6. Fiziológiás oldatok összeállítása A szervezet normális működéséhez elengedhetetlen a homeosztázis fenntartása, melybe bele tartozik az ozmotikus viszonyok állandósága (isozmozis), a ph állandóság (isohydria) és az állandó ionösszetétel (isoionia) biztosítás. A homeosztázisban bekövetkező változások a sejtek rendellenes működéséhez vezetnek. A testfolyadékok jellemezhetők ozmolaritásuk alapján, mely 1 dm 3 oldatban megadja az ozmotikusan aktív ionok mennyiségét molban. Például 1 mol/l NaCl-oldat ozmolaritása: 2 osmol. Az emberi vér esetében az osmolaritás 300 mosmol. 1.) Készítsünk fiziológiás só-oldatot emberek számára! Az ozmolaritás alapján számoljuk ki, mennyi NaCl-ot kell bemérni 100 ml desztillált vízhez, hogy isozmotikus só-oldatot kapjunk! 2.) Készítsünk 100 ml fiziológiás só-oldatot békáknak, melynek koncentrációja az emberi fiziológiás só-oldat 72%-a. Számoljuk ki az oldat ozmolaritását! Szükséges eszközök: főzőpohár/ lombik, mérőhenger, vegyszer adagoló kanál, analitikai mérleg, mágneses keverő Szükséges anyagok: NaCl, desztillált víz Adatok: Na 23 g/mol; Cl 35,5 g/mol A gyakorlatban fiziológiás só-oldatot folyadékveszteség esetén, vértérfogat pótlására, kiszáradás elkerülésére alkalmazzák. A sejtek membránjukon, mint féligáteresztő hártyán képesek vizet felvenni, vagy leadni, ezáltal alakjuk változik, és a sejten belüli koncentráció-viszonyok megváltoznak. Ez komoly zavarokat okoz a sejten belüli folyamatok normális működésében. Ha a vér hipoozmotikus folyadékba kerül, az a vörösvértestek duzzadását, kipukkadását (hemolízist) okozhatja. Ha viszont a vér töményebb, hiperozmotikus folyadékkal kerül kapcsolatba, akkor a vörösvértestek vizet veszítenek, buzogány alakot vesznek fel. Egyik esetben sem képesek ellátni szerepüket, vagyis a légzési gázok szállítását a szervekhez. Az ozmotikus viszonyok fenntartása tehát nélkülözhetetlen az életben maradáshoz. 3.) Készítsünk 10 ml 0,4%-os NaCl-oldatot (hipoozmotikus), valamint 10 ml 3%-os NaCl-oldatot (hiperozmotikus). Vegyünk elő négy darab kémcsövet! A kémcsövekbe öntsünk 2-3 ml: a. 0,9%-os (fiziológiás) sóoldatot b. 0,4%-os NaCl-oldatot c. 3%-os NaCl-oldatot d. desztillált vizet. A kémcsöveket feliratozzuk! Majd fertőtlenítsük le az ujjunkat és steril, egyszer használatos tűvel enyhén szúrjuk meg az ujjbegyet. A megjelenő vérből egy-egy cseppet üvegbot segítségével keverjünk bele a kémcsövekbe.
A tűket a kijelölt gyűjtőbe dobjuk. Saját biztonsága és a fertőzésveszély elkerülése érdekében mindenki külön tűt használjon! Vegyünk elő mikroszkópot. Mindegyik kémcsőből cseppentsünk egy cseppet tárgylemezre, majd helyezzünk rá fedőlemezt. Vizsgáljuk meg a mintákat mikroszkóp alatt, és rajzoljuk le a vörösvértestek alakját. Mérleggel történő mérések alapja, hogy az ismeretlen tömeget ismert nagyságú tömegsorozattal hasonlítjuk össze. A laboratóriumi gyakorlatban a lemérendő test (anyag) tömegétől és a mérés kívánt pontosságától függően az összehasonlításhoz különböző nagyságú és szerkezetű, különböző érzékenységű mérleget használunk. Tulajdonképpen valamennyi kétkarú emelő. A hagyományos mérlegeken kívül elterjedtek újabban az elektronikus működésű félautomata és automata mérlegek is. A mérlegek jellemzői: - méréshatár - az a maximális tömeg, amivel a mérleg terhelhető - érzékenység - az a legkisebb tömeg, amelyre a mutató egy osztással kitér, - pontosság - a valós tömeg és a mért tömeg közötti százalékos eltérés. Táramérleget vagy laboratóriumi kézimérleget használunk, ha 0,01 g pontossággal akarunk mérni. Ezek méréshatára 100-500 g lehet. Az analitikai mérlegen 0,0001 g (0,1 mg) pontossággal mérhetünk. Ez a mérleg igen érzékeny, ezért üvegezett szekrényben tartjuk, hogy a portól, huzattól megvédjük. Méréshatára 100-200 g. Az egyszerű analitikai mérleg helyett a gyakorlatban manapság a hagyományos típusú, légfékes analitikai mérleggel találkozunk, amelynek érzékenysége kisebb ugyan (0,2-0,4 mg), de a mérést lényegesen meggyorsítja. Az igen érzékeny, 20 g méréshatárú mikroanalitikai mérlegen a milligramm ezredrészét (l µg = 10-6 g) is megmérhetjük. Mindegyik mérlegfajtához megfelelő pontosságú tömegminták, azaz mérőtest készlet (tömegsorozat) tartozik A mérés megkezdése előtt meg kell vizsgálni a mérleg használhatóságát! A mérlegen található vízszintjelző buborék ellenőrzésével győződjünk meg a mérleg helyes felállításáról, valamint állapítsuk meg a mérleg egyensúlyi helyzetét, vagyis hogy terheletlen állapotban a mutató a nulla-ponton álljon be. Kétkarú mérleggel történő mérésnél a bal serpenyőre helyezzük a mérendő tömeget, a jobb serpenyőre pedig a súlysorozat megfelelő tagjait. A mérendő vegyi anyagot soha nem közvetlenül a serpenyőre helyezzük, hanem mérőedényben, óraüvegen, vagy bemérő csónakon mérjük le! A mérőtestek felhelyezésekor a mérleg mindig rögzített (arretált) állapotban legyen! Méréskor a mérőtesteket csak csont, vagy műanyag végű csipesszel szabad megfogni, sohasem ujjal, mert a legcsekélyebb szennyezés is hamis mérési adatokat eredményez! A mérőtesteket ne tegyük le a laboratóriumi asztalra, azok vagy a mérlegen, vagy a dobozban legyenek! Analitikai mérlegen történő mérésnél a mérés előtt 5-10 percig nyitva hagyjuk a mérlegszekrény ajtóit, hogy a szekrény levegője azonos állapotú legyen a környezet levegőjével. Szobahőmérsékletűnél
melegebb tárgyat ne helyezzünk a mérlegre, mert a mérlegkarok egyenlőtlen felmelegedése sok hibát okoz! A mérés befejezése után a mérleg terhelését a lehető legrövidebb idő alatt szüntessük meg! A mérlegszekrényben a kiszóródott vegyszereket puha ecsettel szedjük össze! A kicsöppent folyadékot azonnal itassuk fel, és alkoholos papírvattával töröljük át a szennyezett területet! Ha meghatározott mennyiségű anyagot kell lemérnünk, akkor először a bemérőedény (lombik, pohár, bemérő csónak) tömegét az előzőekben leírt módon meghatározzuk. Ezután a jobb oldali serpenyőre a kívánt anyagmennyiségnek megfelelő mérőtömegeket helyezzük, a bemérőedénybe pedig a mérendő anyagunkat. Az előre kiszámított skála-értékre további mérendő anyag elvételével, illetőleg hozzáadásával állítjuk be az egyensúlyi helyzetet. Légfékes mérlegeken gyorsabb a mérés, mert nem kell a lengéseket figyelni és megvárni, amíg a mutató lassan beáll az egyensúlyi helyzetbe. A serpenyőre szerelt légfékek ugyanis gyorsan csillapítják a lengéseket, így az egyensúlyi helyzet pontosan és hamar beáll. Napjainkban már digitális mérlegeket használunk. A testre ható súlyerőt elektromos jellé alakítják, és a kijelzőn a tömeg közvetlenül leolvasható. A mérleg kioldása és az egyensúlyi nulla pont beállítása egyegy gomb megnyomásával történik. A teljes mérési tartományon belül a mérleg a Tara gomb megnyomásával nullázható. A mérleg az egyensúlyi állapot elérést azzal jelzi, hogy a kiírt érték mellett megjelenik a mértékegység. Automata mérlegen történő mérés esetén a bekapcsolás után (ON gomb) a mérőedényt helyezzük rá a mérlegre. A tárázó gomb megnyomásával nullázzuk, majd bemérjük a kívánt mennyiségű vegyszert. A kijelző folyamatosan mutatja a tömegváltozást, a végleges tömeget a mértékegység megjelenésével jelzi. A mérés végeztével a mérőedényt leemeljük, a mérleget kikapcsoljuk. Desztillált víz bemérésére használhatunk mérőhengert. Ez betöltésre hitelesített térfogatmérő eszköz. Mivel vizes oldatok esetén a meniszkusz homorú, így a mérőhenger beosztásának a folyadékfelület legmélyebb pontjával kell egybeesnie. A lombikot körkörösen mozgatva elősegítjük az oldódást. A keveredés biztosításához használhatunk mágneses keverőt is. A berendezés két részből áll: egy keverőből és egy mágneses keverőbotból. A lombikba beletesszük a keverőbotot, majd a keverő közepére helyezzük. A keverőmotor fordulatszámát tekerőgombbal szabályozhatjuk.
7. Hígítási sorozatok készítése A szervek normális működéséhez a fiziológiás só-oldatban lévő Na + és Cl - -on kívül egyéb ionok is elengedhetetlenek, úgymint Ca 2+, K + vagy HCO 3 -. A testnedvekéhez hasonló ion-összetételű, izozmotikus folyadék a Ringer-oldat. Komponenseinek koncentrációja fajonként eltérő. 1.) Készítsünk el 1 liter béka Ringer-oldatot, ha tömegszázalékos összetétele: 0,65% NaCl 0,02% KCl 0,02% CaCl 2 0,01% NaHCO 3 szükséges. A ph 7,2. Számoljuk ki a béka-ringer molszázalékos összetételét! Szükséges eszközök: főzőpohár, mérőkanál, mágneses keverő Szükséges anyagok: NaCl, KCl, CaCl 2, NaHCO 3, desztillált víz Adatok: Na 23 g/mol; Cl 35,5 g/mol; K 39 g/mol; Ca 40g/mol; C 12 g/mol; O 16 g/mol Ringer-oldat összetételének megváltoztatásával következtethetünk egyes ionoknak a sejtek működésében betöltött szerepére. A későbbiekben a kálcium hatását fogjuk vizsgálni béka izmon. 2.) Ehhez készítsünk 100 ml kálcium-mentes béka-ringert. Szükséges eszközök: főzőpohár, mérőkanál, mágneses keverő Szükséges anyagok: NaCl, KCl, NaHCO 3, desztillált víz A hígítási sor egy kiindulási, ismert koncentrációjú törzsoldatból adott oldószer adagolásával készített, oldatonként egyre hígabb összetételű, egyre kisebb koncentrációjú oldatsor. Biológiai vizsgálatoknál egy anyag hatásos dózisának meghatározására használják a higítási oldatsorokat, melyek a kísérletek kezdeti fázisában szokványosan tízszeres lépésközökkel haladva készítenek. Készítéskor a kiindulási oldatból adott mennyiséget, például 10 ml-t veszünk ki, és tízszeresére hígítjuk, azaz 100 ml-re egészítjük ki az oldószerrel (1 sz. oldat; 10-szeres hígítás). Majd az elkészült 1. sz. oldatból veszünk 10 ml-t és 100 ml-re higítjuk, azaz jelig töltjük a mmérőlombikot (2. sz. oldat, 100-szoros hígítás). És így tovább, sorra elkészíthetjük a kívánt hígításokat. A hatásos dózist a hígítási sorozat tagjainak biológiai hatásából, hatásának erősségéből adhatjuk meg. Biológiai mintán a dózisok lépésenkénti csökkentése eredményezhet például fordított U-alakú hatásgörbét: a legkisebb és legnagyobb hígítások nem, vagy alig váltanak ki választ, míg a fordított U közepén lévő koncentrációk hatásosnak bizonyulnak.
hatás erőssége FORDÍTOTT U-ALAKÚ DÓZIS-HATÁS GÖRBE hígítás mértéke A következő gyakorlaton harántcsíkolt izmon, mint biológiai mintán fogunk vizsgálódni. A végtagizmok működését a gerincvelőből kilépő és az izmok membránjához (szarkolemma) futó motoros neuronok irányítják. A motoros idegsejt és az izom közti kapcsolatot neuromuszkuláris junkciónak nevezzük. Ez egy kémiai szinapszis, melynek neurotranszmittere az acetilkolin. Az acetilkolin a kolin ecetsavas észtere. www.farmakologija.com Az emberi szervezetben megtalálható még a vegetatív preganglionáris rostok, a posztganglionáris paraszimpatikus rostok végződésénél, valamint elterjedt mediátor anyag a központi idegrendszerben is. A motoros neuronon végigterjedő akciós potenciál hatására a vezikulák az ingerületátvivő anyagot kijuttatják a szinaptikus résbe, mely a posztszinaptikus oldalon, az izom membránján lévő nikotinosacetilkolin receptorokon megkötődik, és depolarizálja a harántcsíkolt izmot.
Neuromuszkuláris junkció. Forrás: fourtee.apptechnc.net Az izom kontrakciójának előfeltétele azonban az akciós potenciál kialakulása. Tehát akkora nagyságú depolarizációt kell létrehozni, mely eléri az akciós potenciál kiváltásának küszöb-feszültségét. A küszöb-érték elérésekor akciós potenciál mindig kialakul és az izom ennek következtében mindig összehúzódik. Az izomrostok minden vagy semmi törvénye szerint működnek, vagyis ha küszöbértéket meghaladó inger éri a rostot, arra maximális összehúzódással válaszolnak. Több izomrostból felépülő izmokra viszont ez a törvény már nem vonatkozik, ugyanis az egyes izomrostok ingerküszöbe eltérő. A küszöb eléréséhez megfelelő mennyiségű acetilkolin jelenléte szükséges. Hasonló hatás érhető el acetilkolin receptor agonisták alkalmazásával, például nikotinnal, fenil-trimetil-ammóniummal. A nikotin a Nicotiana tabacum leveleinek alkaloidja, 1928-ban izolálták. Nicotiana tabacum. www.botanical-online.com
A nikotin volt az az anyag, amelynek segítségével a ganglionális átkapcsolódás mechanizmusát Langleg 1889-ben felfedezte. Nagyon toxikus, ezért terápiás jelentősége nincs. A nikotin színtelen, lúgos kémhatású, olaj sűrűségű, jellegzetes szagú folyadék, amely fény hatására megbarnul. Vízben és zsírokban oldódik, savakkal vízoldékony sókat képez. A bőrön keresztül és belélegezve is felszívódik. A halálos adag 20-60 mg. A nikotin képlete. www.tocris.com Az említett anyagok hatásos dózisának meghatározása érdekében készítsünk belőlük kémcsövekbe hígítási sort! 3.) Az elkészített normál béka Ringer-oldat felhasználásával hígítsuk az acetilkolint 10 2-10 6 -ig, 10- szeres lépésekkel haladva. Az öt különböző hígítás mindegyikéből 10-10 ml-re lesz szükség. 4.) Hasonló módon készítsünk öt lépésben 10-10 4 -ig nikotin oldatsort a törzsoldatból. Szükséges eszközök: kémcsövek, pipetták Szükséges anyagok: béka-ringer, acetilkolin törzsoldat, nikotin törzsoldat Ha az acetilkolin receptorok működését gátoljuk, akkor nem tapasztalható izom kontrakció. Kísérletekben alkalmazható a d-tubokurarin, mely az acetilkolin kompetitív antagonistája. Dél-Amerikában az Amazonas és Orinoco környékén élő bennszülöttek ősidők óta készítették a kurarénak nevezett, igen hatékony nyílmérget a Strichnos-félék kérgéből. Strychnos guianensis www.tropilab.com
A kurare több rokon alkaloid gyűjtőneve. Közülük a legjelentősebb a tubokurarin. A kurare hatás lényege, hogy a motoros véglemezen az acetilkolin receptorokhoz kötődik és meggátolja az ingerületátvivő anyag kapcsolódását. Izomrelaxáns hatása emberre is veszélyes lehet, mert gátolja a rekeszizom működését, így légzésbénító hatású. Tubokurarin-klorid formában hozzák forgalomba (pl.:norcuron). www.tocris.com 5.) Készítsünk 10 ml 10-szeresére hígított Norcuron-oldatot a törzsoldatból! Kisebb mennyiségű folyadék térfogatának pontos mérésére szolgálnak a különböző pipetták. Főbb típusaik: az egy-, illetve két-körjeles hasas-, valamint az osztott- és a mikro-pipetta. Egyre elterjedtebbek az ún. automata-pipetták is. Ezek cserélhető, kb. 10 cm hosszúságú és 1 cm átmérőjű, végükön beszűkített műanyag szívócsővel (pipetta-hegy) ellátott dugattyús megoldású eszközök, amely vagy adott térfogat kimérésére szolgálnak (fix térfogatú), vagy kisebb intervallumban (pl. 1-5 cm 3 ) beállítható a kívánt folyadéktérfogat is (változtatható térfogatú). Pontosságuk kissé elmarad a hagyományos üveg eszközökétől (kb. ± 2%). A gyorsaság és a kiváló ismételhetőség azonban nagyon előnyös sorozatmérések esetén, így jól helyettesítik az osztott-pipettát. Automata pipetta használatakor először tiszta, száraz pipetta-hegyet helyezünk fel, majd a kívánt térfogatértéket állítjuk be (ez legtöbbször egy rögzíthető kis csavar eltekerésével valósítható meg). Ezután a marokra fogott eszközből a dugattyú segítségével kinyomjuk a levegőt, folyadékba merítjük és hüvelykujjunk lassú emelésével teleszívjuk a pipettát. A dugattyú ismételt lassú megnyomásával engedjük ki a folyadékot, egészen ütközésig lenyomva, miközben a pipetta végét az edény falához érintjük. A pipettahegyben mindig marad némi folyadék, amit nem távolítunk el. Használat közben figyeljünk, hogy a pipetta hegye ne érintkezzen az oldószeren kívül mással, ellenkező esetben cseréljük le. Egyes automata pipettákon külön gomb lenyomásával a pipetta-hegy eltávolítható. Használaton kívül lehetőleg állványon tároljuk! Mivel mérgező vegyi anyagokkal dolgozunk, tartsuk be a munkavédelmi előírásokat! Az előírások betartása mindenkinek a legszigorúbban vett egyéni érdeke, de a laborvezető köteles is mindenkivel betartatni. Vegyszergőzök ellen használjunk szellőző berendezést, és minden műveletet fülke alatt végezzünk. A nikotin bőrön keresztül is felszívódhat, ezért puszta kézzel ne fogjuk meg, hanem használjuk a megfelelő laboratóriumi eszközöket! Ha mégis a bőrre jutna, akkor azonnal mossuk le! A tubokurarin emésztőrendszeren keresztül felszívódva mérgez. Gondosan ügyeljünk arra, hogy ne jusson a szánkba. Ezért
a laboratóriumban szigorúan tilos enni, inni és dohányozni! Ha mégis a szánkba kerül, akkor öblítsük ki bő vízzel. Ha már a gyomorba jutott, akkor azonnal hívjunk orvost! Munka közben ügyeljünk a rendre és a tisztaságra! Ha a mérgező oldatok kifolynak, akkor célszerű bő hideg vízsugárral felmosni. Tilos a mérgező anyagokat a lefolyóba önteni. Gyűjtsük őket össze az arra kijelölt tárolóedénybe! Mindenféle kárt és balesetet azonnal jelenteni kell a laborvezetőnek! Az elkészített oldatokat lefedjük, és további felhasználásig hűtőben tároljuk.
8. Bioassay vizsgálat Az előző két gyakorlaton elkészített oldatok hatását biológiai mintán fogjuk megvizsgálni, mely béka ideg-izom preparátum lesz. A tapasztalatok alapján megismerhetünk néhány tényezőt, mely az izom kontrakciót befolyásolja. Ideg-izom preparátum a musculus gastrocnaemiusból (vádli) és az őt beidegző nervus isciadicusból áll. Készítése a következő módon történik. A békát dekapitáljuk, gerincvelőjét bonctűvel elroncsoljuk, miután is a végtagok elernyednek, tónustalanokká válnak. A békát hátára fektetjük, a has bőrét és az izmokat haránt irányban átvágjuk, a symphysist szabaddá tesszük. Mindkét combtőnél a bőrt körbevágjuk, majd lenyúzzuk a lábról. Megkeressük a nervus isciadicus kilépési pontját a gerincvelőből és cérnával elkötjük, és a kötés felett elvágjuk az ideget. A béka felső testét ollóval eltávolítjuk. Követjük az ideg lefutását a symphysisig. A symphysist éles ollóval középen átvágjuk, vigyázva, hogy az ideg rostjait meg ne sértsük. A combról eltávolítjuk az izmokat, és felszabadítjuk az ideget, mely szorosan a combcsont mellett fut. Az Achilles-ín alá cérnát vezetünk és szorosan megkötjük, majd a kötés alatt átvágjuk. A m. gastrocnaemiust a térdizületig feltárjuk, majd a lábszárat eltávolítjuk. A combcsontot a térdizülethez közel eső felén szorosan átkötjük, majd a csontot a felső harmadánál átvágjuk. Így megkapjuk az ideg-izom preparátumot, mely a n. isciadicusból, a m. gastrocnaemiusból és a térdizületből áll. Az Achilles-ínra kötött fonalat erősen meghurkoljuk, majd a sartorius-edény alsó részén lévő horogra akasztjuk úgy, hogy a térdizület és az ideg kilógjon az edényből. A combcsonton lévő fonalat az állványra rögzített transzducer érzékelő nyelvéhez csatlakoztatjuk. Az ideget ráfektetjük az ingerlő elektróda-párra, melyet előzőleg állványhoz rögzítettünk. A sartorius-edény végére gumicsövet húzunk, szorítóval elzárjuk, és normál béka Ringer-oldattal töltjük fel. A szorító segítségével eresztjük majd le a felül betöltött különböző oldatokat. A gyakorlaton használt ingerlő négyszöghullámú stimulátor, ahol az impulzusok paraméterei, úgymint amplitúdó, időtartam és frekvencia, egymástól függetlenül állíthatók. A transzducer erő-feszültség átalakító berendezés, mely az izom összehúzódásait, mechanikai munkáját elektromos jelekké fordítja. Az erő-feszültség transzducert erősítőn keresztül analóg-digitális konverterhez kötjük, mely a transzducer analóg jelét a számítógép számára értelmezhető digitális jellé alakítja. Az analóg jelek megszakítás nélküli, folytonos jelek, mint például a mutatós óra. A biológiában analóg szignálnak tekinthetjük az idegi akciós potenciálok időben gyorsan változó feszültségét, vagy a membránpotenciál lassú változását is. A számítógépes felhasználás érdekében ezeket a jeleket digitalizálni kell, ami általában az időben változó mennyiségek diszkrét értékekben, számokban való megjelenítését jelenti. A digitalizálással lehetőség nyílik az adatok tárolására, átalakítására, akár továbbítására is. A számítógépben történik az adatok grafikus megjelenítése is.
Kísérleti összeállítás: TRANSZDUCER ERŐSÍTŐ A/D KONVERTER COMPUTER SARTORIUS-EDÉNY INGERLŐ A vizsgálat során a sartorius edényben adott sorrendben cseréljük ki az inkubáló oldatokat: 1. normál béka-ringer 2. kálcium-mentes Ringer 3-7. acetilkolin hígítási sor (a leghígabbtól kezdve). 8-12. nikotin hígítási sor (a leghígabbal kezdve) A béka-ringerbe tett izom esetén keressük meg az ingerküszöböt: az ingerlő azon legkisebb feszültségértékét, mellyel az ideget ingerelve az izom összehúzódik. Jegyezzük fel, hogy változik az ingerküszöb, ha kálcium-mentes Ringert alkalmazuk. Figyeljük meg az izom spontán kialakuló kontrakciós válaszait acetilkolin és nikotin hígítási sor használata esetén! Jegyezzük fel, mely oldat-koncentrációknál tapasztalható izom összehúzódás! Minden oldat használata után normál Ringerrel mossa át a preparátumot, mert így elkerülhető az izom irreverzibilis károsodása! Ringer-oldat esetén egyes ingerekre rángásokkal válaszol az izom. Kalcium mentes Ringerrel kezelt izom ingerlékenysége fokozódik, kis idő után spontán fibrilláris rángások is tapasztalhatók, mert a membrán depolarizálódik. Normál Ringer adásával a hatás megszüntethető. Acetilkolin bizonyos hígítása spontán, lassú, reverzibilis, tartós kontrakciót eredményez. Ugyanez tapasztalható adott koncentrációjú nikotin-oldat esetén is. Ez bizonyítja, hogy a harántcsíkolt izom kontrakcióját az acetilkolin transzmitter kiváltja, és hatása nikotinos acetilkolin receptorokon keresztül történik. Egy másik ideg-izom preparátumot helyezzük sartorius-edénybe, és 1 órára áztassuk Norcuronoldatba. A fenti kísérleti összeállítást alkalmazva ingereljük az izmot az idegen keresztül (indirekt ingerlés)
különböző erősséggel. Ha nem működik, próbáljuk direkt módon, az izom felszínére helyezett elektródákkal kontrakcióra késztetni. Ha még működőképes a preparátum, akkor vizsgáljuk meg az acetilkolin és tubokurarin egymást antagonizáló hatását. 1%-os tubokurarin oldatot cseréljük ki az acetilkolin azon dózisával, mely korábban összehúzódást váltott ki a preparátumon. Figyeljük meg az izom válaszát! Mivel a tubokurarin gátolja az ideg-izom ingerület áttevődést, ezért az izom csak direkt módon ingerelhető. A d-tubokurarin az acetilkolin kompetitív antagonistája: a nikotinos acetilkolin receptorokhoz bekötődve nem engedi a transzmitter kapcsolódását. Ezért nem tapasztalhatunk kontrakciót! A kompetitivitást meghatározza az anyagnak a receptorhoz való kötődési affinitása.