Németh Anikó 1,2, Kosáry Judit 1, Fodor Péter 1, Dernovics Mihály 1 1 Budapesti Corvinus Egyetem Élelmiszertudomány Kar, Alkalmazott Kémia Tanszék 2 Wessling Hungary Kft., Élelmiszervizsgáló Laboratórium
Szelén speciáció Toxikológia, biológiai hasznosulás Szerves vagy szervetlen módosulatok? HPLC-ICP-MS -- ismert, standard formájában elérhető módosulatok Teljes szelén módosulat profil Élettani folyamatok Minőség-biztosítás Nagyfelbontású MS technikák alkalmazása Metabolomika, metallomika Kis mennyiségben jelen lévő, ismeretlen szelén módosulatok azonosítása
Paradió Dióhéjban Növények számára nem esszenciális --- S analógia Kétélű fegyver! Nem akkumulátor Másodlagos akkumulátor Hiperakkumulátor Szervetlen és Met Illékony vegyületek Metilezett aminosav származékok gabonák, hagymafélék Lecythidaceae: Brazil dió (paradió) majomcsésze dió Majomcsésze dió
Szeleno-metabolomika Tömegspektrometria szervetlen (ICP-MS) szerves (ESI-MS) Robusztusság Alacsony kimutatási határ Standardek szükségesek Szerkezeti információ Tisztított, prekoncentrált minta szükséges Adatbányászat Megoldás: együttes alkalmazásuk Kapcsolt analitikai rendszerek (elválasztástechnika + tömegspektrometria) Többlépéses mintaelőkészítés: SEC és HPLC-ICP-MS Metabolitok meghatározása: RP-HPLC-ESI-Q-TOF-MS
Intenzitás 82, cps Intenzitás 82, cps Intenzitás 82, cps Többlépéses minta tisztítás x1 7 1.2 x 1 5 5 III. x 1 5 1.6 1..6 2.5 IV..8 25 45 65 85 15 125 Elúciós térfogat, ml II. I. 5 1 15 2 Idő, perc 2. 3. 5 1 15 2 Idő, perc SEC-ICP-MS SCX-ICP-MS IP-RP-ICP-MS Orthogonális: különböző elválasztási elvek felhasználásával Megfelelően tiszta és koncentrált minta: ionizáció hatásfoka javítható (ESI) fragmentáció
Intenzitás, cps Adatelemzési stratégiák Adatbázisos keresés Pontos tömeg alapján (< 5 ppm) Ismert szelén-módosulatok (Met, Cysta, Met-Cys) Jellemző fragmensek keresése Szelenohomocisztein származékok -izotóp mintázatok manuális keresése x1 5 1.2 121.59 x1 4 3 332.9419 334.945 1 1.5 33.944 336.9412 5.6 328 33 332 334 336 338 33 335 922.98 2 4 6 8 m/z
Intenzitás, cps Intensity, cps Intensity, cps Relative intensity Poliszelenidek azonosítása 1.2 x1 5 EIC m/z 181.9715 x1 5 4 x1 5 1.5.75 444.86818 1 5.6 2 435 44 445 45 435 44 445 45 5 1 15 2 25 Time, min 2 4 6 8 Mass-to-Charge (m/z) 4.5 x1 3 9 181.9729 135.96643-3.2 ppm 181.9729 6.56 ppm H 2 N H O O C 263.9396-1.18 ppm S e S e S e C O O H N H 3 135.96643 263.9396 444.8749 1 2 3 4 m/z -szelenohomociszteinil-diszeleno-homocisztein
További poliszelenidek H 2 N -szelenohomociszteinil-triszeleno-homocisztein H 2 N -szelenohomociszteinil-tetraszeleno-homocisztein H 2 N -szelenohomociszteinil-pentaszeleno-homocisztein
Intensity, cps Intensity, cps Polikalkogenidek szintézise és fragmentációja x1 3 9 181.9729 135.96643-3.2 ppm 181.9729 6.56 ppm H 2 N 263.9396-1.18 ppm NH 3 HOOC Hidridképzés 4.5 Na 2 + HCys (NaI, H 2 O 2 ) 135.96643 263.9396 444.8749 1 2 3 4 Mass-to-Charge (m/z) 3.2 x1 4 136.428 9.3598-3.2 ppm 136.428 6.56 ppm H 2 N S 213.9499-1.18 ppm S NH 3 HOOC 1.6 9.3598 196.91517 213.9499 348.97427 1 2 3 4 Mass-to-Charge (m/z)
Szelén anyagcsere γ-glu-met-met + -Met-Met DMP DM γ-glu-metcys γ-glu γ-glu-met Met H Cys O-phospho-Hr HOOC O-phospho-Hr H 2 N HOOC Cysta H Met-Cys HCy HLan CH 3 CH 3 DMD O-acetyl-r 2- O 2- O 2-3 4 R H 2 N n HOOC n = 2-6 NH2 R = lipid anyagcsere köztitermékek pl. hidroxi-geraniol
(Szeleno)Proteomika Dinamikus fejlődés Technológiai háttér Publikus adatbázisok Bioinformatikai eszközök Met és Cys Nem specifikus beépülés Szelén tartalmú fehérjék
Intensity, cps Intensity, cps De novo fehérje (?) szekvenálás x1 4 2 147.684 279.189 393.1359 524.1764 68.2775 781.3252 F M D M R T K 781.3572 65.3169 535.2926 44.2494 248.167 147.1123 1 b 3 y 2 y 1 y 5 y y b2 y 4 6 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 m/z x1 4 1,2 147.684 279.154 393.1446 572.129 728.222 829.347 F M D B R T K 829.347 698.265 583.2329 44.2522 248.1873 147.114 147.684 326.534 441.84 572.129 728.222 829.347 F B D M R T K 829.347 65.3144 535.2924 44.2522 44.2522 147.114,6 y 1 y 2 y 3 y4 y 5 y 6 y4 y 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 m/z
Adatbázis alapú fehérje azonosítás Shotgun proteomika in silico emésztés és peptid alapú fehérje meghatározás Specifikus fehérje adatbázis Eredmények validálása
Intensity, cps TIC intensity, cps Met/Met szubsztitúció x1 7 1,8 x1 6 2.4,9 m/z 35 m/z 374 m/z 422 m/z 398 m/z 446 1.2 EIC intensity, cps 2S albumin 4 x1 4 5 1 15 2 Time, min 131.45 311.35 M B B B R 712.665 49.15 533.852 667.9955 354.134 175.1187 ( ) 178.9763 358.9742 B B M B R 664.1232 49.15 485.1388 667.9955 354.134 175.1187 MMMMR ( ) 178.9763 311.35 49.15 667.9955 B M B B R ( ) 178.9763 358.9742 537.955 667.9955 B B B M R y 1 664.1232 533.852 354.134 175.1187 664.1232 485.1388 36.1534 175.1187 2 b 2 y 2 y 3 y 3 y 4 y 4 1 2 3 4 5 6 7 8 m/z
Összefoglalás Metabolomika 7 ismert és 19 új módosulat Speciális anyagcsere útvonalak Proteomika 22 szelén tartalmú peptid és 4 fehérje Nagymértékű Met/Met szubsztitúció Cys hiánya Detoxikációs folyamatok