Rövid áttekintés a mikroszkópos alapismeretekről. Heszberger János Budapest 2007 április 20. 1046 Tóth Aladár u. 23. heszberger@ch.bme.hu A mikroszkóp optikai elven működő, a vizsgálandó tárgy nagyított képét előállító gép. A fény mikroszkóp kifejlesztése előtt, is használtak nagyító eszközöket, ilyen volt a bolha néző üveg, ami egy csőből állt, melynek egyik oldalára egy gyűjtőlencsét, a másik oldalára egy mária üveget rögzítettek, ami a bolhát tartotta. A csövet a nap felé fordítva, a lencsén keresztül megszemlélhették a félelmetes szörnyeteget, a sok járvány terjesztőjét. A vizolet írás nagyítására használt hengerlencse. A mikroszkóp közvetlen elődje a gór cső volt: elején egy apró gyűjtőlencsével, ami a nagyítást meghatározta, a másik végén egy nagyobb gyűjtőlencsével. amin keresztül a tárgy nagyított képe volt látható. A mikroszkóp feltalálójának Antony Van Leeuwenhoek-ot tartják. Az ő mikroszkópjának csak egy lencséje volt. Leeuwenhoek mester két fémlemez közé fogta be korának leg- kiválóbb gyűjtő lencséit, ami elé egy kihegyezett csavar végére tűzte fel a vizsgálandó tárgyat, így a tárgyat a lencse előtt elmozdítva a tárgy különböző részei váltak láthatóvá, egy másik élesség állító - csavarral a lencse és a tárgy távolsága volt szabályozható. Ebből a kb. 450-szeres nagyítású mikroszkópjaiból kb 400-at készített Leeuwenhoek. Érdekes, hogy nem tudni kitől tanulta Leeuwenhoek a lencsecsiszolás mesterségét, de annyi biztos, hogy Hollandia, Amszteredam a drágakő csiszolóiról már akkor is híres volt. Gyanítható, hogy valahonnan innen származhattak Leeuwenhoek lencse csiszolási ismeretei. Ebben az időben a tárgy megvilágítására a napot használták, a napsugarakat egy suszter golyó nevű nagy gömblencsével fókuszálták a tárgyra. A magyar nyelv is megörökítette mikroszkóp őst: ha valamit nagyon alaposan meg akarunk vizsgálni, mondjuk, hogy górcső alá vesszük. A mikroszkópok alkalmazásához két fontos meghatározás: A nagyítás azt mondja meg, hogy a szemlélt tárgyat a mikroszkóp által mutatott képen hányszor nagyobbnak látjuk, mint amekkora a valóságban. A mikroszkóp által mutatott kinagyított képen a tárgy látszólagos mérete hányszorosa a tárgy valóságos méretének.
A felbontó képesség, azaz a feloldás azt mondja meg, hogy mekkora az a legkisebb távolság a mikroszkóppal szemlélt két különálló pont között, amelynél a két pont a képen még éppen nem olvad egybe. Mikroszkópok csoportosítása Vannak fény mikroszkópok, elektron mikroszkópok és egyéb különleges nem optikai elven működő nagyított kép előállítására alkalmas gépek, ezek a különleges mikroszkópok. A fénymikroszkópok általában a látható, ritkábban az ultraibolya fény tartományát használják a tárgy megvilágítására az egészség ügyben, az iparban és a kutatásban. A fény hullámhosszától függ a mikroszkóp felbontó képessége. Minél rövidebb a hullámhossz, annál nagyobb a mikroszkóp felbontó képessége, annál részlet gazdagabb a kép. A fénymikroszkópokkal körülbelül 1000 szeres nagyítást lehet elérni, így a baktériumok már-már láthatóvá válnak. Az elektronmikroszkópoknál a fénynél rövidebb hullámhosszú elektron sugárral világítják meg a tárgyat, miáltal milliószoros nagyítás is elérhető, így akár egy infuenza vírus keresztmetszete is láthatóvá tehető. Az elektron sugár a fényhez hasonlóan fókuszálható, elektromos és mágneses térrel. Az elektron mikroszkópban a felgyorsított elektronok ütközéskor röntgen és gamma sugarakat gerjeszthetnek, melyek az egészségre ártalmasak. Az elektron mikroszkóp egyik komoly hátránya, hogy mivel az elektron sugár a levegőben elenyészik az elektron mikroszkópban vákuumot kell létrehozni, ebben a környezetben pedig az élő szövetek, sejtek azonnal elpusztulnak. A mikroszkópiánál a tárgyat érő megvilágítás mikéntje alapján áteső és ráeső fényes megvilágításról beszélhetünk. Az áteső fényes megvilágítás azt jelenti, hogy a tárgyat átvilágító, azaz a rajta keresztül haladó fénysugarakat nagyítja az optika míg, a ráeső fényes megvilágításnál a tárgyról visszaverődő fénysugarak kerülnek nagyításra. A ráeső fényben a tárgy felületének jellegzetességeit láthatjuk meg, míg az áteső fényes megvilágításnál a tárgy belső szerkezete is feltárul. Az optikai felépítésük alapján különbséget kell tennünk a hagyományos és a szteró mikroszkópok között.
A hagyományos mikroszkópok esetén, mivel egyetlen objektíven keresztül nézzük a tárgyat, síkbeli képet kapunk. Régebben az egycsövű mikroszkópoknál ez nyilvánvaló volt, de manapság már csak a binokuláris tubusokkal találkozunk. Annak ellenére, hogy két szemmel lehet a mikroszkópba belenézni, nem lesz térbeli a kép, mert mind két szemünk ugyan azt a képet látja. A sztereó mikroszkópok viszont mindig binokulárisak, két szemmel nézünk bele. Jellegzetességük, hogy két viszonylag kis nagyítású mikroszkóp optika szög alatt - van egybeépítve. Mindkét mikroszkóp eltérő nézőpontból mutatja a vizsgált tárgyat, amíg az egyik oldali mikroszkóp rész az egyik szemünkbe, addig a másik mikroszkóp értelemszerűen a másik szemünkbe vetíti a képet, így a vizsgált tárgyat térbelinek látjuk. Megjegyzendő, hogy a sztereo mikroszkópiánál a térlátáson (és nem a nagyításon) van a hangsúly, ezért is a sztereo mikroszkóp mindig egyenes állású képet ad! Ez pedig az optikától elegendő mélységélességet követel, ami csak a kisebb nagyítású tartományokban valósítható meg. Ez ad magyarázatot arra, hogy miért alkalmaznak sokszor csak néhányszoros nagyítású optikákat a sztereo mikroszkópoknál. Mikroszkópok a felhasználásuk szerint is csoportosíthatók: A rutin mikroszkópok a hétköznapi munkához például: kenet, vizelet, metszet sorozatok rutin vizsgálatához kifejlesztett, viszonylag kevés beállítási lehetőséggel rendelkező, de széles tartományban jó képet adó, a kézzel történő beállítások pontatlanságával szemben toleránsabb, sok minden a gyártó által előre rögzítetten beállított - nem változtatható, nagyon könnyen kezelhető kényelmes ergonómikus mikroszkópok szoktak lenni. Pont az előre beállított részek miatt egy-egy szakterület követelményeihez igazodó mikroszkópokat gyártanak. A rutin munka monotóniája amúgy is fárasztó, fontos hogy a dolgozót a kezelés tovább már ne terhelje. Az egyszerű felépítésű viszonylag igénytelen, de strapabíró oktató mikroszkóp is ide sorolható. A kutató mikroszkópokra az jellemző, hogy szinte mindent lehet állítani rajtuk, több speciális lehetőséget építenek be egy mikroszkópba, vagy könnyen cserélhetőre és bővíthetőre készítik az adott mikroszkópot, hogy az adott pl.: biológiai területen minden felmerülő igényt kielégítsen a lehető legmagasabb szinten (például: sötétlátóteres-, fáziskontraszt-, polarizációs-, fluoreszencia-, differenciál interferencia- mikroszkópia egy készüléken). Gyakran több munka míg igazán jó képet kap az ember, de akkor a műszakilag lehetséges legjobbat kapja.. Sok esetben a modern, az igen drága kutató mikroszkópokba a beállítás megkönnyítésére számítógépes vezérlést építenek, automatika tesz javaslatot a kép alapján fényképezési beállításokra, gyakran digitális kamerával és számítógépes képfeldolgozó rendszerrel is egybeépítik, sőt még a motoros mozgatású tárgyasztal is beszerezhető. Külön csoportot képeznek az operációs mikroszkópok, általában sztereó mikroszkópok (pl:, szemészeti, gégészeti, idegsebészeti, nőgyógyászati (kolposzkóp) operációs mikroszkóp) hogy térbeli látást biztosítsanak. A szemészeti réslámpa is ide sorolandó. Nagyításuk lépésekben, vagy zoommal folyamatosan változtatható. Jellemző rájuk, hogy megjelenésükben az optikát tartó vázszerkezet a domináló.
Ahhoz, hogy a mikroszkóp a feladatnak megfelelő pozicióban és ott kellően rögzítve legyen, többnyire robosztus állványzat, erős kinyúló karok, helyzetbe állító szervomotorok, stb. kellenek. A diagnosztikai és terápiás célra egyaránt használt endoszkópok is funkcionálisan ide tartoznak, de azzal a lényeges különbséggel, hogy ezek egyenlőre nem sztereo eszközök, hanem az egycsöves mikroszkópoknak egy sajátos, nagyon speciális változatai, melyek a vizsgált terület nagyított képét nagy mélységélesség mellett vagy okuláron keresztül mutatják, vagy gyakran a beépített mini-, sőt mikrokamera jóvoltából képernyőn jelenítik meg. A mikroszkópok között igazi unikum az inverz mikroszkóp, amelyik onnan kapta a nevét hogy a megszokott hagyományos áteső fényes fénymikroszkóp fejre állításával hozták létre. Ennek értelmében a megvilágítás felül van, és a középen levő tárgyasztal alatt helyezkedik el az objektíveket hordozó revolver. Ezt a konstrukciót az a probléma kényszerítette ki, hogy egy petri csésze alján fekvő pl. szövetkultúra vizsgálatát a hagyományos mikroszkópokkal nem tudták elvégezni. A lombik bébi program megvalósítását pedig egyenesen az inverz mikroszkóp tette lehetővé. A kép élesség állításhoz a nagyító rendszer első lencséjét (objektív front lencse) a lencsék optikai tulajdonsága miatt a szövet tenyészethez egészen közel kell vinni, - gyakran tized milliméterekre, mert a nagy nagyítás, kicsi fókusztávolsággal jár - a palackban növő szövethez csak alulról nézve lehet elég közel menni, mert felülről a zárt steril palack vastagsága ezt nem teszi lehetővé. A szövet tenyészet kényes és sérülékeny, nem rakosgatható egyszerűen ki-be a tenyésztő edényből sérülés nélkül. Ipari mikroszkópok A mikroszkópok legtöbb helyen és legváltozatosabb formában az iparban találhatók meg. Legegyszerűbb változatuk a nagyon finom skálák leolvasó mikroszkópja, többnyire a skálára fölé van szerelve és csak az élességet lehet állítani rajta. A finommechanika apró alkatrészeinek mérésénél, ellenőrzésénél van nagy jelentősége a projekciós mérőmikroszkópoknak, melyeknél a nagyított, torzítatlan képen hosszméréseket lehet elvégezni. A legigényesebbek egyike a csiszolatvizsgáló fémmikroszkóp, mely főleg ráeső fényes megvilágítással dolgozik, de az objektívvel koncentrikusan kialakított résen keresztül - alulról - világítják meg tárgyat. A nagyon vékony, áttetsző csiszolatokat viszont felső világítással is vizsgálják (ásvány mikroszkópia). Ha nagyobb áthatoló képességű megvilágítást használunk, akkor a speciális röntgen vagy gamma sugár mikroszkópok jöhetnek szóba. (Ezek felbontása és nagyítása vetekszik, sőt a gamma sugár mikroszkópoké sokszorosan meg is haladja a fénymikroszkópokét.) Tény hogy ezekkel a módszerekkel bizonyos mértékig a felszín alá is lehet látni. Egyes anyagok többnyire kristályok, de számos szerves molekula is a rajta áthaladó fény rezgési síkját elforgatja. Ezek vizsgálatára a polarizációs
mikroszkópokat használják, mint például az egészségügyi laborokban, az egyes szerveinkben keletkező kristályos kiválások vizsgálatára (epe-,vese-,bélsár-kő). A fénymikroszkóp felépítése, részei: A mikroszkóp részeinek rögzítésére szolgál a statív, ez a nehéz fémváz tartja stabilan az optikai és járulékos elemeket. Minden mikroszkóp család statívja meghatározó jellegű. A statív önmagában semmit sem tud, de a gyártók megadják azt a tartozék listát, melyből kiválasztható a célnak megfelelő mikroszkóp összeállítás, és az is, hogy milyen opcionális alkatrészeket lehet rászerelni a későbbiek során bővítés céljából. A fényforrás és a megvilágító rendszer a statív szerves része. A történelmi időkben tükörrel terelték a napfényt a tárgyra, ilyen tükrök ma is kaphatók, de már ritkán használatosak, csak terepi munkánál vagy elektromos hálózattól távol lehet rá szükség. Maga a fényforrás, leggyakrabban izzólámpa, mely a statív talapzatában, vagy nagyobb teljesítményű izzó használatánál külső lámpaházban van. A jobb fényhasznosítás végett az izzó mögé egy parabola tükröt szoktak elhelyezni. A fény innen hőszűrőn, kollimátor lencsén és az u.n. mező rekeszen át, a konstrukciótól függően egy beállítható terelő tükör közbeiktatásával a kondenzorba kerül. A kondenzor feladata a fénysugár tárgyra fókuszálása. A fénykúp csúcsa a tárgyon van. A kondenzor alján találunk még egy írisz blendét magyarul rekeszt, mellyel a kép világosságát, fényerejét tudjuk állítani. A kondenzor függőleges elmozdításával lehet a fénykúp hegyét pontosan a tárgyra állítani, a kivilágítást finoman hangolni, míg a mező rekesz a fényfolt átmérőjét szabja meg. A mezőrekesznek az a feladata, hogy olyan átmérőjű megvilágító fénysugarat tudjunk beállítani, amilyen a teljes látótér kivilágításához kell, de ne nagyobbat, mert a vizsgált tárgy környezetéről szóródó fénysugarak rontják a mikroszkópban látható kép kontrasztját, olyan részletek is világosak lesznek, amiknek sötétnek kéne maradniuk. Erőteljesebb fényerő szabályozás, amely már szín eltolódással is jár az elektronikus tápegység segítségével végezhető. A napfényhez leginkább hasonlító spektrumú megvilágítást a fény útba helyezett kék szűrő révén lehet megvalósítani. Egyéb igények esetén természetesen más szűrőket is szoktak használni. A gyakran használt fluoreszcens mikroszkópos munkához higany gőz lámpával világítanak, mert látható tartomány beli nagy fényereje mellet, nagyrészt ultraibolya spektrum tartományba eső fényt sugároz, és az ez esetben használt speciális mikroszkópos festékek (Pl: sejt membránokhoz kötődő Fluoreszcein-diaceteát, vagy a sejtmaghoz kötödő Propidium-jodi, élő/holt sejt kimutatásra jó) gerjeszthetők vele. Ez azt jelenti, hogy a festék molekulák az elnyelt UV-sugarakat látható tartományba eső fény formájában sugározzák ki (narancssárga az előbbi, az utóbbi vörös). Meg kell említeni, hogy különleges mikroszkópoknál (pl:. konfokális lézer mikroszkópnál) kis energiájú lézerek is felhasználásra kerülnek fényforrásként.
A fénymikroszkópnál a tárgyat csak nagyon ritkán teszik közvetlenül a tárgyasztalra, míg sztereó mikroszkópnál ez a megszokott (ami miatt a sztereó mikroszkópot sokan szokták felhasználása szerint preparáló mikroszkópnak nevezni). A tárgyat általában egy viszonylag vastag üveg lapra a tárgylemezre helyezik, De még mielőtt a biológiai (vagy egyéb) eredetű mintát a mikroszkópba helyezik soksok előkészítési lépésen esik át. Rögzítik, festik, szeletelik, csiszolják, polírozzák stb. Ez a preparátum készítés művészete, amivel itt nem foglalkozunk. A tárgylemezre helyezett preparátumot egy vékony 0.17mm vastag fedőlemezzel letakarják, hogy megvédjék a külső behatásoktól, karcoktól, portól. A fedőlemezt általában ráragasztják a tárgy lemezre. Kenetek készítésénél nem használnak fedőlemezt. A fény mikroszkópnál a tárgylemezt a tárgyasztalon gyakran rugós leszorítóval, vagy az u.n. tárgyrögzítővel rögzítik a tárgyasztalon. Két támasztó lemezke közül az egyik fix, a másikat egy rugó nyomja a tárgylemezhez. E megfogás előnye hogy a tárgylemez méretéhez igazodik (ez az elterjedtebb). A mikroszkópok tárgyasztala gyakorlatilag két csavarral egymásra merőleges tengely mentén eltolható úgynevezett koordináta asztal. Azt a célt szolgálja, hogy a tárgy mozgatásával a tárgy különböző részeit nézhessük meg. Tárgyasztalból a kényelmes munkához a gyártók ma már gyártanak jobb és bal kezes változatot is, ez csak azt jelenti, hogy az állító csavar pár jobb vagy balkézzel érhető el kényelmesebben.) Nagyító, képalkotó rendszer A mikroszkóp nagyító rendszerének első a tárgyhoz közeli részét objektívnek nevezik ez határozza meg a mikroszkóp nagyítását. Mivel a mikroszkópokban merev üveg lencsékét használnak így egy adott objektív csak egy nagyítást tud. Általában 4x, 10x, 20x, 40x, és 100x szoros nagyítású objektíveket szoktak használni. Van természetesen kisebb nagyítású objektív is - 1x, 2x, alkalmazkodva a speciális igényekhez, - de ezek nem gyakoriak. Mindig az adott feladat és a nézendő tárgy dönti el, hogy milyen nagyítású objektívekre lesz szükség a munka során. Minél nagyobb egy adott objektív nagyítása, annál közelebb kell menni a tárgyhoz az objektív front lencséjével. A mikroszkóp képélesség állítása úgy történik, hogy vagy rögzített helyzetű tárgyasztalhoz képest változtatják az objektív távolságát, vagy a tárgyasztalt a tárgyal és a kondenzorral együtt, mozgatják közelebb vagy távolabb a rögzített objektívhez képest. (Léteznek alternatív megoldások is, amikor mind a kettőt mozgatják). Ez a statív és finommechanikai kialakításától függ. Közös azonban (majdnem) minden mikroszkópon, hogy az élességállításra két csavar szolgál, egy durva körülbelüli beállást lehetővé tevő makrodiál és egy finom távolság illetve élesség beállítást lehetővé tevő mikrodiál. A két csavar a mikroszkóp statívjának mindkét oldalán általában megtalálható. A két csavart általában koaxiálisan, egy tengelyre felszerelve helyezik el, a nagyobb átmérőjű a makró, a kisebb átmérőjű a mikrodiál. A fókuszáló mechanikában ide egy féket is beépítenek, aminek az a feladata, hogy a tárgy távolság beállítása után (felhasználói beavatkozás nélkül)
rögzítse a távolságot, ne mozduljon el a beállító csavar elengedése után a tárgyasztal. Vannak olyan objektívek a viszonylag nagy nagyításúak között, amiknek csak akkor jó a képalkotásuk, ha a tárgy és az objektív között megfelelő törésmutatójú közeg: immerziós olaj van. (A törésmutató fizikai anyagjellemző, az anyag minőségre jellemző szám. Refraktométerrel lehet mérni.) Az immerziós olajjal végzett munka után mindig meg kell tisztítani az objektívet. Az immerzió lényege hogy az olaj és levegő határ felületén a törésmutató különbség miatt gyakorlatilag nem tud a fény kilépni az olajból így minden képinformációt hordozó fény sugár belép az objektív frontlencséjébe és részt vesz a képalkotásban. A különleges objektívek közt van olyan, amelyek nem olaj, hanem vízimmerzióval működnek. Ehhez nagyon tiszta, desztillált vizet kell használni. A legtöbb nagy nagyítású objektívnek mivel nagyon közel dolgozik a fedő lemezhez, hogy véletlen rossz élesség beállítás esetén ne törje össze a tárgylemezt az első néhány lencsetagját benyomható rugósan elmozduló csőbe építik. Hála e szellemes megoldásnak egészen komoly, akár pár milliméteres elmozdulást is túlélhet a fedett metszet komoly sérülés nélkül. A tárgylemez törésnél nem az a fő probléma, hogy az objektív front lencséje megsérülhet, hanem, hogy a pótolhatatlan metszet megsemmisül. Ezért élesség állításnál, mozgatás közben a tárgyasztalt figyeljük, és néha pillantsunk a mikroszkópba is, főleg ha a makrodiállal a durva beállítást végezzük. A különböző nagyításokhoz más-más objektív szükséges. Az objektívek könnyű váltását a revolver teszi lehetővé: ez egy közepén csapágyazott gömbsüveg, felületén kör mentén nagyobb menetes furatokkal, melyekbe az objektíveket lehet becsavarni. 3, 4, 5, 6 objektív fogadására alkalmas revolverek léteznek. A revolverbe az objektívek tetszőleges sorrendbe rakhatók be. Objektív váltáskor a pontos pozicionálásról arretáló rúgó gondoskodik. A kutató mikroszkópoknál lehet az egész revolvert is cserélni. (Egy sorozat normál objektív, egy a fázis kontraszt mikroszkópiához stb.) A képet hordozó fénysugarak a objektívből a tubusba kerülnek. Az objektív front lencséjétől az okulár válláig pontosan 160 mm a fényút hossza, azaz a tubus hossz. A mechanikus méreteket prizmák alkalmazásával egyrészt lerövidítették, másrészt a beiktatott képosztó prizmával a kétszemes megfigyelést tették lehetővé (binokuláris tubus). A két okulár egymástól való távolságát a megfigyelő pupilla távolságához lehet igazítani. Ugyancsak beállítható az egyik okulár tengely irányú mozgatása, hogy a kép éles lehessen eltérő dioptriájú szemek eseténél is. Az utóbbi évek modern mikroszkópjainak objektívjei úgy nevezett végtelenre korrigált objektívek, amikből a képet hordozó fénysugarak párhuzamosan lépnek ki. Ennek az az előnye hogy a fény útjába bárhol be lehet tolni egy kép osztó prizmát, amivel a képet hordozó fénysugarak egy részét fényképezőgéphez, társnézőhöz vagy kamera felé tudjuk irányítani. Az ilyen háromlyukú tubusokat trinokulárnak nevezik. A tubusból az okulárba lép be a fény amely további (úgynevezett üres-) nagyítás mellett lehetővé teszi, hogy a szemünk számára is élvezhető kép keletkezzék.
Általában a 10-szeres nagyítású okulárt használják, de nem ritka a 15-szörös, vagy más nagyítású okulár használata sem. A mikroszkóp össznagyításának kiszámításához az objektív nagyítását kell az okulár nagyításával megszorozni. Fontos jellemzője az okulároknak a látó szöge, kis látószög esetén olyan mintha egy kulcs lukon leskelődnénk a mikrovilágba, míg nagy látószögű objektívnál a szemünk elmozdításával szinte körül tudunk nézni a mikrovilágban. Az okulárba gyakran szálkeresztet vagy okulár mikrométert építenek, mely segítséget nyújt egy képlet méretének becslésében.