SEMMELWEIS EGYETEM Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola, Fogorvostudományi Kutatások PhD program KÜLÖNBÖZO NEUROPEPTID TARTALMÚ IDEGELEMEK VÁLTOZÁSA SJÖGREN SZINDRÓMÁBAN ÉS DIABETES MELLITUSBAN Ph.D.-értékezés tézisei Dr. Batbayar Bayarchimeg Témavezetok: Prof. Dr. Fehér Erzsébet, Prof. Dr. Zelles Tivadar Programvezeto: Prof. Dr. Fazekas Árpád Budapest, 2004. 1
BEVEZETÉS Általánosan elfogadott tény, hogy az idegrendszer donto szerepet játszik a perifériás gyulladás pathofiziológiájában és számos gyulladásos megbetegedésben vesz részt. Az idegrendszer nemcsak a gyulladás kezdeményezésében és fenntartásában játszik szerepet, hanem annak csökkentésében és eliminálásában is. Ebben a folyamatban részt vesznek a neuropeptidek. A szájüreg ép állapota, nemcsak a fogak és a nyálkahártya épségének, de az életminoség meghatározó tényezoje. A neuropeptideket tartalmazó idegrostok száma és megoszlása különbözo betegségekben megváltozik, így Sjögren szindrómában (SS) és diabetes mellitusban is. A SS ismeretlen etológiájú, több szervrendszert érinto autoimmun betegség, amely a külso elválasztású mirigyek elorehaladott esetben limfocitás (foleg T limfocitás) infiltrációjával, a mirigyvégkamrák destrukciójával és azok kóros muködésével jellemezheto, aminek eredménye a keratoconjunctivitis sicca és a nyálmirigy csökkent muködése. Diabetes mellitus, mindazon betegségek összefoglaló neve, melyekben krónikus hyperglikaemia van, továbbá a szénhidrát-, zsír- és fehérje -anyagcsere egyéb rendelleneségei állnak fenn. A SS-hoz hasonlóan diabetes mellitusra jellemzo a szájszárazság és hyposalivatio. Az utóbbi években statisztikai vizsgálatok megállapították, hogy a diabetes mellitussal összefüggésben számos más szájbetegségek gyakrabban fordulnak elo: nyelv atrófiás elváltozások, glossitis, fogágybetegségek, szenzoros elváltozások, például szájégés, ízlelészavar, leukoplakia, lichen oris planus és tumorok. A szerzok szerint legtöbb leukoplakiás eset a diabeteses anyagcserezavar manifesztálódását követo második évben, gyakrabban az inzulinnal kezelt cukorbetegekben figyelheto meg. A perifériás neuropathia gyakori, sokszor a beteg életét megnehezíto, néha csökkent teljesítoképességet vagy akár halált okozó betegség. SS-ában a betegek 20-30 %-a szenved klinikailag perifériás neuropathiában. Neurológiai manifesztációja a betegségnek, gyakran megelozi vagy elfedi a primer SS tüneteit. A diabetes mellitus egyik késoi szövodménye a neuropathia diabetica, amely a motoros, szenzoros és a vegetatív idegrendszert is érinti. A szenzoros neuropathia leginkább paraesthesiák formájában jelentkezik. Elorehaladottabb esetekben a fonákérzés, bizsergés, ill. zsibbadás egyre kifejezettebbé válik, és gyakran fájdalom is megjelenik. Feltételezik, hogy a korai események fontos szerepet játszanak ezen elváltozásokért. Mivel a neuropeptidek szerepet játszanak gyulladásos folyamatokban, ezért feltételezhetjük, hogy a hyposalivatio, xerostomia, valamint a különbözo szájüregi gyulladásos elváltozások kialakulásában is részt vehetnek. A tézisekben összefoglalt kutatások célja a szájüregi képletek idegi szabályozásában részvevo neuropeptid tartalmú idegelemek lokalizációjának és funkcióinak pontos megismerése normál és pathológiás körülmények között, a SS-ban és a diabetes mellitusban, humán és állatkísérletes vizsgálattal. 2
CÉLKITUZÉSEK Vizsgálatainkban a paraszimpatikus, szimpatikus és szenzoros idegrendszer legismertebb neuropeptideket: VIP, SP, CGRP, NPY, SOM, GAL és az enzimek, mint tirozin-?-hidroxiláz (TH - a katecholamin szintézisben résztvevo enzim, és a posztganglionáris szimpatikus idegrostok legjobb markerének tekintjük), és a neuronális nitrogén monoxid szintáz (nnos - nitrogén monoxid képzodésben részvevo enzim) IR idegelemeket mutattuk ki immunhiszto- és immuncitokémiai módszerekkel, valamint immunfluoreszcens technikával a normál és SS-ás betegek kisnyálmirigy biópsziás anyagaiban, valamint egészséges és diabeteses patkánynyelvgyökben. Vizsgálataink során az alábbi célokat tuztük ki: 1. Milyen megoszlásban és lokalizációban találhatók a neuropeptid tartalmú idegrostok a kisnyálmirigyekben, azonbelül az ajakban és nyelvgyökben? 2. Milyen ganglionsejtek találhatók a nyelvgyökben? 3. Megváltozik-e a gyulladásos (pathológiás) körülmények között (Sjögren szindrómában és diabetes mellitusban) a különbözo neuropeptid tartalmú idegrostok mennyisége? 4. Megváltozik-e a gyulladásos (pathológiás) körülmények között a különbözo immunkompetens sejtek száma és muködése? 5. Kimutatható-e kapcsolat a neuropeptid tartalmú idegrostok és az immunkompetens sejtek között? 6. Inzulinkezelés gátolja-e a gyulladásos folyamatokat, az idegrostok számbeli változását? 3
ANYAGOK és MÓDSZEREK Anyagok: 1. Humán anyagok: Vizsgáltuk a biopsziával kivett primer SS-ás betegek (5 fo) és szenzoros neuropathiát mutató primer SS-ás betegek (8 fo) valamint 12 egészséges kontroll egyének ajak kisnyálmirigy biopsziás mintáját vizsgáltuk meg. Primér SS megállapítható volt, ha legalább 4 tesztre pozitív választ kaptunk. A humán vizsgálatokat a betegek írásos hozzájárulásával és az illetékes etikai bizottságok engedélyének birtokában végeztük. A biopsziás anyag kivétele megfelel a Helsinki Alapokmánynak. A humán anyag kivétele helyi érzéstelenítés mellett történt és az anyagokat Zamboni fixálóba helyeztük. 2. Állatkísérletes anyagok: Vizsgálatainkhoz fiatal hím albino Wistar (SE, ÁOK NET Központi Állatház) patkányokat használtunk. A diabetes mellitus kiváltásához az állatok farki vénába egyszer 65 mg/testtömeg kg Streptozotocint adtunk. A farki vénaból vett vércukorszint >16 mmol/ l esetén az állatot cukorbetegnek nyilványítottuk. Az inzulinkezelésben résztvevo diabeteses patkányok napi kétszeri adagban kaptak Ultralente insulint. Egyik csoportba ugyanazon napon beadtunk azonnali inzulint, amikor diabetes mellitust állapítottunk meg. Mások a diabetes kialakulása után egy héttel késleltetett inzulint kaptak, amikor a diabetes mellitus már manifesztálódott. Az állatok vércukorszintjet (4. 5-12. 5 mmol/l) az egyénileg szabott intramuskuláris inzulin dózissal fenntartottuk. A kezeletlen kontroll patkányokat ugyanolyan körülmények között tartották mint a beteg állatokot. Az állatokat 1, 2 és 4 héttel a diabetes kialakulása után mély altatásban Zambóni fixálóval perfundáltuk. Az állatokból a nyelvgyököt eltávolítottuk, majd utófixáltuk. Az eljárásnál a Magyar Állatvédelmi Törvény (243/1998) és a Semmelweis Egyetem állatkísérletekre vonatkozó rendelkezéseinek megfeleloen jártunk el. Módszerek: 1. Fénymikroszkópos immunvizsgálat: A jelzett idegelemek kimutatására avidin-biotin-complex (ABC) technikát valamint diaminobenzidint (DAB) alkalmaztunk. Ni-el intenzifikáltuk. 2. Elektronmikroszkópos immunvizsgálat: Az idegrost-immunsejt kapcsolat kimutatására, az immunsejtek típusának meghatározására, valamint az idegrostokban történo esetleges elváltozás kiderítésére a metszeteket ABC technikával (DAB) dolgoztunk, aztán OsO 4 - al utófixáltuk, dehidráltuk és beágyaztuk. Végül az ultravékony metszeteket a Jeol 100 elektronmikroszkóppal vizsgáltuk. 3. Konfokális mikroszkópos vizsgálat: A nyelvgyökben található ganglionsejtek esetleges neuropeptid kolokálizációjának (SP - FITC-zöld és VIP Alexa 594 piros) kimutatására és az immunhisztokémiai vizsgálatokban elért eredmények megerosítésére BioRad Microradiance Konfokalis lézer szisztémát alkalmaztuk. Kontroll reakció: a primer szérumot kihagytuk az inkubálásból, vagy helyette normál szérumot használtunk, vagy a megfelelo peptiddel immunabszorbeáltuk az inkubáció elott. Kvantitatív analízis: Az IR idegrostok, hízósejtek és hízósejt-idegrost kapcsolatat 15-20 mm 2 szövet területen számoltuk meg és a kapott eredményeket egységnyi területre (1 mm 2 ) vonatkoztattuk. A számoláshoz az egész metszetet vizsgáltuk fénymikroszkóppal 40 szeres nagyításban. Mikrofotografokat csináltunk, digitálizáltunk és számítógép alapú képanalizáló software-el analizáltuk. Statisztikai módszer Az eredmények statisztikai értékeléséhez a Student féle kétmintás t-próbát és a variancia analízist (ANOVA) használtuk. A p < 0.05 esetén az eredményt szignifikansnak tekintettük. 4
EREDMÉNYEK 1. A különbözo neuropeptid/transzmitter tartalmú idegrostok lokálizációja/megoszlása a kontroll csoportokban: A kontroll egyének glandulae labiales: Minden általunk vizsgált neuropeptid tartalmú idegrost megtalálható az ajak kis nyálmirigyeiben különbözo suruséggel és eloszlással. Az IR idegrostok a mirigyvégkamrák körül fészekszeruen helyezkedtek el, számos rost található azonban az erek mellett is és a kivezetocsövek adventitiája körül is. A mirigy egységnyi területére vonatkoztatva legsurubben találhatóak a VIP, NPY, TH és a nnos IR idegrostok. A SP pozitív idegterminálok száma mérsékelt volt és a SOM, CGRP és a GAL jelzett idegrostokat is csak elvétve sikerült kimutatni. Elektronmikroszkópos vizsgálatoknál a jelzett idegrostok számos kis üres és egy-egy nagy szemcsés vezikulát tartalmaztak. A reakció termék minden IR idegrost esetében az axolemma és a vezikulák membrán körül található és enyhén az axoplazmaban diffúzzan is megfigyelheto. IR immunkompetens sejteket semelyik kontroll metszetben nem lehetett találni. Kontroll patkánynyelvgyökben: Az IR idegrostok a patkány nyelvgyök minden rétegében megtalálhatóak különbözo mennyiségben. A SP IR idegrostok foleg a hámban és a hám alatt találhatók. Néhány SP IR rost a mucinózus és a szerózus mirigyvégkamrák (Weber mirigy) körül is láthatók. A jelzett idegrostok surusége és a lokalizációja vonatkozásában nem tudtunk különbséget tenni a kontroll humán ajak kisnyálmirigy és a patkány nyelvgyök mirigyeinek beidegzése között. A NPY és TH IR idegrostokat foleg az erek körül figyeltuk meg. A Weber mirigy mucinózus és szerózus acinusai körül nagy mennyiségu VIP, nnos és NPY IR idegrostok helyezkednek el, melyeknek egy része a kivezeto csövek körül is megfigyelhetok. Az immunsejtek mindig immunnegatívak voltak a vizsgált neuropeptidekre a kontroll anyagokban. Nagyon kevés hízósejt található ezen metszetekben és hízósejt - SP IR idegrost kapcsolatot (3?m-en belül) nagyon ritkán tudtuk megfigyelni. A nyelvgyökben számos kis ganglion figyelheto meg minden rétegben az erek közelében, a mirigyek között, az izomban és a hám alatt. Egy-egy ganglion 2-10 idegsejtbol áll. A sejtek egy része kerek vagy ovális, nagy sejt (30-50?m) és más része közepes (20-30?m) nagyságú többnyúlvánnyal rendelkezo sejt, néha egy-egy kisebb idegsejt szintén megfigyelheto a ganglionban. IR idegsejteket találtunk NPY, VIP, SOM és SP primér szérum inkubálása után. A SP IR idegsejtek nagy része viszont a tunica propriában helyezkedik el, legtöbbször közvetlenül a hám alatt, a sejtek nagy része viszont a közepes és kis idegsejtekhez tartozik, melyeknek egy vagy két nyúlványuk figyelheto meg normál fény- és konfokális mikroszkóppal is. Egy - egy SP pozitív idegsejt azonban az izomrétegben található, ganglionban is elofordul. Kettos immunje lzéssel bizonyítottuk, hogy a hám alatt lévo ganglionsejtekben a SP IR idegsejtek nem mutattak immunreakciót a VIP -pel. Elektronmikroszkópos vizsgálat kimutatta, hogy a ganglionban lévo SP IR idegrostok nagyon közeli kapcsolatban találhatók mind az immunpozitív mind az immunnegatív perikaryonokkal, néha azokkal valódi szinaptikus kapcsolatot is alkotnak. 2. A különbözo neuropeptid/transzmitter tartalmú idegrostok elváltozásai pathológiás körülmények között. SS-ás glandulae labiales: A Sjögren szindrómás anyagokban a gyulladásos területen az idegrostok száma lényegesen kevesebb, mint a kontroll anyagban. A gyulladásos területen néha egy-egy degenerálódott rost is található, melyekben elektronmikroszkoposan sötét, összecsapzódott mitokondriumok és myelin-szeru 5
képletek láthatók. A limfoepithelialis lézió területén, ahol a mirigyvégkamra már teljesen szétesett, ott az összes idegrostok mennyisége szignifikánsan kevesebb a kontrollal összehasonlítva. A szenzoros neuropathiában szenvedo SS-ás betegek esetén az ajak kis nyálmirigy struktúrák morfológiája hasonló volt a kontrollhoz. Nem találtunk a mirigyben sejtkárosodást és fibrózist, ugyanakkor egyes helyeken enyhe limfocitás beszurodés figyelheto meg vagy szétszórtán számos gyulladásos sejt helyezkedik el. Klinikailag ezek a betegek sem tudtak nyálat termelni. Az IR idegrostok száma különbözoképpen változott. A SP, NPY IR idegrostok száma csökkent, ahol a NPY IR idegrostok mennyiségének változása szignifikáns eltérést mutatott. A GAL, VIP IR rostok mennyisége viszont kissé emelkedett. Hasonló változást figyeltünk meg a TH IR idegterminálisok mennyiségének eltérésében, ahol ezen rostok száma szignifikánsan növekedett a kontroll csoporthoz képest. Elektronmiroszkópos vizsgálattal egyes idegterminálok degenerációs jeleket mutattak. Diabetes mellitusban: 1 héttel a diabetes mellitus kialakulása után az IR idegrostok száma csökkent a patkánynyelvgyökben. Azonban 4 hetes diabetes esetén minden általunk vizsgált IR idegrostok száma szignifikánsan megemelkedett a nyelv összterületén a kontroll állatokéhoz viszonyítva. Nagyon suru SP IR idegrost-hálózatot találtunk a papilla vallatae subepithelialis területén és magában a hámban is. Láthatóan megnövekedett a SP, NPY és TH IR idegrostok vastagsága. Egyes metszetben az IR idegsejtek száma is megemelkedett. Fény- és elektronmikroszkópos vizsgálattal egyes területen néhány degenerált idegrostot is lehetett megfigyelni a korai diabetes stádiumában. Inzulinnal kezelt diabeteses állatok: Azonnali inzulinkezelés az IR idegrostok csökkenését kivédte. Az IR idegrostok száma a kontroll anyagok adataihoz hasonló volt. Azonban, a késleltetett inzulinkezelés (1 héttel késobb adott) még tovább növelte majdnem az összes általunk vizsgált IR idegrostok mennyiségét a nem kezelt állatokéhoz képest. Az emelkedés szignifikáns volt a SP, VIP, GAL IR idegrostok esetén. Az inzulin kezelés hatására viszont a TH IR idegrostok száma csökkent. A SP és VIP IR idegsejtek száma is megnövekedett a késleltetett inzulinkezelés hatására. 3-4. Az immunkompetens sejtek változása és kapcsolata az IR idegrostokkal. SS-ás glandulae labiales: A primer SS-ás betegek kisnyálmirigyében az idegrostok mennyisége lecsökkent minden általunk vizsgált neuropeptidre vonatkozóan, a mirigy állomány nekrotizált és egyes területen számos fokális limfocitás infiltrációt figyeltünk meg. Elektronmikroszkópos vizsgálatnál egyes esetben az IR idegrostok egy része közvetlen szinaptikus kapcsolatban figyelhetok meg a mellettük található limfocitákkal és a plazmasejtekkel. A szinaptikus rés az idegrost axolemmája és az immunsejtek membránja között általában 40-200 nm volt, egyes esetben néha még ennél is kisebb. Szenzoros neuropathiás SS-ás glandulae labiales: A szenzoros neuropathiában szenvedo SS-ás betegek kisnyálmirigyében igazi limfocitás infiltrációt nem találtuk, de egyes terület különbözo immunkompetens sejtekkel infiltrált, ahol a szövet gyulladás jeleit mutatta. Ezek a sejtek egyrésze kis kerek sejt (6-10?m), valószínu limfociták, másrészük nagyobb ovális sejtek (15-20?m), melyek egyrésze feltehetoleg plazmasejt és hízósejt lehet. A gyulladás területén az immunkompetens sejtek szám emelkedése mellett néhány sejt immunreaktívitást is mutatott SP-re és NPY-ra. Quantitatív elemzés alapján az összes immunkompetens sejtre vonatkoztatva a sejtek 46.2 %-a SP-re volt IR és 34.4%-a NPY-ra volt IR. Diabetes mellitus: 6
Steptozotocinnal való kezelés után a nyelv lamina propria területe diffúzan infiltrálódott gyulladásos sejtekkel (limfociták, plasmasejtek és hízósejtek). A diabetes mellitus kialakulása után néhány immunkompetens sejt szintén IR-vá vált SP-re és NPY-ra. Az összes immunsejtet figyelembe véve quantitatív elemzés azt mutatta, hogy a sejtek 12.3%-a SP-re IR és 25.4 %-a NPY-ra volt pozitív. A sejtek egy része kicsi, kerek 6-10?m nagyságú sejt (limfociták), más része nagy, ovális sejt 15-20?m nagyságú plasma sejtek valamint hízósejtek. 4 hetes diabeteses állatoknál a hízósejtek száma szignifikánsan megnövekedett (p < 0.05) a nyelv összterületét figyelembe véve. Az IR idegrostok és a hízósejtek közötti kapcsolatok mennyisége szignifikánsan megemelkedett, különösen a SP pozitív idegrost - hízósejt kapcsolata, ahol a növekedés még szignifikánsabb (p < 0.01) volt. Elektronmikroszkópos vizsgálat kimutatta, hogy a SP IR rostok nagyon közeli kapcsolatban találhatók (20-200 nm, néha 1?m) a hízósejtek membránjához. Inzulinnal kezelt diabeteses állatok: Az IR immunkompetens sejtek mennyisége lényegesen csökkent az inzulin kezelés hatására a nyelvgyök minden rétegében. Elvétve vagy egyáltalán nem találtunk sem SP-re sem NPY-ra IR immunkompetens sejteket a metszetekben. 7
MEGBESZÉLÉS A patkányok kisnyálmirigyeinek morfológiája és szövettana a humán kisnyálmirigyekhez hasonló, ezért széles körben alkalmazzák kísérleti modellként. Saját fény- és elektronmikroszkópos immunvizsgálataink is azt bizonyítják, hogy nincs különbség a humán és a patkány kisnyálmirigyek beidegzése között. Az általunk vizsgált neuropeptid tartalmú idegrostok megoszlása és mennyisége hasonló volt mindkét szövetben. A neuropeptid tartalmú idegrostok elhelyezkedésébol és mennyiségébol azok funkciójára lehet következtetni. A VIP tartalmú idegrostok fo muködése feltételezhetoen a mirigy szekréciójának szabályozása és a vérátfolyás serkentése. Feltételezik, hogy e neuropeptidnek trofikus hatása is van, melynek hiánya az acinus atrófiáját eredményezheti. Vizsgálatainkban kimutattuk, hogy a kisnyálmirigyek NPY és SP IR idegrostot tartalmaznak az acinusok és az erek mellett, ezért feltételezzük, hogy nemcsak a vérátfolyást szabályozzák, de szerepük lehet a mirigy szekréciójának változtatásában is. Nagyszámú SP IR idegrost foleg a hámban, a hám alatt és az erek körül a tunica propriaban található, ahol egy-egy SP pozitív perikarion is megfigyelheto. A különbözo IR idegrostok összesített eloszlását eloször írtuk le és mutattunk ki a patkánynyelvgyökben. Lokális ganglionokat már korábban kimutattak a nyelvben, melyben SP, VIP, NPY, GAL, NADPH-d pozitív idegsejteket detektáltak. Elektronmikroszkópos vizsgálatok demonstrálták, hogy a lokális ganglionokban a SP IR idegrostok nagyon közeli kapcsolatban, esetleg szinapszisban találhatók, valamint a kettos jelölésu konfokális mikroszkópos vizsgálatok egyértelmuen bizonyították, hogy a nyelvgyökben lévo SP IR intrinsic perikaryonok nem kolokalizálnak VIP-pel. Ezen eredmények alapján azt feltételezzük, hogy a lokális SP tartalmú idegsejtek és idegrostok képezik az intralingualis reflex afferens szárát. E reflex efferens részét a nyelvben a VIP és NPY IR idegelemek képezhetik, amelyek a mirigyszekréciót és a vérátfolyást befolyásolják. Számos irodalmi adat azt is feltételezi, hogy a különbözo neuropeptidek nagyon fontos szerepet játszanak autoimmun és gyulladásos folyamatok kialakulásában. A legutóbbi irodalmi adatok alátámasztják annak a lehetoségét is, hogy fokális adenitis következtében a helyi idegrostok degenerációja lép fel, kialakul a mirigysejtek atrófiája, ami másodlagosan a nyálelválasztás csökkenését vonja maga után. Vizsgálatainkban a SS-ás kisnyálmirigyek erosen gyulladt területein nem találtunk IR idegrostokat, csak néhány degenerált rostot sikerült kimutatni elektronmikroszkópos vizsgálattal, ami alátámasztja a többi kutató eredményeit. Az általunk vizsgált szenzoros neuropathiában szenvedo SS-ás betegek ajak kisnyálmirigyében, ahol sem fokális limfocitás infiltráció sem fibrózis nem alakult ki, különbözo gyulladásos sejteket lehetett látni melyek egy része szintén immunpozitív volt SP és NPY-ra - és a neuropeptid tartalmú idegrostok mennyisége is megváltozott. Az irodalmi adatok és saját eredményeink alapján feltételezzük, hogy a neuropeptid szint egyensúlyának felbomlása szerepet játszhat a SS pathogenezisében. A neuropeptidek egy része, mint a gyulladás neurogén komponense hatással van az immunkompetens sejtek muködésére (aktiválásuk, gátlásuk), így részt vehet a fokális limfocitás infiltráció kialakulásában is. Lehetséges, hogy az idegterminálisokból és az immunkompetens sejtekbol felszabaduló neuropeptidek direkt hatnak az acinussejtekre, erekre és más immunsejtekre, melyekbol gyulladásos faktorok szabadulnak fel, így súlyosbítva a gyulladásos folyamatokat, ennek következményeként idegdegeneráció, acinus atrófia, apoptózis és nekrózis jön létre. A neuropeptid tartalmú idegrostok mennyisége és lokalizációja megváltozik diabetes hatására. Kísérleteinkben a különbözo IR idegrostok száma egy hetes diabetes mellitus esetén csökkent, míg 4 hetes diabetes fennállása esetén szignifikánsan emelkedett. A gyulladás kezdetén a raktározódott neuropeptidek kiürültek, így a neurogén gyulladásban résztvevo neuropeptidek (SP, CGRP) szerepet játszhatnak a gyulladás korai kialakításában. 2 és 4 hetes diabetesben ezen neuropeptidek mennyisége mind a sejtekben, mind az idegterminálisokban megemelkedett. Felszabadulnak az intracelluláris raktárukból, majd pótlódnak, és fokozott szintézissel pótlódnak, ami peptidenként eltéro ideig tart. A rövid távú diabetes mellitusos modellünkben eleinte a neuropeptid tartalmú idegrostok mennyisége csökkent, késobb azok száma szignifikánsan emelkedett. A diabetes mellitus egyik késoi szövodménye a neuropathia diabetica, amely az összes idegrostot érinti, így a mozgató és érzo idegrostokon túl a vegetatív idegrendszer muködése is 8
károsodik. Az ideg regenerációja egyidejuleg létezik annak degenerációjával, és az utóbbi túlsúlyban van. Az idegrostok csökkent regenerációs kapacitása valószínuleg a károsodott neurotrofikus faktorok hatása miatt következik be. Hosszan tartó diabetesben, a diabeteses betegeknél és a kísérleti állatokban a perifériás szövet NGF szintézise, valamint ennek retrográd axonális transzportja csökkent. A 4 hetes diabeteses kísérleti modellben az IR idegrostok számának szignifikáns emelkedése és vastagságbeli növekedése valószínuleg az idegrostok regenerációjával, elágozódásával (sprouting), proliferációjával és/vagy a neuropeptidek fokozott szintézisével (mrns upreguláció) magyarázható. Az utóbbi évtized irodalmi adatai ellentétes eredményeket dokumentálnak az inzulin kezelés hatásairól. A szerzok megfigyelték, hogy az inzulinnal kezelt betegeknél gyakrabban fordulnak elo szájüregi megbetegedések. Az irodalmi adatok alapján az inzulinkezelés megváltoztatja a különbözo neurotranszmitterek mennyiségét: vagy stimulálja a szintézisét a központi idegrendszer különbözo régióiban, vagy csökkenti azok termelodését. Kísérleti modellünkben az azonnali inzulinkezelés (diabetes kialakulásával egyidoben adott inzulin) kivédte az idegrostok degenerációját és a neuropeptid tartalmú idegrostok számának változását. A késleltetett inzulinkezelés (amikor a diabetes már manifesztálódott) hatására az általunk vizsgált minden neuropeptid tartalmú IR idegrost száma még tovább emelkedett a nem kezelt állatokhoz képest. Leírták azt is, hogy az inzulin neurotrofikus hatással bír. Ha már elkezdodött a diabeteses gyulladás, ahol feltételezhetoen szabad gyökhatás, NGF szintváltozás is kialakul, a gyulladásos sejtek elkezdenek infiltrálódni, a késoi inzulinkezelésnek valószínu nincs már olyan preventív hatása. A kialakult diabetesben adott inzulin csökkenti gyulladást és az immunkompetens sejtek immunreaktivitását SP-re és NPY-ra. Az eredményeink alapján feltételezzük, hogy a gyulladásban az inzulin tovább emeli a neuropeptidek szintézisét és fokozza az idegelemek proliferációját. Már régóta ismert tény, hogy a pszihés állapot és az idegrendszer muködése befolyásolja az immunrendszer muködését. A SP és a hízósejtek is részt vesznek az axonreflexben, és ez a reflex felelos a károsító stimulusok hatására bekövetkezett gyulladásos reakciókért (vazodilatáció, neurogén gyulladás). Mind a hízósejtszám mind a hízósejt-idegrost kapcsolat száma megemelkedik különbözo pathológiás körülmények között, mint például rheumatoid arthritisben, perifériás neuropathiában, gyulladásos bél megbetegedésekben és infekciók kapcsán. Neurogén gyulladás hatására a hízósejtek degranulálódnak és az általuk termelt számos vazoaktív, proinflammatorikus anyag és nociceptív mediátor, beleértve a hisztamint, citokineket és proteolitikus enzimeket, szöveti gyulladást eredményezhet. Azt is bizonyították, hogy a hízósejteken kívül más immunsejtek is felelosek a különbözo elváltozásokért. Valószínu, hogy a hízósejtek indító szerepet is játszanak a gyulladásos folyamatokban, mely tovább aktiválja a többi immunsejtet és azok aggregációjához vezet. Mindkét gyulladásban (a SS-ás kisnyálmirigyben valamint a diabeteses patkánynyelvgyökben) az immunkompetens sejtek egy része SP-re és NPY-ra is immunreaktív volt, ami annak aktivált állapotát tükrözi. Az irodalmi adatok alapján ismeretes, hogy számos immunsejt (aktiválódott limfociták és makrofagok) is képes különbözo körülmények (gyulladás és sérülés) hatására neuropeptideket termelni és ugyanazon peptidreceptorokat expresszálni. Az aktivált immunsejtekbol felszabadult neuropeptidek együtthatva fokozhatják a gyulladást. Ezáltal az aktiválódott immunkompetens sejtek további gyulladásos faktorokat is felszabadíthatnak és szövetkárosodást idézhetnek elo. A neurotranszmitterek és a neuropeptidek az idegrostok szinaptikus vezikuláiban raktározódnak, aktiválásukkor felszabadulnak és diffúz módon érik el a környezetben található összes effektor sejtet. Fiziológiás és morfológiai vizsgálatok alapján a neuroeffektor kapcsolatban a pre- és a posztszinaptikus elemek közötti rés 200-300 nm, vagy akár 2? m távolság is lehet. Kísérleti modellünkben és humán szájüregi gyulladásban a neuropeptid tartamú idegrostok és immunsejtek nagyon közeli kapcsolatban (20nm-1? m) találhatók, ami a közvetlen idegimmunrendszer közötti kapcsolatot támasztja alá. Gyulladás hatására az immunsejtek egyrésze is neurope ptid immunreaktiv (SP, NPY) lett, ami azt feltételezi, hogy ezen neuropeptidek tovább fokozzák a pathológiás folyamatot, az idegi elváltozásokat (degeneráció, regeneráció, proliferáció). 9
KÖVETKEZTETÉSEK A megfelelo mennyiségu és mínoségu nyálelválasztás fontos szerepet játszik a száj homeosztázisának fenntartásában, a hyposalivatio akadályozza a falatképzodést, nyelést, zavarja a beszédet, fokozódik a cariesképzodés, gyakoribb a gingivitis, parodontitis, gombás fertozés és az elhúzódó sebgyógyulás. Sjögren szindróma és diabetes mellitus pathogenesisében dönto szerepe lehet a neuropeptid tartalmú idegelemek változásának, mely a gyulladásos folyamatok kialakulásában és fenntartásában is résztvehetnek. E két betegség pathogenezisében számos hasonló tényezo játszik szerepet és hasonló elváltozások alakulnak ki. Következményként az immunkompetens sejtek szintén szintetizálhatnak bizonyos neuropeptideket, melyek tovább fokozzák a gyulladásos reakciót, visszahathatnak az idegelemekre. A hatásukra felszabaduló különbözo biogén anyagok a környezo szövetekben apoptózist, nekrózist, idegi regenerációt, proliferációt is eredményezhetnek. Mindez hozzájárulhat a szájüregi pathológiás elváltozásokhoz (lichen oris planus, leukoplakia, tumor). A folyamat messze nem egyszeru, számos más tényezo, így a környezet, nikotin, alkohol és egyéb faktorok is közremuködhetnek. 10
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönetet szeretnék mondani mindazoknak, akik segítették munkámat. Oszinte köszönettel tartozom Prof. Dr. Fehér Erzsébet Tanárnomnek, az Orális Morfológiai Csoport Vezetojének, aki lehetové tette számomra, hogy PhD hallgatóként nála dolgozzam. Köszönöm, hogy munkámat kiváló tudományos felkészültségével irányította és állandó figyelemmel kísérte, fáradhatatlanul segített a kutatásban, a publikációk és az értekezés elkészítésében. Köszönöm a témavezetomnek Prof. Dr. Zelles Tivadarnak, aki vállalta a PhD témavezetoi szerepet, továbbá köszönettel tartozom a témaválasztáshoz nyújtott értékes javaslataiért, a kutatásban nyújtott segítségéért, értékes tanácsaiért és bizalmáért. Köszönöm Prof. Dr. Fazekas Árpád, egyetemi tanárnak programvezetoi és Prof. Dr. Tulassay Zsoltnak a TDI vezetoi munkáját. Köszönettel tartozom Prof. Dr. Réthelyi Miklósnak és Prof. Dr. Csillag Andrásnak az Anatómia i, Szövet- és Fejlodéstani Intézet volt és jelen igazgatóinak, hogy lehetové tették, hogy Intézetükben a legkorszerubb morfológiai technikákat alkalmazhattam. Hálás vagyok Dr. Gallatz Katalinnak, az értékes szakmai tanácsaiért, Dr. Nagy Gábornak és Dr. Kövesi Györgynek, Dr. Vér Ágotának és Prof. Dr. Somogyi Jánosnak a közös kísérletekhez nyújtott segítségükért. Köszönöm Burka Éva Beatrix asszisztensnomnek, a különbözo kísérleti módszerek elsajátításához és elvégzéséhez nyújtott segítségéért és Dr. Altdorfer Károlynak, kollégámnak a cikkek és a tézisem korrekcióiban nyújtott segítségért. Köszönöm Kiss József intézeti fotósnak a csodálatos fotókat. Deák Szilvinek, az intézeti állatház gondozójának a sikeres állatkísérletek elvégzéséhez nyújtott segítséget. Továbbá az Anatómiai Intézet minden munkatársainak, akik segítették a munkámat. Köszönetet szeretnék mondani a Mongol Állami Orvostudományi Egyetemi Fogorvostudományi Kar munkatársainak, hogy lehetové tették, hogy Magyarországon PhD hallgatóként tanulhassam. Köszönöm a családomnak: Édesanyámnak és Édesapámnak, akik türelmesen vártak rám, támogattak, biztottak végig a távollétem során. Barátomnak Baatar Arvinbayarnak, aki kezdeményezte és végig biztatott a PhD munkám során. 11
Az értekezés témakörében megjelent saját közlemények jegyzéke Cikkek: 1. Batbayar B, Fehér E, Nagy G, Zelles T. A kis nyálmirigyek beidegzésében résztvevo idegelemek változása Sjögren szindrómában. Orvosi Hetilap, 2002; 143 (26): 1585-1588. 2. Batbayar B, Somogyi J, Zelles T, Fehér E. Immunohistochemical analysis of substance P containing nerve fibres and their contacts with mast cells in the diabetic rat's tongue. Acta Biologica Hungarica 2003; 54: 275-283. IF= 0. 309 3. Batbayar B, Nagy G, Kövesi G, Zelles T, Fehér E. Morphological basis of sensory neuropathy and neuroimmunomodulation in minor salivary glands of patients with Sjögren's syndrome. Arch Oral Biol 2004; 49: 529-538. IF=1. 098 4. Batbayar B, Zelles T, Vér Á, Fehér E. Plasticity of the different neuropeptide containing nerve fibres in the tongue of the diabetic rat. J Peripheral Nerv Sys accepted for publication, 2004. IF=2. 633 Idézheto absztraktok: 1. Batbayar B, Fehér E, Nagy G, Zelles T. Changing of the immunoreactive nerve fibers in the minor salivary glands in Sjögren's syndrome. Magyar Gastroenterológiai Társaság 44. Nagygyulése Balatonaliga. Z Gastroenterologie 2002; 40: 328. IF=0. 837 2. Batbayar B, Fehér E, Vér Á, Zelles T. Changes of the different neuropeptide containing nerve fibres in the root of the diabetic rat's tongue. Clinical Neuroscience/Idegtudományi Tudományok c. folyóirat mellékleteként. Magyar Idegtudományi Társaság (MITT) IX. Konferencia. Balatonfured, 2003. Clinical Neuroscience/Idegtudományi Szemle 2003; 56 (2). 3. Batbayar B, Fehér E, Vér A, Zelles T. Changes of the mast cell - immunoreactive nerve fiber interactions in the diabetic rat's tongue. Magyar Gastroenterologiai Társaság 45. Nagygyulése Balatonaliga 2003 Z. Gastroenterologie 2003; 41: 430. IF=1. 076 4. Fehér E, Batbayar B, Vér Á, Altdorfer K. Changing of immunoreactive nerve fibres in the small intestine in diabetes mellitus. Magyar Gastroenterologiai Társaság 45. Nagygyulése, Balatonaliga 2003. Z. Gastroenterologie 2003; 41: 435. IF=1. 076 5. Batbayar B, Fehér E, Vér Á, Zelles T. Changes in the different neuropeptide containing nerve fibres in the tongue of the diabetic rat. 81-st General Session of the IADR, Göteborg, Sweden, J Dent Res 2003; 82 (Spec Iss B) B-159. IF=2. 702 6. Batbayar B, Nagy G, Kövesi G, Zelles T, Fehér E. Morphological basis of sensory neuropathy and neuroimmunomodulation in minor salivary glands of patients with Sjögren's syndrome. 99. Versammlung. Verhandlungen der Anatomischen Gesellschaft, Supplement zum 189. Band des Anatomischen Anzeigers-Annals of Anatomy. Wien, Austria, 2004; 189: 79. 7. Fehér E, Sipos G, Altdorfer K, Batbayar B. Changing of the different neuropeptide containing nerve fibres and immunocompetent cells in the gastritis. 99. Versammlung. Verhandlungen der Anatomischen Gesellschaft, Supplement zum 189. Band des Anatomischen Anzeigers-Annals of Anatomy. Wien, Austria, 2004; 189: 98. 8. Batbayar B, Nagy G, Zelles T, Fehér E. Immunohisto-and cytochemical examinations in labial salivary glands from Sjögren's syndrome patients with sensory neuropathy. Z Gastroenterol 2004; 42: 405. IF=1. 076 9. Altdorfer K, Batbayar B, Fehér E. Intestinal neurotransmitters and PARS activation in streptozotocin induced diabetic rats. Z Gastroenterol 2004; 42: 404. IF=1. 076 10. Sipos G, Batbayar B, Altdorfer K, Fehér E. Immunohistochemical analysis of the different neuropeptide containing nerve fibres and immunocompetent cells in the gastritis. Z Gastroenterol 2004; 42: 437. IF=1. 076 Tudományos Eloadások: 1. Batbayar B, Fehér E. A hízósejt-idegrost kapcsolat mennyiségének összehasonlítása normál és diabeteszes patkány nyelvgyökében. Ph.D. Tudományos napok, Budapest, 2002. 12
3. Batbayar B, Fehér E, Nagy G, Zelles T. Changing of the immunoreactive nerve fibers in the minor salivary glands in Sjögren's syndrome. Magyar Gastroenterológiai Társaság 44. Nagygyulése Balatonaliga 2002. 4. Batbayar B, Fehér E, Nagy G, Zelles T. Changing of the nerve elements innervatinmg the minor salivary glands in Sjögren's syndrome. XVII International Symposium on Morphological Sciences. Timisoara Romania, 2002. 5. Fehér E, Batbayar B, Altdorfer K, Somogyi J, Zelles T. Immunohistochemical localization of mast cell-nerve interactions in the tongue of the rat. European Festival Of Oral Science. Inaugural Meeting of Pan European Federation. Cardiff, Wales, UK, 2002. 6. Batbayar B, Fehér E, Vér Á, Zelles T. Changes of the different neuropeptide containing nerve fibres in the root of the diabetic rat's tongue. Magyar Idegtudományi Társaság (MITT) IX. Konferencia. Balatonfured, 2003. 7. Batbayar B, Fehér E, Vér A, Zelles T. The effect of streptozotocin induced diabetes on the nerve fibres in the tongue of the rats. Ph.D tudományos napok, Budapest, 2003. 8. Batbayar B, Fehér E, Vér A, Zelles T. Changes of the mast cell - immunoreactive nerve fiber interactions in the diabetic rat's tongue. Magyar Gastroenterologiai Társaság 45. Nagygyulése Balatonaliga 2003. 9. Batbayar B, Fehér E, Vér Á, Zelles T. Changes in the different neuropeptide containing nerve fibres in the tongue of the diabetic rat. 81-st General Session of the IADR, Göteborg, Sweden, 2003. 10. Batbayar B, Nagy G, Kövesi G, Zelles T, Fehér E. Morphological basis of sensory neuropathy and neuroimmunomodulation in minor salivary glands of patients with Sjögren's syndrome. 99. Versammlung. Verhandlungen der Anatomischen Gesellschaft, Wien, Austria, 2004. 11. Fehér E, Sipos G, Altdorfer K, Batbayar B. Changing of the different neuropeptide containing nerve fibres and immunocompetent cells in the gastritis. 99. Versammlung. Verhandlungen der Anatomischen Gesellschaft, Wien, Austria, 2004. 12. Batbayar B, Nagy G, Zelles T, Fehér E. Immunohisto-and cytochemical examinations in labial salivary glands from Sjögren's syndrome patients with sensory neuropathy. Magyar Gastroenterológia Társaság 46. Nagygyulése, Balatonaliga, 2004. 13. Altdorfer K, Batbayar B, Fehér E. Intestinal neurotransmitters and PARS activation in streptozotocin induced diabetic rats. Magyar Gastroenterológia Társaság 46. Nagygyulése, Balatonaliga, 2004. 14. Sipos G, Batbayar B, Altdorfer K, Fehér E. Immunohistochemical analysis of the different neuropeptide containing nerve fibres and immunocompetent cells in the gastritis. Magyar Gastroenterológia Társaság 46. Nagygyulése, Balatonaliga, 2004. 13