Vitányi Beáta 1 Nagy Katalin 2 Fekete Anna Katalin 3 Dudás Brigitta 4 Jenes Barnabás 5 Mlo gén alapú lisztharmat rezisztencia: régi harc új megvilágításban Mlo gene based powdery mildew resistance: an old battle in a new light vitanyi.bea@naik.hu 1 NAIK-MBK, tudományos segédmunkatárs 2 ELTE TTK, II. éves MSc hallgató 3 Corvinus Egyetem, III. éves BSc hallgató 4 Gabonakutató Kft., tudományos munkatárs 5 NAIK-MBK, csoportvezető, főigazgató Absztrakt A búza egyik legjelentősebb kórokozója az obligát parazita lisztharmat gomba, a Blumeria graminis f.sp. tritici. Ez a gomba igen adaptív, így a domináns öröklésmenetet mutató rezisztencia gének hamar elvesztik hatékonyságukat. Ezzel szemben az Mlo gén recesszív funkcióvesztéses mutációjához köthető tartós, széles patogén-spektrumú rezisztenciát írtak le árpában (Hordeum vulgare L.). Az egyik ősi diploid búzafajta (Triticum monococcum L.) kórokozókkal szembeni nagyfokú rezisztenciája már régóta ismert. Felmerült a kérdés, vajon ennek hátterében is az Mlo gén mutációja áll-e? Munkánk során szabadföldi körülmények között lisztharmat rezisztenciát mutató T. monococcum fajtajelölteket/fajtákat vizsgáltunk. Célunk az Mlo gén szekvenciájának meghatározása, illetve a rezisztenciát okozó mutációk azonosítása. Eddig az Mlo gén középső régióját, a TaMlo2 gén 1278 1983 bp közötti szekvenciájának megfelelő szakaszt vizsgáltuk. A kapott szekvenciák három típusba sorolhatók, az A típus a TaMlo2 génnel mutat nagy homológiát, míg a B és C típus az árpa Mlo-h1 génnel mutat nagyobb hasonlóságot. Az azonosított szekvenciákban SNP-ket és deléciókat találtunk, amik nagy része az intronokban helyezkedett el. Ezek molekuláris markerek fejlesztésére adtak lehetőséget. További munkánkban tervezzük a teljes Mlo gén szekvenciájának meghatározását, illetve működésképtelen MLO fehérjét eredményező mutáns allélok azonosítását. Bevezetés A búzalisztharmat (Blumeria graminis f.sp. tritici) a búza egyik jelentős károkat okozó betegsége, amely átlagos évjáratban 5-8%-os, erős fertőzéskor fogékony fajtán akár 40%-os termésveszteséget is eredményezhet. A védekezés módja más kórokozókhoz hasonlóan lehet agronómiai, vegyszeres vagy rezisztens fajták termesztése. Az agronómiai védekezés során a vetésterület helyes megválasztásával a fertőzés kialakulásának lehetősége csökkenthető, míg a vegyszeres növényvédelemmel a kórokozó szorítható vissza, de sajnos egyre több hatóanyag csoporttal szemben alakul ki rezisztencia. Az ideális védekezés a rezisztens fajták termesztése, ám ez a gomba rendkívüli alkalmazkodóképessége miatt igen nagy kihívást jelent a nemesítők számára. A lisztharmat genetikailag igen változatos kórokozó, a gazda és a patogén sok éve tartó koevolúciója folyamán újabb és újabb rezisztenciát áttörő gombatörzsek alakultak ki, amit napjainkban a nagyüzemi monokultúrás termesztés nagymértékben elősegít. A rezisztencia gének átvitelének hagyományos módja hosszú évekig tartó, igen költséges folyamat, ami a molekuláris módszerek alkalmazásával jelentősen lerövidíthető. T. turgidum-ból, Aegilops tauschi-ból és T. timopheevii-ból származó különböző Pm gének átvitelével már hoztak létre rezisztens fajtákat (Boyd et al. 1994, Liu et al. 2000, Miranda et al. 2006), ezek azonban hosszú távon nem bizonyultak stabilnak. Eddig búzában 478
46 lisztharmat rezisztenciagént és 64 rezisztencia allélt azonosítottak (Moehler et al. 2013, McIntosh et al. 2012), de ezek nagy része már elveszítette hatékonyságát. Vadon termő árpa (H. vulgare L.) populációban már az 1940-es évek óta ismert volt egy széles spektrumú, hosszú ideje fennálló, stabil lisztharmat rezisztencia, amiről később megállapították, hogy hátterében az Mlo (Mildew resistant locus o) gén funkcióvesztéses mutációja áll (Büschges et al. 1997). Az MLO fehérje a sejtmembránban elhelyezkedő transzmembrán protein, valamennyi szárazföldi növényben megtalálható. A fehérje pontos funkciója nem ismert, feltételezett szerepe a növényi stresszválaszban van. A működőképes fehérje jelenléte azonban elengedhetetlen a lisztharmat fertőzés kialakulásához is, hiányában a spórakezdemények képtelenek a gazdasejt sikeres inváziójára. A vad típusú Mlo gén egy 60 kd méretű heptahelikális fehérjét kódol, amelynek az N-terminális része az extracelluláris, míg a C-terminális része az intracelluláris térben helyezkedik el. Ezen kívül hét membránba integrált hidrofób régióval (TM1-7), három extracelluláris (EC1, EC2, EC3) és három intracelluláris hurokkal (IC1, IC2, IC3) rendelkezik. A lisztharmat rezisztencia kialakítása szempontjából az EC1 és EC3 hurokban található négy konzervatív cisztein, az IC2 és IC3 hurok, valamint a C-terminális régiónak van meghatározó szerepe (1. ábra) (Reinstadler et al. 2010). 1. ábra: Az MLO fehérje szerkezete (Reinstadler et al. 2010 nyomán). A rezisztencia szempontjából fontos régiókat piros szín jelöli. EC1, EC2, EC3 = extracelluláris hurok IC1, IC2, IC3 = intracelluláris hurok. aesti vumban három Mlo ortológot (MloA1, MloB1, MloD1) azonosítottak, a hexaploid búza három ősének megfelelően. T. urartu ban (A U genom) eddig nem találtak lisztharmat rezisztenciáért felelős gént, míg a T. monococcum (A M genom) régóta ismert kórokozókkal többek között lisztharmattal szembeni nagyfokú ellenállóképességéről. Emellett a T. monococcum, az egyik legrégebben termesztett búzafajta, kedvező táplálkozás élettani hatásai és alacsony tápanyagigénye miatt újra egyre népszerűbbé válik hazánkban is. Feltételeztük, hogy ennek a hosszú ideje stabilan fennálló rezisztenciának a hátterében az Mlo gén mutációja áll, ezért vizsgálatainkat hazai nemesítés alatt álló fajtákon/fajtajelölteken végeztük. T 479
Célunk a lisztharmat rezisztenciát hordozó diploid T. monococcumban található Mlo gén szekvenciájának meghatározása, illetve az MLO fehérje funkcióvesztéses mutációját okozó szekvencia változások azonosítása. Anyagok és módszerek Kísérleteinkben a Martonvásárról (MTA Agrártudományi Kutatóközpont) és Szegedről (Gabonakutató Nonprofit Kft.) származó, szabadföldi körülmények között lisztharmat rezisztenciát mutató diploid T. monococcum vonalakat (magtételeket/búzavonalakat/fajtajelölteket) vizsgáltunk. (1. táblázat). Vonalanként legalább 10-10 búzanövény leveléből DNS-t izoláltunk (Zenon Bio Kft.). A poolozott DNS-ről a TaMlo2 génre tervezett specifikus primerekkel (Fwd: 5 -tcgacttccacaagtaca-3, Rev: 5 -gactgggtcctcttcttc-3 ) PCR-t készítettünk. A PCR termékeket pgem-t Easy (Promega) vektorba klónoztuk, E.coli DH5α kompetens sejtekbe transzformáltuk, majd az eltérő hosszúságú inszerteket tartalmazó plazmidokat, vonalanként minimum hatot megszekvenáltattunk (BIOMI Kft.). A kapott szekvenciákat analizáltuk és összevetettük a génbanki adatokkal. 1. táblázat: A vizsgált T. monococcum búzafajták származás szerint csoportosítva. Martonvásár MVGB1150 MVGB1151 MVGB1152 MVGB1153 MVGB1154 MVGB1155 MVGB1156 MVGB1157 MVGB1158 MVGB1159 Szeged T12 T14 G1362 G1364 G1374 G2419 G2420 G2421 RCAT074069 RCAT074071 RCAT074129 RCAT074135 RCAT074163 Kontrollként vizsgált búzafajták MVGB4 (T. monococcum) MVGB116 (T. dicoccum) T. tauschii BobWhite (T. aestivum) 480
Eredmények és értékelésük Munkánk során nemesítőktől származó, különböző fokú lisztharmat reisztenciát mutató T. monococcum vonalakat tanulmányoztunk. Az Mlo gén teljes szekvenciáját kezdtük vizsgálni, mivel a szakirodalomban nem találtunk erre vonatkozó adatot. A szekvencia azonosításhoz a korábbi munkákban hexaploid búza Mlo génekre tervezett primereket használtuk, ám ezek nagy része a T. monococcumban nem működött. A T. aestivum Mlo2 gén (TaMlo2) gén 1287-1983 bp régiójára tervezett primerek azonban jól használhatók voltak, sikerült amplifikálni a T. monococcum Mlo gén homológ régióját mind a 23 vonal esetében. A szekvenciákat összehasonlítottuk egymással, illetve a szakirodalmi adatokkal. A szekvenciaanalízis során három, szignifikánsan különböző szekvencia típust találtunk, amiket A, B és C betűkkel jelöltünk (2. ábra). 2. ábra: A PCR reakcióval amplifikált, majd megszekvenált fragmentek illesztési képének részlete. A szekvenciák három jól megkülönböztethető típusba sorolhatók (A, B, C). A különböző csoportok melletti számok a kiválasztott klónok azonosítói. kapott szekvenciák igen nagy variabilitást mutattak, számtalan SNP-t és deléciót találtunk, amik nagy része az intronokban helyezkedett el. A génbanki adatokkal történő összehasonlítás eredményeképpen az A típusú szekvenciák 98 %-os hasonlóságot mutattak a TaMlo2 (KF009556) szekvenciával, míg a B és C típusú szekvenciák az árpa (H. vulgare L.) Mlo-h1 gén (Z95496) szekvenciájával mutattak 80 %-os, illetve 78 %-os hasonlóságot. A különböző szekvencia típusokat azonosítottuk ugyanazon vonal egyedeiben is. A Martonvásárról származó vonalakban mind az A, mind a B típust megtaláltuk két kivétellel, az MVGB1157-ben csak a B, míg az MVGB1158-ban csak az A típus volt kimutatható. A Szegedről származó vonalak mindegyike tartalmazta az A és a B típusú szekvenciát és három vonal esetében (G1362, G1364 és G1374) megjelent a C típusú szekvencia is (2. táblázat). A 481
2. táblázat: A búzavonalakban előforduló szekvencia típusok. Búzavonal Szekvencia típus (db) A B C MVGB1150 3 3 MVGB1151 2 4 MVGB1152 1 6 MVGB1153 2 3 MVGB1154 3 3 MVGB1155 3 3 MVGB1156 1 5 MVGB1157 7 MVGB1158 6 MVGB1159 3 2 T12 6 2 T14 2 7 G1362 5 3 6 G1364 2 3 8 G1374 4 1 7 G2419 4 5 G2420 1 6 G2421 7 1 RCAT074069 7 3 RCAT074071 5 2 RCAT074129 6 3 RCAT074135 10 2 RCAT074163 6 6 Az általunk vizsgált 696 bp hosszú szekvencia a TaMLO2 fehérje 240-341 aminosav régiójának megfelelő részét kódolja. Az exonokban megfigyelt deléciók és SNP-k végeredményben 2, 4, illetve 5 aminosav különbséget eredményeztek az A, a B, illetve a C típusú szekvenciák esetében. Az annotált TaMlo2 gén szekvenciája és a saját T. monococcum szekvenciák alapján azonosítani tudtuk az MLO fehérje különböző doménjeit kódoló szekvencia régiókat a génbankokban talált T. monococcum contigokban. Az aminosav különbségek az A típusú szekvenciák esetében a TM6 doménben, B típusú szekvenciák esetében a TM5 doménben és az IC3 hurokban helyezkedtek 482
el. A C típusú szekvenciáknál sokkal elszórtabban jelentek meg az eltérő aminosavak, különbséget találtunk a TM4, TM5 és TM6 doménekben, illetve az IC3 hurokban. 3. ábra: A T. monococcum általunk vizsgált régiójában (sárga) a TaMLO2 fehérje prediktált szerkezetéhez képest eltérő aminosavakat találtunk (kék) a TM4-6 doménben, az EC2 és IC3 hurkokban. Az MLO fehérje szerkezete az interneten talált kép (http://www.crpmb.org/mlo/) alapján készült. EC1, EC2, EC3 = extracelluláris hurok IC1, IC2, IC3 = intracelluláris hurok A három szekvencia típus egyszerű elkülönítésére molekuláris markereket fejlesztettünk. Három restrikciós endonukleázt találtunk megfelelőnek erre a célra, ezek a DdeI, a SmaI és a TaqI enzimek. A DdeI és SmaI enzimek az A és B típusú szekvenciák megkülönböztetésére alkalmasak. A DdeI enzim az A és a B típusú szekvenciákat is egy helyen hasította, de a felismerőhely eltérő helyzete miatt az A típusú szekvenciák esetében kapott 575 és 123 bp hosszú fragmentek jól megkülönböztethetők voltak a B típusú szekvenciák hasítása nyomán keletkező 455 és 219 bp nagyságú fragmentektől (4.1 ábra). A G1362, G1364 és G1374 vonalak esetében a DdeI enzim két hasítási hellyel is rendelkezett, így 379, 157 és 123 bp hosszúságú fragmentek keletkeztek. A SmaI enzim az A típusú szekvenciát nem, míg a B típusú szekvenciát 448 és 226 bp nagyságú fragmentekre hasította (4.2 ábra). A C típusú szekvenciákat szintén hasította a SmaI enzim, a kapott fragmentek mérete 428 és 289 bp. A C típusú szekvenciák biztos elkülönítésére a TaqI enzim alkalmas. 4. ábra: Az A és B szekvenciák DdeI (1) és SmaI enzim hasítási képe (2). 483
Eredményeink szerint a T. monococcum Mlo gén középső régiója igen nagy variabilitást mutat. A számos, elsősorban az intronokban elhelyezkedő SNP-k és deléciók molekuláris markerek fejlesztésére és így a későbbiekben a rezisztens fajták könnyebb azonosítására jól használhatók. A továbbiakban tervezzük a teljes Mlo gén és mrns-ének vizsgálatát, illetve az allél változatok és mutáns allélek meghatározását. Az Mlo gén szerkezetének ismerete elősegíti az árpa típusú lisztharmat rezisztenciát okozó recesszív loss-of-function mutáció azonosítását az általunk vizsgált T. monococcum vonalakban. A mutáns gént hordozó növények a későbbiekben nemesítési alapanyagul szolgálhatnak lisztharmat rezisztens fajták előállításához. Eredményeinkkel szeretnénk a gomba és búza közt folyó koevolúciós fegyverkezési versenyben egy új, jól használható fegyvert felvonultatni a búza oldalán. Irodalom Boyd LA, Smith PH, Green RM, Brown JK (1994) The relationship between the expression of defense-related genes and mildew development in barley. MPMI-Molecular Plant Microbe Interactions 7: 401-410. Büschges R, Hollricher K, Panstruga R, Simons G, Wolter M, Frijters A, van Daelen R, van der Lee T, Diergaarde P, Groenendijk J, Töpsch S, Vos P, Salamini F, Schulze-Lefert P (1997) The barley Mlo gene: a novel control element of plant pathogen resistance. Cell 88: 695-705. Liu J, Liu D, Tao W, Li W, Wang S, Chen P, Gao D (2000) Molecular marker facilitated pyramiding of different genes for powdery mildew resistance in wheat. Plant Breeding 119: 21-24. McIntosh RA, Dubcovsky J, Rogers WJ, Morris C, Appel SR, Xia XC (2012) Catalogue of gene symbols for wheat: 2012 supplement. Annu Wheat Newsl 58: 264 265. Miranda LM, Murphy JP, Marshall D, Leath S (2006) Pm34: a new powdery mildew resistance gene transferred from Aegilops tauschii Coss. to common wheat (Triticum aestivum L.). Theoretical and Applied Genetics 113: 1497-1504. Mohler V, Bauer C, Schweizer G, Kempf H, Hartl L (2013) Pm50: a new powdery mildew resistance gene in common wheat derived from cultivated emmer. J Appl Genet 54: 259 263. Reinstädler A, Müller J, Czembor JH, Piffanelli P, Panstruga R (2010) Novel induced mlo mutant alleles in combination with site-directed mutagenesis reveal functionally important domains in the heptahelical barley Mlo protein. BMC plant biology 10: 31. 484