SZÍVFÉRGESSÉG, ANAPLASMOSIS, LYME-BETEGSÉG LABORATÓRIUMI DIAGNOSZTIKÁJA Dr. Balogh Nándor PhD. Dipl. ECVCP. PraxisLab Kft. 1038, Budapest, Vasút sor 34. baloghnandor@praxislab.hu Szívférgesség A szívférgességet okozó Dirofilaria immitis diagnosztikája hazánkban nem választható el, a hasonló microfilariakat produkáló D. repens kórhatározásától, tekintve utóbbi jelentős prevalenciáját. A két Dirofilaria faj magyarországi elterjedése az utóbbi években számottevő mértékben előretört. Míg azonban a D. repens első Magyarországi leírása (Fok E és mtsai., 1998) óta eltelt másfél évtizedben hozzászoktunk a magas fertőzöttségi arányhoz a hazai kutyapopulációban, a D. immitis autochton megjelenése csak 2009 óta ismert. Az eddigi felmérések alapján a D. repens elterjedése Magyarországon kutyákban 18%, macskák esetében 4,5% (Fok E és mtsai 2007), míg D. immitis esetében területenként változó lehet, valószínűleg jóval alacsonyabb, azonban összességében nem ismert. A laboratóriumunkban 2009-2014 időszakban vizsgált mintákból rutin vérkenet mikroszkópos vizsgálata során kutyákban 7,1%-os, macskákban 0,2%-os prevalenciát találtunk. Knott-teszttel vizsgálva azonos időszakban 395 mintába 18,2% volt a microfilaraemia prevalenciája. A D. repens infectioval szemben a szívférgességet okozó D. immitis fertőzöttség súlyos tünetekkel jár, ezért nagyon fontos ezek biztos elkülönítése. Kezdeti stádiumban, illetve enyhe fertőzöttség esetén egyik parazita sem okoz jellegzetes klinikai tüneteket, D. repens esetén változatos bőrtünetek, D. immitis esetén gyakran csak krónikus fáradtság, lesoványodás, illetve légzőszervi tünetek jelentkezhetnek. Laboratóriumunkban megalakulásunk óta jelen van a Dirofilaria diagnosztika. A témával a gyakorló állatorvos kollégákhoz hasonlóan két irányból kapcsolódunk. Egyrészt az egészséges állatok részére végzett szűrővizsgálatok, másrészt a tüneteket mutató v. a különböző szűrővizsgálatokon fennakadt állatok megerősítő vizsgálatai. Hogyan tudjuk ilyen esetben elkülöníteni a két faj mikrofiláriáit? A morfológiai jegyek mellett speciális festéssel elkülöníthető a kétféle faj, ehhez azonban gyakorlott vizsgáló szükséges, és ráadásul vegyes fertőzöttség esetén előfordulhat, hogy csak az egyik faj egyedei kerülnek a mintába. A PCR vizsgálat érzékenyebb módszer, itt ugyanis akár egy mikrofilária töredékéből is megállapítható a parazita fajtája. A D. immitis terjedésével egyre növekvő mértékben merül föl az igény a tulajdonosok részéről is a szívférgesség kimutatására/kizárására. Jelenleg az alábbi vizsgálatok állnak a rendelkezésünkre: Microfilaraemia kimutatása A microfiláriák megléte a legnyilvánvalóbb jele a fertőzöttségnek. Ez akár egy csepp vérből is kimutatható, azonban alacsony fertőzöttség esetén nagyobb mennyiségű vér vizsgálata szükséges (min. 1 ml) Knott teszttel, vagy mikrofilaria filtrációs teszttel. Negatív vérkenet esetén mikrofilaraemia nem zárható ki!
D. immitis antigén kimutatása Az tesztek az adult nőstény szívférgek petefészkéből leváló antigént mutatják ki. Lehetnek gyorsteszt formátumúak, ezek nagyrészt úgynevezett gyors immunmigrációs tesztek (Rapid Immunomigration Test), vagy ELISA tesztek. Utóbbiakból egy cégnek gyorstesztben is elérhető platformja van forgalomban, illetve laboratóriumi körülmények között (ELISA lemezen, mosó és leolvasó készülék segítségével) végezhetők. Utóbbiak megbízhatósága általában felette van a gyorsteszt formátumú eljárásoknak. Laboratóriumunkban D. immitis antigén ELISA teszttel 654 mintán végzett vizsgálat közül 16,4% pozitivitást figyeltünk meg. A pozitivitás mértéke változott a vizsgálatkérés indokának megfelelően (1. táblázat) Kérés típusa Export szűrővizsgálat microfilaria+ összes összes 116 293 248 657 pozitív 6 42 60 108 prevalencia 5,2% 14,3% 24,2% 16,4% A táblázatból is látható, hogy a teszt találati aránya megfelelő indikáció esetén magasabb. Emellett meg kell jegyezni, hogy a piacon található tesztek különböző specificitással és szenzitivitással rendelkeznek, és általában csak min. 2-3 kifejlett és csak nőstény férgek jelenléte esetén alkalmazhatók. Az adultok kifejlődéséhez min 6-7 hónap szükséges, ezért ennél fiatalabb állatok szűrővizsgálata nem javasolt. Ezek miatt esetenként fals negatív eredményeket kaphatunk. Hazánkban valószínűleg nagyobb a jelentősége a fals pozitív ELISA eredményeknek, hiszen a növekvő számú klinikai eset ellenére sem valószínű, hogy jelentős a betegség prevalenciája (előfordulási gyakorisága). Alacsony prevalencia mellett ugyanakkor még a 90% feletti specificátsú tesztek esetén sem várhatók magas pozitív prediktív értékek. Fentiek okán pozitív ELISA teszt esetén mindenképpen javasolt annak megerősítése lehetőleg egy másik fajta teszttel, illetve mikrofiláriák jelenléte esetén azok fajtájának megállapítása. Erre a legérzékenyebb és legspecifikusabbb vizsgálati módszer a PCR vizsgálat. Laboratóriumunkban mi is több esetben megfigyeltük, hogy az ELISA teszt és az azt megerősítő PCR vizsgálat eredménye nem állt összhangban. (1. ábra) Emiatt javasoljuk a megfelelő indikáció esetén minél többféle vizsgálattal megerősíteni a diagnózisunkat a gyógykezelés elkezdése előtt. 14 12 10 8 6 4 2 0 PCR:D. repens PCR:D. immitis PCR: Vegyes ELISA neg ELISA poz 1. ábra. Microfilariás állatok PCR és ELISA vizsgálatának összehasonlítása
Az alábbiakban bemutatjuk a szűrővizsgálatok javasolt lépéseit és az eredmények értelmezését: Szűrővizsgálat Diagnózis eredménye D. Knott immitis teszt ELISA - - Valószínűleg nem fertőzött - + D. repens fertőzöttség gyanúja + + D. immitis fertőzöttség gyanúja + - D. immitis fertőzöttség gyanúja microfilaraemia nélkül További diagnosztikai lépés Tünetek esetén: Ismételt vizsgálatok, UH, RTG javasolt PCR megerősítésre PCR megerősítésre Ismételt ELISA vizsgálat lehetőleg másik teszttel, UH, RTG, ismételt PCR eredménye nem szükséges Magyarázat D. repens elvárt eredménysor D. immitis fals negatív ELISA pl. kevés nőstény féreg esetén, (ritkán transzplatentáris, transzfúziós mikrofilaria fertőzés) Vegyes fertőzés fals negatív ELISA pl. kevés nőstény féreg esetén (ritkán transzplacentáris, transzfúziós mikrofilaria fertőzés) D. immitis elvárt eredménysor D. repens 1. Fals pozitív ELISA teszt 2. Vegyes fertőzés D. immitis mikrofiláriák nélkül (korai fert.) Vegyes fertőzés általában nincs elegendő Dirofilaria DNS az elvégézéséhez Knott teszt 2. táblázat. Dirofilaria fertőzöttség gyanúja esetén javasolt diagnosztikai lépések, és azok értelmezése Rövid diagnosztikai ajánlásaink Dirofilaria infectiok felderítésére, megerősítésére kutyák részére:
Dirofilaria immitis szempontjából a szűrést 7 hónapos kor után javasolt elkezdeni, antigén teszttel. Preventív kezelés megkezdése előtt feltétlen javasolt az esetleges korábbi fertőzés felderítésére. Preventív kezelésen lévő kutyák esetén fél évente három alkalommal javasolt további szűrővizsgálat, ha valamennyi szűrés eredménye negatív, ezután évente javasolt szűrni. Az antigenaemia megjelenése néhány hónappal megelőzheti a microfilaraemiát. Rendelőben végzett pozitív antigén teszt esetén microfilaria vizsgálat (ha vérkenet negatív, Knott-teszt is) és megerősítő antigén teszt (laboratóriumban) javasolt. Microfilaria (vérkenet v. Knott-teszt) pozitív mintákból PCR-rel javasolt a faji megkülönböztetést elvégeztetni. Anaplasmosis Hazánkban eddig kutyákban, lovakban és egy macska esetben tapasztaltuk Anaplasma phagocytophilum infectio megjelenését. Észak Amerikában jelen van a teljesen hasonló klinikai és mikroszkópos megjelenésű Anaplasma ewingii nevű kórokozó is. Világszerte leírták, de Magyarországról még nem jelentették a vérlemezkéket megtámadó Anaplasma platys előfordulását. A kórokozó obligát intracelluláris Gram-negatív baktérium. Különböző kullancs fajok terjeszthetik, hazánkban jellemzően az Ixodes ricinus. A kórokozó a neutrophil granulocyták phagosomáiban gátolja a szuperoxid-peroxinirit anionok képződését és azokban elszaporodik, így alakulnak ki a jellegzetes, fénymikroszkóppal is felismerhető morulák. A betegséget akut lázas tünetek, izületi fájdalmak, ritkán gastrointestinális v. légzőszervi, esetleg idegrnedszeri tünetek jellemzik. Ezek az esetek többségében kezelés nélkül is enyhülnek, v. elmúlnak, ritkán akár elhulláshoz is vezethetnek, v. többször visszatérhetnek. Ismert tünetmentes hordozás is ennek különösen vértranszfúziók esetén lehet jelentősége. A betegség heveny szakaszát a vérképben thrombocytopaenia, neutropaenia, esetleg enyhe anaemia jellemzi. Kutyákban előfordul az alkalikus foszfatáz aktivitás enyhe, valamint a C- reaktív protein szint jelentős emelkedése is. A betegség diagnózisát a vérkenetben a neutrophil granulocytákban megfigyelt morulák észlelése jelenti. Ezeket az eseteket megerősítés céljából, a klinikailag gyanút keltő, de morulákat nem mutató eseteket pedig a betegség kizárása céljából javasolt PCR vizsgálatnak is alávetni. A fertőzés vizsgálható szerológia módszerekkel is. A gyorsteszt formátumú ELISA A.phagocytophilum és A. platys fertőzés esetén ad pozitivitást, kutyákban használható. Az immunfluoreszcens teszt képes a két fertőzést elkülöníteni, minden állatfajban használható. Ismét emlékeztetnék arra, hogy a szeropozitivitás nem jelent egyet a klinikai betegséggel. Ezt igazolja a laboratóriumunkban végzett szerológiai minták eredményének összesítése is. A 37 szeropozitív esetben csak 5-6 esetben jelentkeztek tünetek.
3.táblázat A. phagocytophilum előfordulása havi lebontásban a PraxisLab laboratórium mintáiban időszak minták pozitív negatív kétes pozitív (%) negatív (%) kétes (%) 2010. éves 64 10 53 1 15,62 82,82 1,56 2011. éves 122 4 107 11 3,28% 87,70% 9,02% 2012 éves 146 13 128 5 8,90% 87,67% 3,43% 2013. éves 16 0 15 1 0% 93,75% 6,25% összes 348 27 303 18 7,76% 87,07% 5,17% Borreliosis A Lyme-betegség kórokozói a Borrrelia burgdorferi sensu lato komplex különböző fajai. Európában több más faj mellett a leg elterjedtebbek a Borrelia burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. afzelii. Tekintve a betegség nem specifikus tüneteit (láz, izületi fájdalom, esetleg proteinuria, idegrendszeri tünetek) laboratóriumi módszerek szükségesek a diagnózis felállításához. E helyen különösen fontos hangsúlyozni, hogy a laboratóriumi eredményeket mindig a teljes klinikai kép részeként szükséges értékelni. Lévén, hogy a kórokozó nehezen tenyészthető, illetve hogy PCR-módszerrel viszonylag nehezen hozzáférhető mintákból (synovia, bőrbiopszia/aspirátum, liquor) javasolt vizsgálni, alapvetően szerológia módszerek használatosak az infectio felderítésére. Borreliosis diagnózisára, jelenleg az alábbi tesztek elérhetők: Hagyományos (teljes sejt bacterin alapú) ELISA, Immunoblot (különböző antigének elleni ellenanyagok szétválogatása ), C6-ELISA utóbbiból kvalitatív és kvantitatív módszer is. A hagyományos ELISA tesztek bár érzékenyek, hátrányuk a gyakori keresztreakció, gyenge specificitás. Az immunoblot viszonylag költséges, de megbízható eljárás, segítségével a vakcinázott és vad kórokozóval fertőzött állatok között is különbség tehető. A C6-ELISA tesztek a jelenleg elérhető leghatékonyabb tesztek, kellő érzékenység mellett megfelelően specifikusak is. A vakcinázás nem ad pozitivitást ezeknél a teszteknél. Említést érdemel, hogy az Immunoblot esetében a fertőzéstől számítot 5-8-, míg a C6-ELISA esetében 3-5 hét múlva várható pozitivitás. Az elmúlt 5 év mintáiban laboratóriumunkban kb. 6% C6-ELISA szeropozitivitást tapasztaltunk.
Tekintve, a tünetek nem-specifikus voltát jelentős figyelmet kell szentelni, a különböző differenciál diagnózisok felderítésére. Erre az alábbi sémát javasoljuk. Sántaság, láz, anorexia Fájdalmas, duzzadt izület Kulancs által terjesztett kórokozók Borreliosis Anaplasmosis Ehrlichiosis RMSF Bartonellosis Mycoplasmosis Immun-mediált poliarthritis Szisztémás lupus erythematosus Rheumatoid arhtritis Septicus Degeneratív izületi betegség Trauma Lyme+, proteinuria: Teljes vizeletvizsg. Vizelet fehérje/krea-arány vérnyomásmérés Pedigré-analízis Vesebiopszia Ízület környéke fájdalmas, duzzadt Panostitis Osteomyelitis Hyperthrofiás osteodystróphia Hyperthrofiás osteopathia Polymiosytis Neoplasma Mozgásképtelen/gyenge végtag(ok) ± fájdalom Metabolikus betegség Kardiopulmonaris betegség Neurológiai kórkép Vascularis betegség További vizsgálat a klinikai indikáció alapján Vérkép, biokémia, CRP, vizelet Szerológiák (incl. Borrelia C6-ELISA) ANA, RF, Coomb s-test Ízületi punkció-cytológia, bakteriológia RTG Tumor-keresés (RTG, UH, nyirokcsomó-, csontvelő-cytológia)
Borreliosis gyanúja esetén az alábbi diagnosztikai algoritmust javasoljuk követni. Jelenleg a C6-ELISA az általában preferált Lyme-betegség diagnosztikai ajánlás Inidikációk: Kullancscsípés Borreliosisra utaló tünetek Fertőzés kizárása vakcinázás előtt Antibiotikummal KEZELT kutyák esetén Hagyományos vizsgálati sor két lépésben Antibiotikummal NEM KEZELT kutyák esetén C6-sor - 1. Szűrés ELISA-val + 1. qualitatív C6-ELISA + 2. Megerősítés Western immunoblottal 2. quantitatív C6-ELISA - Tünetek megléte esetén: differenciál diagnózisok feltárása, ismételt szerológia 2-4 hét múlva Tüntmentesség esetén: nem fertőzőtt (esetleg 2-4 hét múlva ism. vizsgálat) + kezelés C6-ellenanyagszint > 30 U/ml C6-ellenanyagszint <30 U/ml differenciáldiagnózisok feltárása ismételt szerológia 2-4 hét múlva Terápia ellenőrzése 3-6 hónap múlva: Minimum 50%-os quant. C6-ellananyagszint csökkenés jelzi a sikeres kezelést