DNS 36-mer 6130 6140 6150 6160 6170 m/z Minta: DNS 20-mer 12
Felbontás 73 Felbontás 74 m Felbontás: R = m Minimálisan szükséges felbontás 10 % völgy m 10 % m Full Width at Half Mass m (50% magasságnál) m Ar 39.96239 C 3 H 4 40.03130 N 2 28.00615 C 2 H 4 28.03130 CO 27.99491 N 2 28.00615 13 CC 6 H 7 92.05813 C 7 H 8 92.06260 580 1100 2490 20600 FT-ICR MS 75 Ionpály lyák k az orbitrapban 76 A cellába bejuttatott és a nagy mágneses térerő hatására körpályára kényszerített ionok által indukált áramot méri. óriási felbontás tág időskála (nem destruktív detektálás) Speciális Orbitrap Teljesítőképess pesség 77 78 Orbitrap 5 m/ m = 70,000 Instrument performance for Bovine Insulin 3 1,147 1,148 1,149 4 m/ m = 40,000 5 m/ m = 45,000 1,911 1,912 1,913 1,914 1,434 1,435 1,436 3 4 1,200 1,400 1,600 1,800 m/z 13
frequency of occurrence Analizátorok felbontása 79 Az FT-ICR felbontása 80 11 779.6097 R=1,040,000!!! szektor (E,B) nagy >10,000 kvadrupol (Q) egységnyi (kivétel!) ioncsapda (trap) nagy (de: tömegpontosság?) repülési idő (TOF) nagy >10,000 lineáris ioncsapda (LIT) közepes <10,000 orbitrap nagy > 200,000 FT-ICR nagy!!! >1,000,000 779.3482 779.4282 779.5187 779.7009 779.7924 779.8840 779.9759 A felbontás s szerepe az azonosításokban Elegendő-e e egy egyszerű LC/MS? sokban 81 82 XIC ± 100mDa S/N = 5.3 XIC ± 9.6mDa S/N = 15.5 2000 1500 Több száz vegyület rendelkezik 250 körüli móltömeggel. 1000 XIC ± 4.8mDa S/N = 41.0 XIC ± 1.9mDa S/N = 44.1 500 200 400 600 800 1000 molecular weight Szerkezeti informáci ció nyerése se 83 MSMS spektrumok 84 MSMS spektrumok Benzocaine O Ethenzamide O O CH 3 NH 2 H 2N O CH 3 Egyező összegképlet : C 9 H 11 NO 2 Egyező tömeg : 165.19 dalton Egyező számú kettős kötés : 4 Eltérő fragmensek 14
Tandem tömegspektrometriat 85 Triple quadrupol felépítése 86 Célok: szerkezeti információ nyerése érzékenység növelése szelektivitás növelése Q0 Q1 q2 Ütközési cella Q3 DF CEM Megvalósítás: szektor: kombináció (EBE, BEB) kvadrupol: QqQ ioncsapda: MS n TOF: Post SourceDecay (PSD), TOF/TOF hibrid: BEqQ, Q-Trap, Q-TOF, Lehetséges scanfunkciók 87 MS pásztázási si módokm 88 Product Ion Scan Precursor Ion Scan Q1 full scan kiválaszt: anyaion pásztáz: fragmension Neutral Loss Scan pásztáz: anyaion kiválaszt: fragmension Multiple Reaction Monitoring (MRM) Minden iont figyel Selected Ion Monitoring (SIM) pásztáz: Q1 és Q3 a semleges tömegével eltolva kiválaszt: anyaion kiválaszt: fragmension Csak a kiválasztott ionokat figyeli Q1 Full scan mód 89 Q1 SIM módm 90 1 st scan 2 nd scan 1 st experiment 2 nd experiment Last m/z Last m/z m/z 3 m/z 3 m/z arány m/z értékek Hosszabb tartózkodás az egyes tömegeken Jobb jel/zaj viszony m/z 2 m/z 2 m/z 3 m/z 2 m/z 1 m/z 3 m/z 2 m/z 1 m/z 1 Idő Time 15
Single Quad Full Scan 91 Single Quad SIM 92 1.5e8 1.0e8 5.0e7 10ng/ml peszticid 11.2 0.6 12.4 13.3 7.6 8.2 9.2 9.4 9.9 14.0 6.5 6.8 10.2 1.6e5 1.5e5 1.4e5 1.3e5 1.2e5 1.1e5 1ng/ml peszticid 0.0 1.15e5 1.00e5 8.00e4 6.00e4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Time, min 253 171 102 202 88 1.0e5 9.0e4 8.0e4 7.0e4 6.0e4 5.0e4 4.0e4 7.1 11.1 4.00e4 2.00e4 0.00 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 m/z, amu 3.0e4 2.0e4 1.0e4 0.0 9.6 0.6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Time, min MRM módm 93 Triple Quad MRM 94 Első scan MRM3 Második scan MRM3 6500 6000 5500 1ng/ml peszticid 6.9 5000 Q1/Q3 értékek MRM2 MRM2 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 MRM1 MRM1 1000 500 Idő 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Time, min Szelektivitás: Atrazin 100μg/L 95 Érzékenység: : Chlortoluron 10μg/L 96 MRM MRM SIM SIM 16
Linearitás: : Linuron 97 Q-Trap 98 MRM 3D Trap Érzékenység a teljes tömegtartományban MS 3 (vagy több) Q TRAP TM SIM QqQ MRM lehetőség Semlegesvesztés Precursor Scan Érzékenység a teljes tartományban MS 3 MRM lehetőség Semlegesvesztés Precursor Scan Ha akarom: hármas h rmas kvadrupol......ha akarom ioncsapda... 99 100 Megtartva minden hagyományos funkciót : Single MS scans (Q1 and Q3 scans) Product Ion Scan (MS2) Precursor Ion Scan (Prec) Neutral Loss Scan (NL) Multiple Reaction Monitoring scan (MRM) Új pásztázási módokkal : -Enhanced single MS scan (EMS) -Enhanced Resolution scan (ER) - Enhanced Product Ion scan (EPI) -Enhanced Multiply Charged scan (EMC) -Time Delayed Fragmentation scan (TDF) - MS/MS/MS scan (MS3) Lineáris ioncsapda: 101 102 ris ioncsapda: Q TRAP Trap Q-Trap Ion accumulation Q0 Q1 Q2 Q3 Exit lens 30% 3D Ion Trap Anyaion kiválasztás Fragmentáció N 2 CAD Gas 1. Anyaion kiválasztása. 2. Intenzív fragmentációa LINAC-ban. 3. Fragmensionok csapdázása Q3-ban 4. Mass scan. linear ion trap 3x10-5 Torr Q TRAP System 17
MS1 (3D trap) (3D trap) 103 QTrap) 104 EMS (QTrap( EMS: 4.521 to 5.003 min from Sample 56 (797-47/5 EMS ujbol) of CPF.wiff (Turbo Spray), subtracted (3.346 to 4.231 min) Max. 1.0e7 cps. 538.5 1.00e7 547.4 9.50e6 9.00e6 8.50e6 8.00e6 7.50e6 7.00e6 6.50e6 6.00e6 5.50e6 5.00e6 4.50e6 4.00e6 3.50e6 3.00e6 2.50e6 2.00e6 1.50e6 1.00e6 5.00e5 0.00 529.6 1033.4 684.3 540.4 566.3 666.2 508.6 520.7 649.4 945.5 1115.5 1131.4 815.5 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 m/z, Da 1093.4 MS2 547 105 MS3 547/538 106 MS2 547 MS3 547/538 107 108 MS4 547/538/529 MS5 547/538/529/392 MS4 547/538/529 MS5 547/538/529/392 18
EPI 547 109 EPI 547 110 EPI (547.38) Charge (2) CE (35) CES (15) FT (250): Exp 3, 4.871 to 4.945 min from Sample 2 (090217 797-47/5 IDA) of CPF.wiff (Turbo Spray) Max. 1.2e5 cps. EPI (547.50) CE (50): 0.867 to 0.914 min from Sample 22 (090219 108 EPI 547) of CPF.wiff (Turbo Spray) Max. 1.3e7 cps. 1.20e5 538.3 1.15e5 3.4e6 1.10e5 1.05e5 1.00e5 9.50e4 9.00e4 8.50e4 CE:35eV 3.2e6 185.2 417.3 3.0e6 435.3 167.2 392.4 2.8e6 287.3 2.6e6 305.2 CE:50eV 8.00e4 2.4e6 7.50e4 2.2e6 7.00e4 6.50e4 6.00e4 5.50e4 5.00e4 392.4 4.50e4 547.2 4.00e4 287.4 3.50e4 417.4 3.00e4 529.4 271.2 2.50e4 305.3 684.2 261.4 435.4 2.00e4 666.1 1.50e4 1033.3 500.2 213.4 256.6 520.4 565.2 630.1 277.3 389.3 1.00e4 209.5 232.2 322.2 399.2 455.4 490.3 508.8 945.5 262.7 362.3 583.2 795.5 927.6 5000.00 777.5 815.5 1015.4 334.4 420.2 594.4 867.8 2.0e6 1.8e6 1.6e6 1.4e6 1.2e6 1.0e6 8.0e5 6.0e5 4.0e5 2.0e5 154.2 215.3 238.4 500.3 536.4 271.3 518.3 256.4 261.2 630.4 547.4 244.1 226.2 288.1 299.3 565.4 194.3 406.3 648.5 232.3 209.3 277.4 529.4 400.2 282.3 252.2 322.4 171.2 203.3 362.4 548.3 384.4 474.4482.3 147.2 381.1 612.4 795.4 175.1 233.3 351.5 423.2 583.4 456.4 514.3 641.4 655.3 777.3 1034.3 309.1 575.6 741.4 867.4 928.7 945.7 1016.6 339.3 849.5 666.4 684.3 0.00 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 m/z, Da 0.0 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 m/z, Da Enhanced pásztázásisi módok 111 Megnövelt felbontás 112 Enhanced MS Scan 4000amu/s 1000amu/s 250amu/s <0.7 amu Scan @ 4000 amu/sec Scan @ 1000 amu/sec Enhanced Resolution Scan 0.3 amu 250amu/s Scan @ 250 amu/sec 0.15 amu Megnövelt felbontás 113 Megnövelt leányion pásztp sztázás 114 ER: 4.424 to 4.532 min from Sample 6 (AI 19-45 1/1000_3f... 653.73 7.8e5 7.5e5 7.0e5 3 Max. 7.8e5 cps. ER: 5.306 to 5.337 min from Sample 7 (PPB 1-21 1/1000_2f... 849.96 2.8e6 850.40 2.7e6 2.6e6 2.5e6 2 Max. 2.8e6 cps. Product Ion Scan 6.5e5 6.0e5 653.43 2.4e6 2.3e6 2.2e6 2.1e6 5.5e5 5.0e5 654.04 2.0e6 1.9e6 1.8e6 1.7e6 4.5e5 1.6e6 850.86 Intensity, cps 4.0e5 3.5e5 Intensity, cps 1.5e6 1.4e6 1.3e6 1.2e6 Enhanced Product Ion Scan 3.0e5 1.1e6 1.0e6 2.5e5 654.35 9.0e5 8.0e5 2.0e5 7.0e5 6.0e5 1.5e5 1.0e5 5.0e4 654.67 5.0e5 4.0e5 3.0e5 2.0e5 851.33 851.83 1.0e5 0.0 652.0 652.5 653.0 653.5 654.0 654.5 655.0 655.5 656.0 656.5 m/z, amu 848 849 850 851 852 853 854 m/z, amu 19
Érzékenységnövekedés 115 Screening módszerek 116 Hagyományos product ion scan EPI > 550x Célmolekulák keresése (M.T.S): 300 MRM (2MRM/komponens): 150 vegyület 300 MRM-en alapuló IDA mérés, mint Survey Scan amit 3 információfüggő EPI scan követ (3 különböző ütközési energián): 300 vegyület És ha több komponens van? Ismeretlen komponensek keresése (G.U.S.) EMS pásztázáson alapuló IDA mérés, mint Survey Scan, amit információfüggő EPI scan követ (AutoFragment módban dinamikus háttérkivonással DBS) Ütközési cellák 117 Cross talk effektus 118 A hagyományos ütközési cellák egy RF-only kvadrupolok, melyben az ütközőgáz nyomása relatíve nagy (fókuszálás) Ütközösicella Ütközösicella Felmerülő problémák Érzékenység csökkenése(kis dwell time-ok esetén) Cross Talk (együtt eluálódó, egyező fragmenstömegű komponensek) 300 200 400 200 m/z m/z Az ionok áthaladási ideje a cellán: 50-80 msec. Azonos Q3 tömegek esetében az egyes átmenetek zavarhatják egymást. Egy csúcs jellemzése 119 Egy csúcs jellemzése 120 A pontok számának csökkenésével a csúcs ábrázolása torzul S/N viszony nő a csúcsszélesség csőkkenésével A kvantitáláshoz minimálisan szükséges pontok száma:6-20 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 A pontok számának csökkenésével a csúcs ábrázolása torzul S/N viszony nő a csúcsszélesség csőkkenésével A kvantitáláshoz minimálisan szükséges pontok száma:6-20 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 0 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 20
Egy csúcs jellemzése 121 MRM határai 122 A pontok számának csökkenésével a csúcs ábrázolása torzul S/N viszony nő a csúcsszélesség csőkkenésével A kvantitáláshoz minimálisan szükséges pontok száma:6-20 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Tipikus csúcsszélesség egy HPLC futás során~ 20 sec Minimálisan szükséges adatpontok száma~10 Minimális dwell time / ion ~ 5msec Minimális pause time az MRM átmenetek között ~ 2msec MRM átmenetek maximális száma: = 20 sec/csúcs 10pont/csúcs 7 msec/pont = 285 0 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 Ajánl nlás s mennyiségi meghatároz rozásokhoz 123 Célmolekulák k MRM átmenetei 124 Ajánlás 2002/657/EG SIM és MRM (4 azonosítási pont) MS anyaion 1.0 MS 2 2 MRMs = 4 fragmens 1.5 (megfelelő ionarány) Full scan spektrum (spektrumkönyvtár) NagyfelbontásúMS (>10 000) XIC of -MRM (3 pairs): 321.0/152.0 amu from Sample 3 (Std. 0.5ng/ml) of Data Quantitation Chl... 380 360 340 320 300 280 260 240 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 Quantifier tömeg Qualifier tömeg(ek) 4.99 Max. 385.8 cps. 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 Time, min Metolachlor Pozit itív találat lat 125 lat 126 Metobromuron Negatív találat Oldószer Oldószer 0.1µg/L Standard 0.1µg/L Standard Számolt Quantifier/Qualifier arány = 0.90 Felszíni víz 0.01µg/L Felszíni víz 0.008µg/L Számolt Quantifier/Qualifier arány = 0.39 21
QTrap kínálta screening lehetőség Survey scan: 300 MRM IDA kritérium (küszöb ) 3 EPI spektrum Dinamikus kizárás 60 sec MRM Survey Scan IDA Criteria Acquire MSMS Acquire SpectraMSMS Acquire SpectraMSMS Spectra Dynamic Exclusion 127 300 komponens egyidejű mérése 1.05e6 1.00e6 9.50e5 9.00e5 8.50e5 8.00e5 7.50e5 7.00e5 6.50e5 6.00e5 5.50e5 5.00e5 4.50e5 4.00e5 3.50e5 3.00e5 2.50e5 2.00e5 1.50e5 1.00e5 5.00e4 XIC of MRM (297 pairs): 226.2/170.0 amu from Sample 1 (MRMs 100) of Data MRM pesticides_02.wiff (Turbo Spray) 300 Peszticid 100ng/mL 11.79 Max. 1.1e6 cps. 128 0.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Time, min Multi-target target screening screening 129 screening 130 Multi-target target screening Spektrumkönyvt 131 132 nyvtár A QTRAP nyújtotta lehetőségek Pozitív Tebufenpyrad találat gyömbérben mért koncentráció 0.29 mg/kg maximálisan megengedett érték = 0.05 mg/kg átlag MRM arány a standard esetében = 0.850 (RSD=8%, n=7) MRM arány a mintában = 0.909 a standard Rt értéktartománya 5.84-5.87 perc (SD=0.01 perc, n=7) minta Rt = 5.78 perc P Intensity, cps Intensity, cps 1.5e5 1.5e5 1.4e5 1.4e5 1.2e5 1.2e5 1.0e5 1.0e5 8.0e4 8.0e4 6.0e4 6.0e4 4.0e4 4.0e4 2.0e4 2.0e4 0.0 0.0 Standard 5.84 Gyömbér minta 5.78 5.78 2 4 6 2 4 6 Time, min Time, min További vizsgálatokat igényelt, mivel gyömbérben még nem fordult elő! 6 22
A QTRAP nyújtotta lehetőségek További lehetőségek gek 133 134 Pozitív Tebufenpyrad találat gyömbérben Enhanced ProductIon spektrumok az m/z=334 (MH ) ionokon (API 4000 Qtrap) Qualifier Quantifier Tebufenpyrad standard oldata Gyömbér minta Tovább növelni az egy injektálásból vizsgálható célmolekulák számát (1000-körüli értékig): Scheduled-MRM Konklúzió: a kapott EPI spektrumok alapján a Tebufenpyrad jelenléte a gyömbérben egyértelműen kizárható! Tipikus Screening kromatogram 135 Egy tipikus screening mérés 136 1.05e6 1.00e6 9.50e5 9.00e5 8.50e5 8.00e5 7.50e5 7.00e5 11.79 300 MRM Ciklusidő 2.1 sec Dwell Time: 5msec Pause time 2msec MRM csatornák alakulása az LC mérés során: Csúcsszélesség 10sec, egyszerre vizsgált MRM cstaornák átlaga : 7 Pesticide Mix (253 MRM) - From 6.68-Min to Last MRM (out of 302) Average MRM/Sec = 7 (for Peak Width of 16sec) 25 Numb. MRM Gradient 90 80 6.50e5 6.00e5 20 70 5.50e5 5.00e5 4.50e5 4.00e5 3.50e5 3.00e5 Number MRM at Time 15 10 60 50 40 30 % A (aqueous) 2.50e5 2.00e5 5 20 1.50e5 10 1.00e5 5.00e4 0.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Time, min 0 0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 LC Time (sec) Scheduled-MRM 137 Scheduled-MRM MRM: : a koncepció 138 Csak akkor figyel egy MRM csatornát, amikor ott ion várható Minden MRM csatorna esetén meg kell adni Egy várt Rt. Rt. ablak Minimum dwell time A program automatikusan felépíti a metódot Az idők alapján megtervezi az MRM átmeneteket A minimális ciklusidőt VAGY dwell time-ot veszi alapul MRM átmenetek Nagy számú vizsgált MRM átmenet Kis számú vizsgált MRM átmenet 23
1.05e5 1.00e5 9.50e4 9.00e4 8.50e4 8.00e4 7.50e4 7.00e4 6.50e4 6.00e4 5.50e4 5.00e4 4.50e4 4.00e4 High throughput vizsgálat smrm módszerrel 10 perces LC futás 1000 MRM módszer 35 vegyület spike-olt vizelet 139 Alkalmazások Screening módszerek Klinikai alkalmazás Doppinganalitika Igazságügy Élelmiszer/környezetvédelem 140 3.50e4 3.00e4 2.50e4 2.00e4 1.50e4 1.00e4 5000.00 0.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Time, min Terápi piában használt gyógyszerek gyszerek Analeptikumok Antiarrhythmikumok Antibiotikumok Antidepresszánsok Antiepileptikumok Antikoagulánsok Antimycotikunok 141 Antiretrovirális szerek Analgetikumok Bronchustágítók Immunszupresszánsok Narkotikumok Cytosztatikumok Élelmiszerek minőségbiztos gbiztosításasa Klóramfenikol (mézből, tejből, kagylóból, tojásból) Szulfonamidok (mézből, húsból) Tetraciklinek (mézből, húsból) Benzimidazolok (húsból) Béta agonisták (állatorvosi eseteknél) Nitrofurán (mézből, húsból, kagylóból, tojásból) Akrilamid (sültkrumpliból) Chlormequatés Mepiquatmérése Ochratoxin A and Zearalenon (sütőipari termékek) Aflatoxinok Isoproturonés Glifozát (csapvízből és talajból) Karbamátok (gyümölcsből) Triazinok és fenilurea peszticidek (vízből) Multi pesticidescreening (gyümölcsből, zöldségből) 142 Mi is az a Cliquid 143 Beépített módszerekm 144 Az első élelmiszervizsgálatokra készült szoftver Egyszerű felhasználói felület Agilent1100,1200 HPLC, Shimadzu Prominence HPLC illetve bármelyab Triple Quad vagy QTrap MS rendszerekkel használható A legfontosabb célvegyületekre előregyártottmetódok Beépített riportkészítő egység A szoftver melléa szükséges oszlopok is rendelkezésre állnak Peszticidek: karbamátok, szerves foszfonátok, fenilurea, triazinok Nitrofurán és metabolitjaik Klóramfenikol Azofestékek (pozitív és negatív módban) Malachite zöld Akrilamid Mikotoxinok Szteroidok kiegészítve egy 421 vegyületből álló MRM könyvtárral, amiből saját metódot állíthatunk össze, illetve amikből a már meglévő módszereket ki tudjuk egészíteni 24
Nyitólap: navig lap: navigál 145 lasztás 146 Egyszerű metódkiv dkiválaszt Mérendő minták k listája Egyszerűen szerkeszthető, vagy importálható ja 147 si lehetőség 148 Riportkész szítési lehet Riportküld ldés s módjam 149 150 dja ekvilibrálás Áttekintés, ekvilibr 25
Automatikus mérés 151 kromatogramfigyelés 152 Automatikus m Real time kromatogramfigyel A készülék állapotának grafikus megjelenítése 26