Lymphoma sejtvonalak és gyerekkori leukémia (ALL) sejtek mikro RNS (mir) profiljának vizsgálata Dr. Nemes Karolina, Márk Ágnes, Dr. Hajdu Melinda, Csorba Gézáné, Dr. Kopper László, Dr. Csóka Monika, Dr. Sebestyén Anna II.sz.Gyermekgyógyászati Klinika, I.sz.Patológiai Intézet
Mikro RNS (mir) 18-40 nukleotid hosszúság (ált. 22 nt) nem kódoló RNS szabályozó RNS (mir, mirszerű szabályozó RNS-ek) humán genom 2%-a mir-t kódol tumorszupresszor, és onkogén mir szerep számos sejt és tumorbiológiai folyamat (proliferáció, differenciáció, apoptózis, túlélés...) szabályozásában Az első bizonyított kapcsolatot a mir-ek és humán daganatok között CLL-ben (mir15 és mir16-1)
DLBCL, ALL és mir DLBCL (diffúz, nagy B-sejtes lymphoma) mir155 fokozott expressziója (Calin et al. 2004) mir21 expresszió asszociál a relapszus mentes túléléssel (Ch.H. Lawrie et al. 2008) ALL (akut lymphoblasztos leukémia) 27 mir-t vizsgálva a mir128a, 128b szignifikánsan magasabb az ALL-es betegekben, a let-7b, és a mir223 pedig az AML-es betegekben (J. D. Rowley et al. 2007) 46 mir-t vizsgálva 5 mir (mir128b, 181b-1, 204, 218, 331) fokozott expressziót mutat ALL-ben (D.L. Zanette et al. 2007) mir16 fokozott expressziója asszociál a rossz prognózissal gyerekkori ALL-ben (T. Kaddar et al. 2009)
MiR klinikai felhasználhatóság? Diagnosztika: a mir expressziós mintázat segítséget nyújthat különböző daganatokcsoportok, valamint rosszul differciált daganatok diagnosztizálásában Prognózis megítélése: a mir-155 overexpressziója a rossz pronózis előrejelzője lehet B sejtes lymphomákban Terápiás célpont: anti-sense mir oligonukleotidok (AMO) alkalmazása (onkogén mir-ek expressziójának csökkentésére, tumorszupresszor mir-ek expressziójának fokozására)
Célkitűzések Irodalmi adatok alapján kiválasztott különböző mir-ek (mir16, 21, 24, 29b, 128b, 142-3p, 155) expressziójának vizsgálata ALL sejtekben és egyéb humán lymphoma sejtvonalakban (a beállításhoz bizonyos lymphomák/leukémiák esetében már vizsgált mir-ek) Akut lymphoblasztos leukémiás sejtek mir expressziójának összevetése a betegek prognosztikai adataival, betegekben a kemoterápia mir profilra kifejtett hatásának vizsgálata (követéses vizsgálat) Különböző leukemia/lymphoma sejtvonalakban az in vitro kemoterápiás kezelés mir expresszióra gyakorolt hatásának vizsgálata Jelátviteli fehérjék expresszió változásának vizsgálata in vitro
Módszerek Sejtvonalak: KMH2: Hodgkin lymphoma, BHD1: diffúz, mediasztinális, nagy B- sejtes lymphoma, Raji, Ramos, Daudi: Burkitt lymphoma, Mn60, Nalm6: B-sejtes akut lymphoblastos leukémia, Jurkat, CEM: T-sejtes akut lymphoblastos leukaemia, HL60: promyelocytás leukemia ALL sejtek izolálása: csontvelői és/vagy perifériás vér minta ficoll grádiens centrifugálása (46 ALL-es beteg, ff-nő;31-15), 37 esetben a kezelési protokoll alatt teljes minta követés Taqman mirna assay: (mirvana TM mirna Isolation Kit, real time PCR TaqMan MicroRNA Assay-ék (mir16, 21, 24, 29b, 128b, 142-3p, 155, endogén kontroll RNU6B) B-ALL ff., 19 T-ALL nő, 2 Kezelések in vitro: doxorubicin: 24h-96h; 200nM-3,6mM; cytosinarabinosid: 24h-96h; 10 mg/ml-20mg/ml Áramlási citometria Immuncitokémia T-ALL ff., 6 B-ALL nő, 10
Lymphoma/leukémia sejtvonalak mir expressziója BHD1 Raji Daudi BJAB KMH2 HL60 Jurkat Mn60 Nalm6 mir16 + - + + + mir21 + + + + - - mir155 + - - - - - - mir24 + - + + - + mir29b + + - + + - mir128b + + sejtvonalak mir142-3p + + - + + +
MiR profil különböző lymphoma/leukémia sejtvonalakon
ALL-es sejtek mir expressziója kezelés előtt, kezelést követően (3. hónap) 11 ALL-es gyerek (23 minta) T-ALL B-ALL Expresszió változás iránya T-ALL B-ALL mir16 -/+ + mir21 - -/+ mir24 - ++ mir29b - -/+ mir128b +++ ++ mir142-3p -/+ + mir155 -/+ -/+ mir16 mir21 mir24 mir29b mir128b mir142-3p mir155
T és B-ALL-es betegek mir expresszió változásai mir expre esszió 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 8.73 Kezelés 122 előtt T-ALL mir155 jó prognózisú beteg 1.28 156 Kezelés 3. havi minta rossz prognózisú beteg 0.1 0.38 115 Kezelés előtt Kezelés 143 3. havi minta
In vitro kezelés hatása a mir expresszióra In vitro kezelés 72h (BHD1) mir expresszió módosító hatása mir relatív expre esszió 120 100 80 60 40 20 0 61,55 115,61 9,12 13,87 16,07 11,1 39,04 83,84 4,74 10,85 13,06 13,99 Co Ara D Co Ara D Co Ara D Co Ara D mir21 mir29b mir128b mir155 cytosin-arabinosid (10 µg/ml) doxorubicin (200nM) kontroll
Összefoglalva Beállítottuk különböző mir-ek (mir16, 21, 24, 29b, 128b, 142-3p, 155) expresszió vizsgálatát, és kimutattuk ezek jelenlétét a vizsgált leukemia/lymphoma sejtekben 11 ALL-es (5 B-ALL, 6 T-ALL) gyermek követéses vizsgálataiból származó csontvelői mintában (N=23) a terápiás kezelés mir-profil módosító hatása figyelhető meg Különböző mir expressziót találtunk a T és B sejtes ALL-es betegekcsoport esetében, illetve az adott betegcsoporton belül is különbséget találtunk a jó és rossz prognózisú betegek mir expresszió-változása között a kemoterápiás kezelés hatására In vitro kemoterápiás kezelés hatására megváltozó mir és fehérje expressziót találtunk lymphoma (BHD1) sejtvonal esetében
Köszönetnyilvánítás Dr. Csóka Monika Dr. Sebestyén Anna Dr. Kovács Gábor Márk Ági Dr. Hajdu Melinda Dr. Barna Gábor Csorba Gézáné Dr. Bödör Csaba Prof. Kopper László Támogatás: OTKA-K68341