Ph.D. értekezés AZ α 1 -SAVAS GLIKOPROTEIN SZORPCIÓS TULAJDONSÁGAINAK FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS VIZSGÁLATA ÉS GYÓGYSZERANALITIKAI ALKALMAZÁSA Gyimesiné Forrás Krisztina Témavezető: Dr. Szász György Professor Emeritus, a kémiai tudomány doktora SEMMELWEIS EGYETEM GYÓGYSZERÉSZI KÉMIAI INTÉZET 2001.
Ph.D. értekezés Az α 1 -savas glikoprotein szorpciós tulajdonságainak folyadékkromatográfiás vizsgálata és gyógyszeranalitikai alkalmazása Gyimesiné Forrás Krisztina Témavezető: Dr. Szász György Professor Emeritus, a kémiai tudomány doktora Budapest, Semmelweis Egyetem Doktori Iskola, 2001 Program: A gyógyszerészeti tudományok korszerű kutatási irányai Összefoglaló A bio- és gyógyszermolekulák analitikai meghatározásának világviszonylatban legelterjedtebb módszere a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia. Rohamosan terjed ezen belül is a királis molekulák vizsgálata, amit az a felismerés tett indokolttá, hogy az enantiomerek hatásának erősségében, esetleg a hatás jellegében és toxicitásában alapvető eltérések mutatkozhatnak. Az enantiomerek elválasztása, mennyiségi meghatározása és tisztaság vizsgálata napjainkban elengedhetetlen és időszerű gyógyszeranalitikai feladatok. Disszertációs munkámban célul tűztük ki a szervezetben is jelenlévő α 1 -savas glikoprotein (AGP) alapú királis állófázis szorpciós tulajdonságainak vizsgálatát, amely az enantioszelektivitás szempontjából alapvető fontosságú lehet. A kötődési vizsgálatokkal újabb adatokat szolgáltattunk a kromatográfiás mechanizmus tekintetében is, amely az irodalmi adatok alapján még kevéssé tisztázott. Ezen ismeretek alapján lehetőség nyílik adott gyógyszeranalitikai feladatok megoldására alkalmas mozgó fázis összetételek tervezésére, beleértve a preparatív elválasztást is. Elsőként szolgáltattunk adatokat az alacsony dielektromos állandójához képest igen nagy elúciós erejű dioxán kötődésére. Megállapítottuk, hogy mind az acetonitril, mind a dioxán kötődése phfüggő: ph=7,2-nél telítési görbét ír le, míg ph=4,0-nél kétlépcsős, monoton görbével jellemezhető, amit a szelektor konformációváltozásával értelmeztünk. A konformációváltozás követésére és igazolására natív AGP-vel modellvizsgálatokat végeztünk. A kötődési meghatározás eredményeivel összhangban CD-spektroszkópiával megállapítottuk, hogy ph=4,0- nél az acetonitril koncentráció emelésével az α-hélix szerkezetre jellemző CD-spektrum jelenik meg. Ezzel szemben ph=7,2-nél az acetonitril koncentráció növelése nem idéz elő érdemi változást a spektrumban. Az AGP fluoreszcencia-kioltásos vizsgálatával először határoztuk meg 2,2,2-triklór-etanol felhasználásával adott acetonitril koncentrációk jelenlétében az effektív dinamikus kioltási állandókat. Egyezésben a CD mérések eredményeivel megállapítottuk, hogy a savas tartományban növekvő acetonitril koncentrációk esetében a kioltó hatás nő, amit az AGP triptofán-részek fokozódó belső mozgásával magyarázunk. A fenti eredményeket is figyelembe véve, savas (ibuprofen), bázikus (propranolol) és semleges (norgesztrel) gyógyszermolekulák felhasználásával új, gyógyszerkönyvi enantiomer tisztaság vizsgálati célra alkalmas, validált módszereket dolgoztunk ki. 2
Ph.D. Thesis Investigation of the sorption properties and pharmaceutical application of α 1 acid glycoprotein by liquid chromatography Krisztina Gyimesi-Forrás Prepared under guidance of Prof. Dr. György Szász D.Sc., in the Institute of Pharmaceutical Chemistry, Semmelweis University, School of Ph.D. Studies, in 2001 Programme: Recent trends in pharmaceutical sciences Summary High performance liquid chromatography is the most widely used method for the analytical determination of bio- and drug molecules. The investigation of chiral substances is rapidly developing within that field, because it has been recognized that the pharmacodinamic effect, efficacy and also the toxicity of the enantiomers may differ. The separation and quantitation of the enantiomers and also the determination of the enantiomeric purity are all current and indispensable tasks for the pharmaceutical analysis. The aim of this work was to study the sorption properties of the α 1 acid glycoprotein (AGP) based stationary phase, which may have crutial importance for the enantioselectivity. New binding data are presented for the mechanism of the chromatographic separation, which has not clarified in the literature yet. On the basis of these new findings the composition of the mobile phase for a given analytical separation can be designed, including the preparative separation, as well. Binding data for dioxan, known as a solvent with low dielectric constant, are determined at first time. It was found that the sorption of both acetonitrile and dioxane is ph-dependent: as at ph 7.2 the binding can be characterized by a saturation curve, while at ph 4.0 by a twostep, monotone curve. The ph-dependence of the adsorption has been explained by conformational changes of the selector, which were confirmed by CD-spectroscopic and fluorescence quenching study of the native AGP. In accordance with the binding study by increasing the acetonitril percentage at ph 4,0 a tipical α-helical peak was obsereved in the CD-spectrum. Opposite that at ph 7.2 the increase in the acetonitrile content does not result in any changes in the spectra. Effective dynamic quenching constants of AGP have been determined at given acetonitrile concentrations using 2,2,2-trichloroethanol as fluorescence quencher. In agreement with the results of the CD measurements at ph 4.0 it was found that the degree of quenching enhanced by increasing the amount of the acetonitrile, that can be explained by enhanced exposure of the buried tryptophan residues. Taking these results into account, new optimized and validated HPLC methods have been developed for compendial control in testing the enantiomeric purity of an acidic (ibuprophen), a basic (propranolol) and a neutral (norgestrel) drug molecule. 3
TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS 6 2. CÉLKITŰZÉSEK 7 3. IRODALMI HÁTTÉR 8 3.1. A királis gyógyszervegyületek bevezetésének indokai és korlátai 8 3.2. Az enantiomer tisztaság meghatározása 10 3.1.1. Az enantiomer arány közvetlen meghatározásának módszerei 11 3.1.2. Az enantiomerek elválasztásán alapuló módszerek 15 3.1.2.1. Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás (HPLC) módszerek 17 3.1.2.1.1. Királis származékképzést követő elválasztás 17 3.1.2.1.2. Királis mozgó fázis additívek alkalmazása 19 3.1.2.1.3. Királis állófázisok alkalmazása 21 3.1.2.1.3.1. Az AGP-alapú folyadékkromatográfiás állófázis 28 3.1.2.1.3.1.1. Az AGP szerkezete 28 3.1.2.1.3.1.2. Az AGP tulajdonságai 32 3.1.2.1.3.1.3. Az állófázis előállítása 34 3.1.2.1.3.1.4. Az állófázis alkalmazása 35 3.1.2.1.3.1.5. Az állófázis stabilitása 37 4. KÍSÉRLETI RÉSZ 39 4.1. Anyagok, eszközök 39 4.1.1. Vegyszerek, modellvegyületek 39 4.1.2. Eszközök, készülékek 40 4.2. Vizsgálati módszerek 41 4.2.1. Az állófázis szorpciós tulajdonságainak gázkromatográfiás vizsgálata 41 4.2.2. Cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópiás vizsgálat 43 4.2.3. Fluoreszcencia-kioltásos vizsgálat 44 4.2.4. Az enantiomer tisztaság meghatározására szolgáló új módszerek 45 4.2.4.1. Az S-(+)-ibuprofen vizsgálata 46 4.2.4.2. Az S-( )-propranolol vizsgálata 47 4.2.4.3. A D-( )-norgesztrel vizsgálata 48 4.2.5. 4(3H)-kinazolon származékok enantiomerjeinek elválasztása 48 5. AZ EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK 49 4
5.1. Új adatok a Chiral-AGP oszlop szorpciós tulajdonságaihoz 49 5.2. A natív AGP CD-spektroszkópiás vizsgálata 57 5.3. A natív AGP fluoreszcencia-kioltásos vizsgálata 59 5.4. A Chiral-AGP oszlop gyógyszeranalitikai alkalmazásai 64 5.4.1. Az enantiomer tisztaság meghatározására alkalmas 64 módszerek kidolgozása 5.4.1.1. Az S-(+)-ibuprofen enantiomer tisztaságának meghatározása 71 5.4.1.1.1. Vizsgálati módszer 71 5.4.1.1.2. Validálási teljesítményjellemzők 71 5.4.1.2. Az S-( )-propranolol enantiomer tisztaságának meghatározása 74 5.4.1.3. A D-( )-norgesztrel enantiomer tisztaságának meghatározása 76 5.4.2. Új 4(3H)-kinazolon származékok enantiomerjeinek elválasztása 79 6. MEGBESZÉLÉS 87 6.1. Az eredmények összefoglalása 87 6.2. Az eredmények hasznosítása 88 7. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 89 8. IRODALOMJEGYZÉK 90 9. MELLÉKLET 105 5
1. BEVEZETÉS Az azonos konstitúciójú, de eltérő konfigurációjú bio- és gyógyszermolekulákat az élő szervezet teljesen különböző ágensként ismeri fel. Az utóbbi évtizedek gyógyszerkutatásai igazolták, hogy a racém hatóanyagok enantiomerjei hatásának erősségében, esetleg jellegében és toxicitásában is alapvető eltérések mutatkozhatnak. Ennek ellenére jelenleg az tapasztalható, hogy a gyógyszerek terápiás felhasználásában és a gyógyszerkönyvekben továbbra is többségben szerepelnek a racém módosulatok. Ennek oka elsősorban a királis szintézis és az elválasztás költségessége. Ugyanakkor egyre gyakoribb, hogy a farmakológiai hatást hordozó, eutomer forma a hivatalos. Várható és remélhető, hogy a jövőben mind nagyobb számban kerülnek forgalomba a hatásos konfigurációs izomert tartalmazó gyógyszervegyületek, mivel a disztomert minden esetben potenciális szennyezésnek kell tekinteni, amely a szervezet méregtelenítő rendszerét terheli és nemkívánatos mellékhatások előidézője lehet. Következésképpen az enantiomer tisztaság a gyógyszeripari termék piacképességének feltétele, amelynek vizsgálata a gyógyszerellenőrzés szempontjából elengedhetetlen és időszerű feladat. A gyógyszer-törzskönyvező hatóságok az új racém gyógyszermolekulák engedélyezéséhez a nemzetközi irányelveknek megfelelően ma már a farmakokinetikai és a farmakodinámiás paraméterek meghatározását a racém vegyületre és az egyes enantiomerekre külön-külön is előírják. A fentiekből következik, hogy a gyógyszerfejlesztés és a gyógyszerellenőrzés céljára jól reprodukálható, nagy érzékenységű sztereoszelektív analitikai módszerekre van szükség, amelyek közül napjainkban a királis nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) bizonyult legalkalmasabbnak. Az enantiomerek elválasztására jelenleg legelterjedtebb a királis állófázisok használata, közülük igen jelentősek a fehérje alapú, azaz biomimetikus szorbensek. Kézenfekvő volt ugyanis az a felismerés, hogy a szervezetben funkcionáló fehérjéket a kromatográfiás gyakorlatban is felhasználják. Egyike az elsőként alkalmazott szelektoroknak a Hermansson által immobilizált α 1 -savas glikoprotein (AGP), amely különböző kémiai szerkezetű vegyületek enantiomerjeinek elválasztására alkalmas és amelyet napjainkban is széles körben használnak gyógyszerkémiai, valamint gyógyszeranalitikai kutatási célokra. 6
2. CÉLKITŰZÉSEK Jelen munka keretében célul tűztük ki a gyakorlatban használt különböző eluens-összetételek mellett, az AGP, ezen sajátos szerkezetű fehérje adszorpciós tulajdonságainak vizsgálatát, ami az enantioszelektivitás szempontjából alapvető fontosságú lehet. E célkitűzést annál inkább indokoltnak tartottuk, mivel az irodalmi adatok alapján az AGP-alapú oszlopon működő elválasztási mechanizmus még kevéssé tisztázott. Mivel ez utóbbi folyamatban igen jelentős tényező lehet a szelektor konformációváltozása, ennek igazolására, ill. követésére, natív AGP felhasználásával, cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópiás, valamint fluoreszcencia-kioltásos vizsgálatokat terveztünk beiktatni a kötődési meghatározásokkal azonos kísérleti körülmények mellett. A fenti kutatás eredményeit is felhasználva további célul tűztük ki a Chiral- AGP folyadékkromatográfiás oszlop gyógyszeranalitikai felhasználásának szélesítését. E munka keretében különböző kémiai szerkezetű királis gyógyszermolekulák enantiomerjeinek elválasztására alkalmas, új kromatográfiás rendszereket kívántunk kifejleszteni. Arra törekedtünk, hogy a kidolgozott elválasztási módszerek egyaránt alkalmasak legyenek az enantiomerek (1) azonosítására; (2) mennyiségi meghatározására és (3) megfelelő érzékenységű tisztaság vizsgálatára. E célkitűzést azért is tartottuk indokoltnak, mert a gyógyszerkönyvekben az enantiomer tisztaság ellenőrzésére szelektív vizsgálat alig szerepel, általában csupán a fajlagos forgatóképesség értékének meghatározását írják elő. Mivel az AGP-t az említett feladatokra alkalmas királis szelektornak véltük, célul tűztük ki, hogy a kifejlesztett módszerek modellként is szolgáljanak, tehát minél szélesebb körben felhasználhatók, standardizálhatók, gyógyszerkönyvi célra is alkalmasak legyenek. Szem előtt tartottuk azt is, hogy az optimált rendszerek alkalmasak legyenek a gyógyszeranyagok és gyógyszerkészítmények enantiomer-stabilitásának ellenőrzésére, valamint az ipari méretekben történő sztereoszelektiv szintézis reakciólépéseinek és köztitermékeinek nyomonkövetésére, továbbá alapul szolgáljanak az AGP oszlopon végzett preparatív munkához is. 7
3. IRODALMI HÁTTÉR 3. 1. A királis gyógyszervegyületek bevezetésének indokai és korlátai Az enantiomerek előállítására és elválasztására alkalmas sztereoszelektív módszerek megjelenésével az elmúlt 20 év alatt a gyógyszerfejlesztés, a gyógyszerkutatás, a gyógyszerellenőrzés és a gyógyszertörzskönyvezés területén a kiralitás jelentősége nagymértékben megnövekedett [1-3]. Az Európai Unió, Japán és az Amerikai Egyesült Államok gyógyszertörzskönyvező hatóságainak a királis vegyületekkel szemben támasztott követelményei 1991 óta a harmonizációs törekvések eredményeként közelítenek egymáshoz [4-6]. Az ICH (International Conference on Harmonization) irányelvek a gyógyszerek nemzetközi piacképességét szolgálják a megfelelő gyógyszerminőség, biztonság és hatásosság szavatolása mellett. A gyógyszer-törzskönyvezéshez szükséges validált, analitikai meghatározásokat a farmakokinetikai és a farmakodinámiás vizsgálatok eredményei együttesen szabják meg és valamennyi gyógyszermolekula esetén a hatóság egyedi elbírálással él. A gyógyszergyártónak azt is meg kell indokolnia, ha az eutomer forma helyett a racém módosulat kifejlesztése mellett dönt. Ilyen okok közé tartozik például: (1) az in vivo egyirányú konfigurációs átalakulás, ami a nem-szteroid gyulladásgátló (NSAID) 2-aril-propionát származékok körében megy végbe. Az ibuprofen S-(+)-enantiomerje in vitro 160-szor hatékonyabb ciklooxigenáz (COX)-gátló, mint az R-( )-antipód, azonban in vivo ez a különbség alig érzékelhető, ami az inaktív R-( )-enantiomer S-(+)-izomerré történő egyirányú, sztereoszelektív metabolikus átalakulásának a következménye [7]; (2) a két enantiomer közel azonos hatáserőssége, amikor az eutomer használata nem jár klinikai előnyökkel, mint pl. a propafenon esetében [8]; (3) az in vivo racemizáció pl. oxazepám [9]; (4) a két izomer egymás hatását erősítő kölcsönhatása pl. a levometorfán analgetikus hatása az antipód jelenlétében szignifikánsan nő, mivel az inaktív dextrometorfán gátolja az eutomer metabolikus eliminációját [10]. Az utóbbi években a hatóságok részéről egyre nagyobb az igény a tiszta eutomer tartalmú gyógyszervegyületek forgalomba hozatala iránt. Ezzel párhuzamosan megfigyelhető, hogy a gyógyszergyárak számos, régebb óta racém vegyületként használt farmakon hatékony enantiomerjének kifejlesztése mellett döntenek, elsősorban 8
a kedvezőbb terápiás hatás biztosítása, a káros mellékhatások elkerülése és nem utolsó sorban a piacképesség érdekében. Így például az antihisztamin hatású Zyrtec készítmény ( )-cetrizin izomerjének szedatív mellékhatása a racém módosulathoz képest lényegesen kisebb mértékű, ezért az eutomerrel Európában már fázis III. klinikai vizsgálatokat végeznek [11]. A szelektív szerotonin visszavétel gátló fluoxetin jelenleg szintén racemátként van forgalomban (Prozac ). Az S-fluoxetin az antipódjával azonos hatáserősségű, azonban a szervezetből lassabban ürül ki, a hosszú időtartamú kezelések során pedig nagymértékben kumulálódik [12]. Mivel a rövidebb kiürülési idő növeli az antidepresszív kezelés rugalmasságát, a szélesebb körű felhasználás és a kedvezőbb terápiás hatás biztosítása céljából a fázis II. vizsgálat alatt álló R-fluoxetin forgalomba hozatalát tervezik [11]. Az asztma kezelésére a racém albuterol a világ vezető bronchodilatátor készítménye. Ugyanakkor 1999-ben az Amerikai Egyesült Államok Élelmiszer és Gyógyszerhatósága (FDA) a királis analitikai módszerekkel végzett vizsgálatok eredményei alapján törzskönyvezte az eutomert (levalbuterol), amely biztonságosabbnak és hatékonyabbnak bizonyult [13]. Hasonlóképpen, Németországban forgalomban van az S-ketamin injekciós narkotikum, amelyből a racemáthoz képest alacsonyabb dózis szükséges az intenzívebb anesztetikus hatás miatt. Ennek következtében a hatás gyorsabban lecseng és a zavaró mellékhatások is jelentősen csökkennek [14]. Bár az NSAID 2-aril-propionsav származékok S-enantiomerjeinek COXgátlóként történő alkalmazása jelenleg inkább csak teoretikus értelemben előnyös, Ausztriában és Svájcban az S-(+)-ibuprofen már hivatalos. Az S-izomer rövidebb idő alatt fejti ki hatását; azonban, az újabb kísérleti adatok szerint az R-( )-ibuprofen a racém elegy terápiás hatásához nemcsak az S-formába történő konfigurációs átalakulásával, hanem a COX-2 enzimindukciójának gátlásával is hozzájárul [15]. Mindezek alapján a nem-szteroid gyulladásgátlók tiszta enantiomerként történő felhasználásának ellentmondásai még összetettebbé válnak. 9
3.2. Az enantiomer tisztaság meghatározása Amennyiben a gyógyszergyártó a kulcsfontosságú farmakológiai és toxikológiai vizsgálatok alapján az eutomer kifejlesztése mellett dönt, a gyógyszeranyag és a gyógyszerkészítmény enantiomer tisztaságát meg kell határoznia, ami a gyógyszeripari termék piacképességének feltétele. Az enantiomer tisztaság meghatározása napjaink gyógyszeranalitikájának egyik legfontosabb kérdései közé tartozik. Jelentősége alapján az értekezésben az enantiomer tisztaság meghatározására alkalmas módszerek külön alfejezetben kerülnek bemutatásra. Ezek a módszerek két csoportba sorolhatók annak alapján, hogy az enantiomerek arányát közvetlenül vagy elválasztásuk után mérik. Az enantiomer arány többféle módon is kifejezhető. Legelterjedtebb az enantiomer felesleg (e.e.), az enantiomer tisztaság (EP) vagy az optikai tisztaság (P) deklarálása, amelyeket általában százalékban adnak meg [16]. másképpen felírva e.e.% = 100 (x -x) / (x +x), ahol x > x, (1) e.e.% = 100 (2x -1), (2) ahol x a feleslegben lévő, x a szennyező (minor) enantiomer móltörtje. EP% = 100 x / (x + x) (3) P% = 100 [α] / [α] max (4) ahol [α] a vizsgálandó vegyület fajlagos optikai forgatóképessége; [α] max az optikailag tiszta enantiomer fajlagos forgatóképessége. 10
3.2.1. Az enantiomer arány közvetlen meghatározásának módszerei Ezek a módszerek az enantiomer összetétel meghatározásához nem teszik szükségessé a sztereoizomerek elválasztását. Ebbe a csoportba tartozik a polarimetria, a cirkuláris dikroizmus (CD) és az optikai rotációs diszperzió (ORD) spektroszkópia, a nukleáris magrezonancia spektroszkópia (NMR), valamint a gyakorlatban gyógyszeranalitikai célra kevésbé alkalmazott izotópjelzéses meghatározás, a differencia pásztázó (scanning) kalorimetria (DSC) és számos enzim-technika. Az NMR meghatározás kivételével valamennyi fent említett módszer a tiszta enantiomer standard mért értékén alapul, ezért az összehasonlításhoz a tiszta enantiomer meghatározására is szükség van. Polarimetria. A legrégebben és a legszélesebb körben alkalmazott metodika, amely ma is a gyógyszerkönyvek általános módszere az eutomer gyógyszervegyületek tisztaságának ellenőrzésére. Ennél a módszernél - mivel az optikai forgatóképesség (α) függ az oldatkoncentrációtól, a rétegvastagságtól, az oldószertől, a hőmérséklettől és a mérés hullámhosszától - a vizsgálati paraméterek standardizálása szükséges. [α] C nm = 100 α l c (5) ahol α a mért optikai forgatóképesség (m ); l a rétegvastagság (dm); c az oldat koncentrációja (g/100ml). Mivel az optikai tisztaság kísérleti úton meghatározott kiroptikai tulajdonságokon alapul, számos metodikai hibát hordozhat, így a meghatározás az enantiomer összetételre vonatkozóan tetemes hibával járhat. Ezért általában sokkal megbízhatóbbak azok a módszerek, amelyek az egyes enantiomereket különböző ágensként ismerik fel. Mindezek ellenére a gyógyszerellenőrzésben csak egy fontos fizikai mutatószám, a fajlagos forgatóképesség értékének meghatározása terjedt el. A gyógyszerkönyvek ezeket a vizsgálatokat a legtöbb esetben a Na D -vonalán vagy a Hg-lámpa néhány 11
közeli spektrumvonalán végeztetik, amely hullámhosszon végzett mérések nem elég érzékenyek és az anyagra sem igazán jellemzőek. A meghatározás anyagigénye nagy, milligramm nagyságrendű. Mivel a módszer a királis molekulák optikai aktivitásán alapul, az alacsony fajlagos forgatóképességű izomerek esetén alkalmazhatósága az igen kis érzékenység miatt korlátozott. Így pl. a levodopa fajlagos forgatóképessége csak -12, ami nem elegendő az optikai tisztaság ellenőrzéséhez. Formaldehides ciklizációt követően viszont a képződő tetrahidro-izokinolin származék fajlagos forgatóképessége 10-szerese a levodopáénak és a polarimetriás analízis elvégezhető [17]. Cirkuláris dikroizmus (CD) és optikai rotációs diszperzió (ORD). Az enantiomer szennyezések érzékenyebb meghatározására szolgálnak azok a kiroptikai módszerek (CD, ORD), amelyekkel vagy közvetlenül a kiroptikai jelek nagyságából vagy HPLC-s detektorként alkalmazva határozható meg az enantiomer arány. A módszer alkalmazhatóságának feltétele azonban a királisan perturbált molekulaszerkezet. [18]. Az igen kis moláris ellipticitású vegyületek előnytelen kiroptikai jelet adnak, ami megfelelő származékképzést tesz szükségessé. Engle és mtsai [19] pszeudoefedrin és efedrin enantiomer keverék enantiomer tisztaságát határozták meg Co(II)-tartarát komplexeik ellipticitásának mérése alapján. A reakció egyszerű ligandumcsere a tartarát és a királis farmakon között, amelynek során a CD spektrum hullámhossza a látható fény tartományába tolódik el. Amennyiben kettős CD/UV detektálással a minta ellipticitása és abszorbanciája egyszerre mérhető, a (6) egyenlet segítségével számolható a királis kémiai anyagra jellemző anizotrópia faktor (g), illetve a vele arányos G-érték [20]. 12
G = [ θ ] c l =3298 g (6) ε c l ahol ε a moláris abszorbancia (l x mol -1 x cm -1 ); c a koncentráció (mol x l -1 ); l az optikai úthossz (cm); [Θ] a moláris ellipticitás ( x cm 2 x decimol -1 ). A G számértéke a két enantiomer esetén azonos abszolút értékű, ellentétes előjelű paraméter, amely keverékek esetében, adott hullámhosszon, az enantiomer összetétel függvénye. A G-érték abban a tartományban független a koncentrációtól, ahol mind az ellipticitás, mind az abszorpció a koncentráció lineáris függvénye. Az enantiomer tisztaság (EP) a fenti paraméterek felhasználásával a következő összefüggés szerint számolható: EP % = 100 G G tiszta mért (7) ahol G tiszta a szennyezésmentes többségi enantiomer; G mért a vizsgálandó minta mérése alapján számított G-érték. Következésképpen ennél a módszernél is szükség van a standard érték meghatározására. A fenti összefüggés alapján határozták meg Horváth és mtsai [21] a fenilglicin és a mandulasav enantiomer összetételét. Bertucci és Salvadori [22] a 3-metilciklopentolát és a 3-metil-dezmetil-diazepám esetében 0,1 %-os enantiomer szennyezést mutattak ki. Nukleáris magrezonancia spektroszkópia (NMR). Ez a módszer abban az esetben tesz különbséget az egyes enantiomerek között, ha azok alkalmas királis reagenssel kölcsönhatásba lépve diasztereomereket képeznek. A legrégebbi, Mislow és Mosher [23] által kidolgozott módszer homokirális származékképzők felhasználásán alapul. Az enantiomerek közvetlen meghatározása két módon valósítható meg, amelyek közül a Pirkle és mtsai [24] által 1966-ban bevezetett, királis oldószerek alkalmazása terjedt el 13
elsőként. Különösen gyakori az (R)-( )-2,2,2-trifluor-1-fenil-etanol használata. A királis oldószer az egyes enantiomerek magjai között kémiai eltolódást indukál, amelynek megfelelően a csúcsok integrálásával az enantiomer arány közvetlenül fejezhető ki. A módszer előnye, hogy az oldószer enantiomer tisztasága nem befolyásolja az integrálás eredményét vagyis a csúcs-arányt, csak a csúcsok kémiai eltolódásaira van hatással. A speciális műszerigény azonban még nem teszi lehetővé a módszer rutinanalitikai felhasználását. A királis shift reagensek közül igen jelentősek a 6-os koordinációs számú lantanoida kelátkomplexek. Mint gyenge Lewis savak, az elektron-donor csoportokat tartalmazó vegyületekkel kölcsönhatásba lépnek, ami a kölcsönhatás közelében lévő magok alacsonyabb térerő irányába történő eltolódását okozza. Az eltolódás mértéke a diasztereomer-komplex stabilitása, valamint a mag és a paramágneses átmeneti fém ion (Eu 3+, Pr 3+ ) közötti távolság függvénye [25]. Hanna és mtsai [26] (S)-( )-timolol maleát enantiomer összetételét határozták meg prazeodímium (Pr (3+) ) shift reagenssel, ahol a szennyező antipód kimutatási határa 2%-nak, a visszanyerés 99,5±1,17%-nak adódott. Izotópjelzéses technika. Ez a módszer kétféleképpen alkalmazható az enantiomer tisztaság meghatározására. Egyik esetben jelzett racém vegyületet (izotóp-higításos módszer), míg a másik esetben jelzett tiszta enantiomert adnak az ismeretlen összetételű mintakomponenshez [27]. Mindkét eljárásnál két paraméter, a fajlagos optikai forgatóképesség, valamint az izotóp tartalom meghatározása szükséges. Az előbbi polarometriás, az utóbbi tömegspektrometriás úton vagy szcintillációs számláló felhasználásával határozható meg, ami a módszer alkalmazhatóságát jelentősen korlátozza. Enzim reakción alapuló meghatározás. Régóta ismert, hogy számos enzimreakció nagyfokú sztereospecificitást mutat [28]. Pasteur [29] már 1856-ban a racém borkősav reszolválásához Penicillium glaucum penészgombát használt, ami csak a (+)- izomerrel lépett reakcióba. Amennyiben a királis enzimmolekulák az optikai antipódokkal lényegesen eltérő sebességgel képeznek diasztereomer vegyületpárokat, a reakció az alacsonyabb aktiválási energiájú enantiomerre nézve sztereospecifikus és analitikai célra is felhasználható. A módszert a gyakorlatban elsősorban aminosavak 14
meghatározására alkalmazzák, amely a szennyező enantiomer enzimatikus oxidációján vagy dekarboxilezésén alapul. A D - és az L - aminosav-oxidázok felhasználásával a többségi izomerben 0,1% minor komponens is kimutatható [30]. Ezzel szemben csak az L-aminosavak dekarboxilezése katalizálható enzimes úton, ezért a dekarboxiláz enzimekkel csak a D-aminosavak enantiomer tisztasága határozható meg. 3.2.2. Az enantiomerek elválasztásán alapuló módszerek Ebbe a csoportba tartoznak a gyakorlati szempontból legjelentősebb kromatográfiás és azokkal rokon elválasztástechnikai módszerek. Disszertációs munkámban a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) alkalmazása kerül részletesebb bemutatásra, ezért a vékonyrétegkromatográfia (TLC) [31], a gázkromatográfia (GC) [32], a szuperkritikus folyadékkromatográfia (SCF) [33] és a kapilláris elektroforézis (CE) [34,35] tárgyalásától eltekintünk, csupán néhány összefoglaló munkát említünk meg. A GC technika alkalmazhatóságának e területen is határt szab, hogy a mintakomponens hőstabilitását, valamint megfelelő illékonyságát teszi szükségessé. A GC-MS kapcsolt technika megjelenése azonban az érzékenység növelése révén a GC gyógyszeranalitikai felhasználási körét is szélesíti. A szuperkritikus folyadékok viszkozitása a hagyományos értelemben vett folyadékok viszkozitásához képest lényegesen alacsonyabb, ami a mintakomponens gyorsabb diffúzióját teszi lehetővé. Ennek megfelelően az SCF módszerrel az analízis idő jelentős mértékben lerövidíthetőhető, a kromatográfiás felbontás (R s ) csökkenése nélkül. A gyakorlatban legelterjedtebb mozgó fázis a széndioxid, állófázisként a fehérje és a cellulóz-triacetát-alapú kolonnák kivételével valamennyi kereskedelmi forgalomban lévő királis HPLC-s oszlop felhasználható. A kapilláris elektroforézis a gyógyszeranalitika területén az 1990-es évek kezdetén jelent meg és a folyamatos térhódítás jellemzi, jelenleg azonban érzékenysége és pontossága még nem éri el a HPLC módszerét [36]. A királis HPLC területén szerzett tapasztalatokat felhasználva az enantiomerek elválasztására és meghatározására a CE számos módozata alakult ki, amelyeket az 1. táblázatban foglaltuk össze. 15
1. táblázat. A CE királis elválasztásra alkalmas módozatai CE módozat Királis szelektor kapilláris zónaelektroforézis (CZE) ciklodextrinek (CD) [37], koronaéterek [38] elektokinetikus kapilláris kromatográfia (EKC) -micelláris EKC (MEKC) -ciklodextrinnel módosított MEKC (CD- MEKC) -töltéssel rendelkező ciklodextrin származékkal módosított EKC (CD-EKC) -affinitás EKC (AEKC) -felületaktív anyagok pl. epesavak és sóik [39] -ciklodextrinek: pl. hidroxi-etil-β-ciklodextrin [40] -pl. 2-O-karboxi-metil-β-ciklodextrin [41] -fehérjék pl. α 1 -savas glikoprotein, humán és szarvasmarha szérum albumin [42], -ionizált poliszacharidok pl. heparin [43], -makrociklusos antibiotikumok pl. rifampicin, amellyel az izoproterenolban 0,1% enantiomer szennyezést határoztak meg [44]. kapilláris gélelektroforézis (CGE) poliakrilamid gélbe ágyazott ciklodextrinnel töltött kapilláris pl. hidroxi-etil-βcd nel a terbutalin kevesebb, mint 1%-ban jelenlévő enantiomer szennyezését mérték meg [45]. kapilláris izotachoforézis (CITP) ciklodextrinek kapilláris elektrokromatográfia (CEC) A kapilláris falára vagy szilárd hordozóra immobilizált királis szelektorok pl. α 1 -savas glikoprotein [46]. Várható, hogy a jövőben a módszer egyre jelentősebb lesz az enantiomer tisztaság meghatározásának területén is, hiszen anyagigénye kicsi, az analízis idő általában rövid, ami jelentős költségmegtakarításhoz vezethet. Az enantiomer szennyezés érzékeny és pontos meghatározására valamennyi előzőleg említett módszer közül napjainkban legelterjedtebb a királis HPLC, amely az utóbbi időkben folyamatos dinamikus fejlődésen ment keresztül. A módszer a minőségellenőrzés területén mind a minor (szennyező) enantiomer mennyiségének, mind a gyógyszermolekula sztereoizomer-stabilitásának rutinszerű vizsgálatára is alkalmas. A dinamikus metodikai fejlődést jellemzi, hogy a királis HPLC többféle változata is kialkalult. 16
3.2.2.1. Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás (HPLC) módszerek 3.2.2.1.1. Királis származékképzést követő elválasztás A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia megjelenésekor használt állófázisok akirálisok voltak, ezért az enantiomerek elválasztása csak ún. közvetett vagy indirekt úton, a kromatográfiás elválasztást megelőzően, oszlop előtti királis származékképzéssel volt megvalósítható [47]. Elsőként Nakanishi és mtsa [48] használta az NMR spektroszkópia területén korábban sikerrel alkalmazott királis származékképzőt, a Mosher reagenst terpén sztereoizomer keverék analízisére. Az irodalomban számos összefoglaló közlemény részletesen ismerteti a királis származékképző reagenseket és reakciókat [49-51]. Ezek azonban elsősorban az elválasztás általános és elméleti kérdéseivel, valamint biológiai minták vizsgálatával foglalkoznak annak ellenére, hogy a leírt módszerek többsége alapvetően alkalmas lehet az enantiomer tisztaság meghatározására is. Legjelentősebb reagensek például az acil-kloridok és anhidridek (pl. (S)-(+)-naproxen-klorid, (R,R)-O,O-diacetilborkősavanhidrid), az izocianátok (pl. (R)-α-metil-benzil-izocianát), az izotiocianátok (pl. 2,3,4,6-tetra-O-acetil-β-D-glukopiranozil-izotiocianát) és egyéb szerkezetű vegyületek (pl. a fluoreszcens tulajdonságú (S)-(+)-2-tercier-butil-2-metil-1,3- benzodioxolán-4-karbonsav), amellyel diacil-glicerin származékok pikomol mennyiségű enantiomer szennyezését határozták meg [52]. Az indirekt HPLC módszer hátránya, hogy alkalmazásához számos feltételnek kell egyidejűleg teljesülnie: (1) Az-enantiomer tisztaság meghatározásához a homokirális származékképzőnek 100%-ban kell tartalmaznia a tiszta enantiomert, amit a következő egyenlet szemléltet: (R + S) + R + (S ) RR + SR + RS + SS I. II. III. IV. ahol (R+S) a racém vegyület, R a királis származékképző, S a származékképzőben jelenlévő szennyező antipód, I-IV. a reakció során keletkezett kovalens kötésű diasztereomer származékok. 17
A királis származékképzőben szennyező komponensként jelenlévő S -antipód a III. és IV. diasztereomer származékok képződéséhez vezet, amelyek a két főkomponenssel (I. és II.) enantiomer viszonyban állnak. Mivel az akirális kromatográfiával csak a diasztereomerek választhatók el egymástól, az I.-IV. vegyületeket tartalmazó minta analízise során két csúcs jelenik meg, amelyek közül az egyik kromatográfiás csúcs az I. és III., a másik pedig a II. és IV. vegyületeket tartalmazza. Következésképpen a módszer az (R+S) racém molekula enantiomer összetételére nem ad megfelelő értéket. Ezért a királis származékképző vegyület enantiomer tisztaságát az analitikai protokoll vizsgálat során minden esetben meg kell határozni. (2) A mennyiségi meghatározás pontosságának előfeltétele, hogy a reakció alatt sem a farmakon, sem a királis származékképző racemizációja vagy epimerizációja ne következzen be és a származékképzés kvantitatívan végbemenjen [53]. (3) A megfelelő funkciós csoportot tartalmazó enantiomerek és a királis reagens között végbemenő kémiai reakciók sebessége eltérő lehet, ezért a kinetikus reszolúció elkerülésére a származékképzőt feleslegben kell alkalmazni. A szükséges reagens mennyiséget, valamint a reakció időt pontosan meg kell határozni, ami a módszer kifejlesztésének időigényét jelentősen megnöveli. A módszer leglényegesebb előnyei közé tartozik, hogy alkalmas kromofór vagy fluorofór csoport bevitelével egyidejűleg a detektálás érzékenysége és szelektivítása is nagyságrendekkel növelhető [54]. Fontos azonban megjegyezni, hogy a keletkezett diasztereomer származékok UV vagy fluoreszcencia-jellemzői nem feltétlenül egyeznek meg, ezért a módszervalidálás során azt ellenőrizni kell. Például a propranolol enantiomerek (S)-(-)-fluoro-naproxen-izocianáttal képzett származékainak csúcs-terület aránya a fluorimetriás detektálás során 0,97-1,03 között változott [55]. A tisztaságvizsgálat eredményességét és érzékenységét befolyásoló lényeges szempont, hogy a szennyező csúcs a főcsúcs előtt eluálódjon. A módszer további nagy előnye, hogy általában szintetikus úton a királis származékképző vegyületek mindkét enantiomerje előállítható, így a kívánt elúciós sorrend a megfelelő reagens használatával biztosítható. 18
3.2.2.1.2. Királis mozgó fázis additívek alkalmazása Az enantiomerek hagyományos normál vagy fordított fázisú oszlopon történő elválasztásának másik lehetséges módja a királis mozgó fázis additívek alkalmazása. A módszert a direkt HPLC közé sorolják, mivel az átmeneti diasztereomer adduktumok nem az oszlop előtt, hanem közvetlenül a kromatográfiás rendszerben keletkeznek. A legjelentősebbek királis reagensek a ligandumcserés fémkomplexek [56], az ionpárképzők [57], a zárványkomplex-képzők [58] és a fehérjemolekulák [59]. Az enantiomerek elválasztása valamennyi esetben a diasztereomer adduktumok különböző stabilitási, valamint az álló-és mozgófázisra vonatkoztatott eltérő megoszlási állandóin alapul. 1979-ben Karger [60] alkalmazott elsőként fémkomplexeket danzil-aminosavenantiomerek fordított fázisú ligandumcserén alapuló kromatográfiás elválasztására. A módszert Davankov és mtsai [61] vizsgálták részleteiben az aminosav-antipódok analitikai, valamint preperatív elválasztása céljából. Az L-DOPA enantiomer tisztaságának meghatározására Aso [62] L-fenilalanin-Cu II komplex tartalmú eluenst használt. A ligandumcserés módszer alkalmazhatósága kelátkomplex kialakítására képes elektron-donor atomokat tartalmazó vegyületek (aminosavak, savamidok, aminoalkoholok, hidroxisavak stb.) körére korlátozódik. Pettersson és Schill [63] az ionpár kromatográfia területén szerzett tapasztalataik felhasználásával vezették be királis ionpárképzőként a (+)-10-kámforszulfonsavat amino-alkohol enantiomerek normál fázisú rendszerben történő elválasztására. Ugyancsak sikerrel alkalmazták Szepesi és mtsai [64] mind a (+), mind a (-)-10- kámforszulfonsavat a vinkamin nyolc sztereoizomerjének elválasztására és a gyógyászatban felhasznált (+)-cisz-izomer enantiomer tisztaságának meghatározására. Az optimált rendszerben a minor komponens kimutatási határa a (-)-cisz-vinkamin esetén 1%-nak, a (-)-cisz-apovinkaminsav-etilészter esetén 0,1%-nak adódott. E módszer esetében is az enantiomer tisztaság meghatározása szempontjából jelentős, hogy az optikailag tiszta ionpárképző antipódjának megválasztása lényegesen befolyásolja a szelektivítást, azaz a reagens ellentétes antipódját használva a diasztereomer ionpár elúciós sorrendje felcserélhető. A kromatográfiás rendszert meghatározó változók nagy száma és a komponensek retenciójára gyakorolt sokszor 19
ellentétes irányú hatása miatt azonban az elválasztás kísérleti paraméterei csak körülményesen optimálhatók. A legáltalánosabban használt királis mozgó fázis additívek a zárványkomplexképzők körébe tartozó ciklodextrinek (CD) és származékaik. Az α-cd-t hat, a β-cd-t hét, a γ-cd-t nyolc glükopiranóz-egység építi fel, ami a ciklodextrin molekulák hidrofób üregének eltérő méretét eredményezi. Az enantioszelektív elválasztás azon alapul, hogy az antipódok hidrofób részükkel a zárványkomplex-képző molekula toroidális üregébe illeszkednek és a sztérikus konfigurációtól függően a királis atom közelében lévő poláris szubsztituensek az üreg nyílásánál elhelyezkedő szekunder alkoholos hidroxil-csoportokkal hidrogén-hidas kölcsönhatást alakítanak ki [65]. Mindezek alapján a különböző szerkezetű vegyületek enantiomerjeinek elválasztásához megfelelő méretű királis szelektorok szükségesek. A levonorgesztrelben (D-( )-norgesztrel) Gazdag és mtsai [66] γ-cd felhasználásával 0,1% L-(+)-norgesztrel szennyezést mutattak ki. A fehérje alapú királis állófázisok előfutáraiként már a mozgó fázisban oldott protein molekulák ígéretes királis szelektornak bizonyultak [59]. Az ilyen típusú kromatográfiás rendszer a széleskörű alkalmazhatóságon túlmenően a szelektív farmakon-protein kölcsönhatás vizsgálatára is egyaránt alkalmas lehet. A humán szérum albumin és az α 1 -savas glikoprotein azonban rendkívül drága, ezért királis szelektorként a fehérje molekulák napjainkban szinte kizárólag immobilizált formában kerülnek felhasználásra. Jóllehet, a nagyszámú, eltérő tulajdonságú additív folytán a királis mozgó fázison alapuló HPLC módszer széleskörű felhasználást nyerhetne, mivel azonban a királis szelektorok az elválasztást követően nem nyerhetők vissza, az esetek nagy részében a módszer igen költségesnek bizonyul. Mindez pedig a már ismertetett egyéb korlátozó tényezőkkel együtt a királis folyadékkromatográfiás állófázisok kifejlesztéséhez, illetve elterjedéséhez vezetett. 20
3.2.2.1.3. Királis állófázisok alkalmazása A királis állófázisokon (CSP) végzett közvetlen enantiomer elválasztás a legszélesebb körben alkalmazott folyadékkromatográfiás módszer, amit e területen megjelent több száz közlemény is igazol. Meglepő módon azonban az enantiomer tisztaság meghatározásával foglalkozó dolgozatok száma még napjainkban is elenyésző. A szilikagél hordozóhoz kötött királis szelektor lehet kismolekulájú, szintetikus enantiomer, diasztereomer vagy természetes ill. szintetikus eredetű királis polimer, amelyek közül legelterjedtebbek a cellulóz, a ciklodextrin és a glikoprotein alapú oszlopok. A királis felismerés (elválasztás) az enantiomer molekulák és az immobilizált királis szelektor közötti átmeneti diasztereomer komplexek kialakulásán alapul. Termodinamikai szempontból ez akkor lehetséges, ha a két enantiomer királis szelektorral történő asszociációjának szabadenergia értékében eltérés mutatkozik, vagyis G 0. Az alacsonyabb szabadenergia értékű enantiomer-csp komplex enantiomerje magasabb retenciós idővel vándorol, míg a nagyobb szabadenergia értékű komplex antipódja rövidebb idő alatt eluálódik az állófázisról. Az enantiomerek álló - és mozgó fázisra vonatkoztatott egyensúlyi állandóival (K R ill. K S ) felírva a farmakon-csp kölcsönhatáson alapuló szabadenergia változás értékeit ( G o ) (8), majd a két antipód esetén kifejezve a szabadenergia változások különbségét ( G o ) (9) a következő egyenletek írhatók fel [32]: G = -RTlnK (8) G = G R - G S amennyiben K R > K S (9) - G = RTlnK R / K S = RTlnk R / k S = RTlnα (10) ahol k a retenciós faktor; α a szelektivitási faktor / enantioszelektivitás. A fentiek alapján a diasztereomer komplexek szabadenergia értékei közötti különbség a kromatográfiás rendszer sztereoszelektivításának nagyságát, míg a 21
vizsgálandó vegyület és a CSP között fellépő valamennyi királis és akirális kölcsönhatás eredő összege a mért retenciós időt határozza meg. Napjainkban már több, mint 100-féle királis kolonna van kereskedelmi forgalomban és számuk várhatóan a jövőben tovább emelkedik. [67]. Az irodalmi adatok azt tükrözik, hogy a királis állófázisokon végzett meghatározások száma rohamosan növekszik, hiszen a megfelelő szelektorok a racém vegyületek gyors és viszonylag egyszerű, rutinszerű analízisét teszik lehetővé. Többek között olyan molekulákét is, amelyek királis származékképzése a funkciós csoportok hiánya (pl.: szénhidrogének) vagy a könnyű racemizálódás miatt nem valósítható meg [68,69]. Az átmeneti diasztereomer komplexen belül a királis megkülönböztetés a Dalgliesh-féle hipotézis [70] szerint az ún. három-pontos kölcsönhatáson alapul, ami az enantiomer és a királis környezet között fennálló, minimum három, egyidejű kölcsönhatás eredménye. Mivel a kromatográfiás elválasztás nagyszámú kölcsönhatások eredőjének tekinthető, egy 10 5 elméleti tányérszámú oszlopon az enantiomerek és a királis állófázis között létrejövő kölcsönhatás már mindössze 42 J/mol szabadenergia érték különbség esetén alapvonal-elválsztást eredményez [71]. Bár számos CSP elválasztási mechanizmusa ismert, a legtöbb, elsősorban a természetes eredetű királis szelektor működését egyszerre több mechanizmus is befolyásolja, amelyek részleteiben még tisztázásra várnak [68]. A királis állófázisokon végzett meghatározások nemcsak analitikai, de preparatív szempontból is igen nagy jelentőségűek [72,73]. A gyógyszerfejlesztés korai fázisában egyre növekvő számban használnak preparatív és félpreparatív királis kolonnákat az új, hatékony királis gyógyszermolekulák tiszta enantiomerjeinek kinyerése céljából, ami új eszközként szolgál a kifejlesztés alatt álló királis vegyületek antipódjainak farmakológiai és toxikológiai vizsgálataihoz. Az eltérő szerkezetű állófázisok különféle lehetőségeket biztosítanak az analitikus számára a kívánt feladat megoldásához. Wainer [2] a királis kolonnákat öt alapvető csoportba osztotta az enantiomer és a CSP között létrejövő kölcsönhatások szerint. A kiterjedt kutatások eredményeként azonban folyamatosan jelennek meg újabb típusú királis szelektorok, amelyek nem minden esetben sorolhatók egyértelműen a Wainer-féle csoportokba. Említést érdemelnek közülük az Armstrong [74] által kifejlesztett makrociklusos antibiotikum (rifampicin, vankomicin és teikoplamin) alapú 22
szorbensek, ahol az elválasztás mechanizmusa leginkább a zárványkomplex-képzéshez hasonlítható, azonban a π-π, a dipólus-dipólus és a hidrogén-hidas kölcsönhatások mellett jelentős az ionos kölcsönhatások szerepe is. Teikoplamin alapú állófázison Doležalová és Tkaczyková [75] levodopa és metildopa, Cheung és mtsai [76] aril-oxifenoxi-propánsav enantiomer tisztaságának meghatározására alkalmas módszert dolgoztak ki. Pirkle és munkacsoportja [77] az NMR kutatások során szerzett tapasztalatok felhasználásával, az ún. három-pontos hipotézis alapján fejlesztette ki 1979-ben az első királis állófázist, amely a Wainer-féle osztályozás szerint az I. csoportba tartozik. A CSP-enantiomer komplex kialakításában π-π töltésátvitel, dipólus-dipólus kölcsönhatás, valamint hidrogén-hidas kötés vesz részt. A Pirkle-típusú normál fázisú kolonnák többsége kisméretű, szintetikus úton előállított aminosav származékot tartalmaz, ahol az egyik funkciós csoport a retenciós folyamatban döntő szerepet játszó töltésátviteli komplex kialakítása miatt aromás. A legismertebb π-akceptor szelektor a 3,5-dinitro-benzoil-fenilglicin, amely π- donor aromás gyűrűt tartalmazó racém vegyületek elválasztására alkalmas [78]. A legújabb kutatások eredményeként π-donor és π-akceptor csoportokat egyaránt tartalmazó szelektorok kerültek kifejlesztésre, mint pl.: a Whelk-O 1 oszlop, amelyet eredetileg az NSAID vegyületek enantiomerjeinek elválasztására szintetizáltak, jelenleg azonban szélesebb körű felhasználást nyernek, mint az eredeti Pirkle-típusú fázisok [79,80]. A II. csoportba tartozó állófázisok működésében a másodlagos kölcsönhatások mellett jelentős szerepet játszik a zárvány-komplex kialakulás. Ez a mechanizmus jellemző a cellulóz alapú szorbensekre, amelyek közül elsőként a cellulóz részleges hidrolízisével előállított természetes eredetű polimer, a mikrokristályos cellulóz-triacetát (MCTA) került felhasználásra [81]. A szorbens nagymértékű összenyomhatósága és inhomogén részecskemérete a hátrányos tulajdonságok közé tartozik, azonban nagy a kapacitása, alacsony az előállítási költsége és különféle szerkezetű, akár funkciós csoportot nem tartalmazó vegyületek elválasztására is alkalmas. Francotte és mtsai [82] behatóan vizsgálták az elválasztás mechanizmusát. Eredményeik igazolták Hesse és Hagel [83] eredeti elképzeléseit, miszerint a királis felismerés szempontjából alapvető 23
jelentőségű, hogy az enantiomerek a poliszacharid láncot felépítő glükóz egységek meghatározott térbeli elrendeződésű szerkezetébe beilleszkedjenek. A cellulóz-triacetát (CTA) immobilizálásával az állófázis hatékonysága és stabilitása jelentősen megnövekedett [84]. Okamoto és mtsai [85] további cellulóz, amilóz és más szénhidrátpolimer tribenzoát, valamint trisz-fenil-karbamát származékok előállításában vettek részt. Az irodalmi adatok alapján az enantiomer tisztaság meghatározására igen elterjedt a cellulóz trisz-(3,5-dimetil-fenil-karbamát) (Chiralcel OD) oszlop, amelynek felhasználásával pl.: Rustum és mtsa [86] a görcsgátló hatású R-tiagabin-klorid izomerben jelenlévő minor komponens kimutatási határát a többségi enantiomer mellett 0,03%-nak állapította meg. A gyógyszerkönyvek közül elsőként az Angol Gyógyszerkönyv (B.P.1998) ellenőrizteti az enantiomer tisztaságot királis HPLC módszerrel, amely az R-szelegilin vizsgálatára Chiralcel OD oszlopot ír elő [87a]. A cikkely követelménye szerint a kromatográfiás felbontás értéke (R S ) 1,5, a szennyező antipód legfeljebb 0,5%-ban lehet jelen. Az Angol Gyógyszerkönyv azonos követelményt támaszt az (S)-dexklórfenil-amin-maleát esetében is, állófázisként azonban trisz-(3,5-dimetil-fenil-karbamát)- amilózt alkalmaztat [87b]. Ez utóbbi vegyület 1999-ben hivatalossá vált az Európai Gyógyszerkönyvben (Ph.Eur.III.) is, amely az enantiomer tisztaság ellenőrzését a B.P.1998 megfelelő cikkelye szerint végezteti [88]. A III. csoport állófázisainál az enantioszelektivitás alapja a mintakomponensnek a szelektor királis üregébe történő megfelelő illeszkedése, a host-guest zárványkomplex képzés. A csoport klasszikus képviselője az Armstrong [89] által kifejlesztett, fordított fázisú rendszerben működő ciklodextrin (CD) alapú állófázis. Az elválasztás mechanizmusát a 3.2.2.1.2. fejezetben tárgyaltuk. A zárvány-komplex kialakulásának feltétele a mintakomponens királis centrumának közvetlen közelében lévő aromás gyűrű jelenléte. A kereskedelemben forgalomban lévő α-cd főleg az egy aromás gyűrűt tartamazó enantiomerek elválasztására alkalmas, a β-cd a naftil-csoport vagy a többszörösen szubsztituált fenil gyűrű jelenléte esetén biztosít megfelelő szelektivítást, míg a γ-cd a nagykiterjedésű vegyületek, pl. a szteroidok meghatározására alkalmas. A szélesebb körű felhasználhatóság céljából a cellulóz alapú fázisokkal analóg módon a ciklikus oligoszacharid molekulát felépítő glükózegységek szekunder 24
alkoholos hidroxil-csoportjainak származékképzésével további CD-alapú oszlopokat is kifejlesztettek [90]. A koronaéter alapú zárvány-komplex képző állófázis belső felülete hat darab oxigén jelenléte miatt poláris, míg külső felszíne apoláris tulajdonságú. A szelektor primer amino-csoportot tartalmazó enantiomerek elválasztására alkalmas, ahol a királis atomon vagy a közvetlen közelében lévő másik szénatomon az aromás gyűrű szubsztitúció a szelektivítást fokozza. Az enantiomerek királis üregbe történő illeszkedését a sztérikus kölcsönhatások mellett a protonált amino-csoport jelenléte segíti elő. Az oxigén atomok nemkötő elektronpárjai a szubsztituált ammónium ionokkal hidrogén-hidak kialakításával képeznek stabil komplexet [91]. Mivel mind a balra, mind a jobbra forgató koronaéter alapú állófázis kereskedelmi forgalomban van, lehetőség nyílik a szennyező antipód meghatározásakor a kedvező elúciós sorrend biztosítására. A királis felismerés mechanizmusa alapján ugyanebbe a csoportba tartoznak a Blaschke és mtsa [92] által kifejlesztett helikális poliakrilamid és polimetakrilamid alapú állófázisok, amelyek közül említést érdemel a poli-(n-akriloil-s-fenilalaninetilészter) származék [68]. A IV. típusú állófázisokat a Davankov [93] által meghonosított ligandumcserés folyadékkromatográfiás szorbensek alkotják. Az elválasztás - amint a 3.2.2.1.2. fejezetben ismertetettük - az eltérő stabilitású, reverzibilis terner diasztereomer fémkomplexek kialakulásán alapul. A komplex központi fémionja rendszerint Cu 2+, a királis komplexképző ligandum egy kelátképzésre alkalmas, lehetőség szerint ciklusos α-aminosav, L-prolin vagy L-hidroxiprolin, amelyek a Cu 2+ -vel igen hatékony királis szelektornak bizonyultak [94,95]. A módszer alkalmazása jelenleg csak a meglehetősen stabil kelátkomplexek kialakítására képes α-aminosav, valamint α-hidroxisav enantiomerek analízisére korlátozódik. A Wainer-féle osztályozás szerint az V. csoportba tartoznak a fehérje alapú állófázisok. A királis felismerésben egyaránt jelentősek a hidrofób és a poláris kölcsönhatások, azonban az elválasztás mechanizmusa valamennyi eddig tárgyalt szelektorral összehasonlítva a legösszetettebb. A fehérjék a biológiai rendszerekben különböző szerepet töltenek be. Többek között receptorok, mediátorok és enzimek 25
építőkövei, ezen kívül részt vesznek a farmakonok aktív transzport útján történő felvételében, szállításában, ami a gyógyszermolekulák reverzibilis kötődésén alapul és számos esetben nagyfokú sztereoszelektivítást mutat [96]. Például a nem szelektív β- szimpatolitikus hatású propranolol in vitro sztereoszelektíven kötődik a humán α 1 savas glikoproteinhez (AGP) és a humán szérum albuminhoz (HSA), azonban míg a humán AGP-hez az S-( )-propranolol kötődik nagyobb affinitással [97], addig a HSA esetén fordított szelektivítást figyeltek meg [98]. A fehérjék azon tulajdonsága, hogy a farmakonokat reverzibilis módon, sztereoszelektíven képesek kötni, protein alapú királis állófázisok kifejlesztésére használható fel. A jelenleg forgalomban lévő állófázisok közül említendők a szilikagélre immobilizált AGP-t [99], HSA-t [100], szarvasmarha szérum albumint [101], csirketojás fehérje részéből izolált ovomukoidot (OVM) [102] és mikrobális eredetű cellobiohidrolázt [103] tartalmazó oszlopok. A fenti szelektorok egyik legelőnyösebb tulajdonsága, hogy egymástól lényegesen eltérő szerkezetű vegyületek esetében is alkalmazhatók. Azonban míg a cellobiohidroláz bázikus és semleges, az albumin savas és semleges karakterű molekulák analízisére használható, addig az AGP és az OVM egyaránt alkalmas savas, bázikus és semleges tulajdonságú farmakonok enantiomerjeinek elválasztására. Jelentőségüket mutatja az is, hogy az Európai Gyógyszerkönyv Gyógyszerkönyvi Bizottságának döntése alapján a kálcium-levofolinát - amely a Ph. Eur. IV. kiadásában lesz hivatalos enantiomer tisztaságának ellenőrzésére a megfelelő cikkely Chiral-HSA oszlopot ír elő. A gyógyszerkönyv az alábbi követelményeket támasztja: R S 1,5, a disztomer legfeljebb 0,5%-ban lehet jelen [104]. Bár a fehérje alapú állófázisok nagyfokú sztereoszelektivítást mutatnak, az egységnyi tömegű szilikagél hordozóra immobilizált viszonylag kis mennyiségű szelektor miatt az állófázis kapacitása meglehetősen alacsony. Napjainkban azonban az újabb technológiai eljárások a félpreparatív kolonnák megjelenéséhez vezettek, amelyekkel az optimált kromatográfiás rendszerből az egyes enantiomerek 100%-os királis tisztasággal nyerhetők ki [67]. A szelektorok komplex szerkezeti felépítése miatt a királis felismerést egyidejűleg többféle kromatográfiás mechanizmus határozza meg, amelyek máig sem ismertek részleteiben. A mintakomponensek kémiai szerkezetének és a mozgó fázis 26