A szamóca érése során izolált Spiral és Spermidin-szintáz gén jellemzése Kiss Erzsébet Kovács László
Bevezetés Nagy gazdasági gi jelentıségük k miatt a gyümölcs lcsök, termések fejlıdésének mechanizmusát t intenzíven kutatták A gyümölcscs lcscsérésneksnek két t fıf típusa van Klimaktérikus (utóé óérı) Nem- klimaktérikus (Nem utóé óérı)
Gyümölcsérés Klimaktérikus Etilén-függı Nem-klimaktérikus Etiléntıl független (?)
Univerzális vagy eltérı biokémia és génexpresszió a két érési típusban? Etiléntıl független érési mechanizmust találtak paradicsomban (rin, nor) A rin gén homológját megtalálták szamócában is Etilén-függı jelmolekulákat kódoló géneket azonosítottak szamócában
Az érés során eltérı transzkripciót mutató géneket azonosítottunk cdns-aflp módszerrel A gyümölcsfejl lcsfejlıdés s során n 277 génnek g változott az expressziója Spiral és s a Spermidin-szint szintáz gének
A gének kódoló és promoter szakaszát is izoláltuk In silico elemzés
Kódoló szakasz Promoter szakasz Az ORF-ek meghatározása Bináris vektorba ligálása szensz és antiszensz orientációban Agrobacterium tumefaciens transzformációja Paradicsom (MikroTom) és szamóca transzformációja Riportergént (GFP) tartalmazó vektorba építése Agrobacterium tumefaciens transzformációja Tesztelés tranziens expresszióval
A Spiral gének A termés s végsv gsı méretét t a magházban virágny gnyíláskor már m r jelen levı sejtek száma határozza meg A paradicsom termései példp ldául virágny gnyílás s után n teljes egész szében sejtmegnyúlással ssal növekednek A Spiral gének a sejtmegnyúlás szabályoz lyozói
Spiral gének Az Arabidopsis thaliana 6 Spiral génje ismert A Spiral1 1 mutánsok gyökerei mindig jobbra helikálisan lisan növekednek Egy 110 130 aminosavból álló fehérj rjét t kódolnakk Auxin hatására csökken a gén g expressziója
Spiral gének Szamócában auxin hatására csökken a gén g expressziója Relatív Expresszió 102 100 98 96 94 92 90 88 86 84 82 Kontroll Auxin kezelt kezelt
A Spermidin szintáz gén A poliamin metabolizmus egyik kulcsenzimét kódolja Az almában 3 változatát azonosították A megnövekedett poliamin szint a sejtekben növeli a növény abiotikus stresszekkel szembeni a ellenállóságát
A Spermidin-szintáz gén Szamócában csak egy változatát sikerült azonosítani A gén 9 exonból és 8 intronból áll Egy 340 aminosavból álló fehérjét kódol
A Spermidin szintáz gén Az almában azonosított spermidin szintáz gének mérete, exon-intron szerkezete A poliaminok szerepe az érésben, illetve az abiotikus stressz toleranciában
Eredmények A két gén in silico analízise Spiral gének in silico analízise Spermidin-szintáz gének in silico analízise
Eredmények Az ORF-ek azonosítása után génspecifikus primerekkel felszaporítottuk a genomi és cdns klónokat Hasonló módon felszaporítottuk a gének promoterrégióit
Eredmények A DNS szakaszokat vektorokba építettük és Agrobacterium tumefaciens-t transzformáltunk velük A transzformáció sikerességét bizonyítottuk
Eredmények A Spiral gént szensz és antiszensz orientációban tartalmazó Agrobacterium C58C1-es törzsével MikroTom paradicsomot és szamóca Elvira fajtát transzformáltunk
Eredmények A Spiral szensz orientációjú konstrukciójával sem a paradicsomban sem a szamócában nem kaptunk regeneránst Az antiszensz konstrukcióval viszont mindkét esetben regeneráltunk növényeket
Eredmények A növénytranszformáció eredményességét PCR technikával bizonyítottuk Csak a szamócák között tudtunk transzformánsokat azonosítani
Eredmények Promoter-elemzés Tranziens expressziós vizsgálatok A Spiral, Spermidin-szintáz gén promoterrégióját a pgwb604 plazmidba építettük Ez a plazmid sgfp nevő riportergént tartalmaz: UV fényben egy zölden fluoreszkáló fehérjét kódol A Spiral gén promoterével még nem, de Spermidin-szintáz gén promoterével meggyızı eredményt kaptunk
Eredmények Tranziens expressziós vizsgálatok
Összefoglalás Meghatároztuk a Spiral, Spermidin-szintáz gén genomi ORF-jét és promoterrégióit A két gén kódoló szakaszát szensz és antiszensz orientációban bináris vektorokba ligáláltuk Megépítettük a két gén promoterrégióját tartalmazó bináris vektorokat Közvetett géntranszfer céljából a 6 konstrukcióval Agrobacterium tumefaciens C58C1 törzset transzformáltunk
Összefoglalás A Spiral gén szensz és antiszensz orientációjú konstrukcióival transzformáltunk MikroTom paradicsomot és szamócát Szamóca esetében DNS szinten bizonyítottuk a transzformáció sikerességét Tranziens expresszióval vizsgáltuk a két gén promoterrégióját A GFP zöld fluoreszcenciája bizonyította, hogy a Spermidin-szintáz gén promoterrégiója valóban promoter
Köszönetünket fejezzük ki a TÁMOP 4.2.2.B-10/1-2010-0011 programnak A Növénytudományi Doktori Iskola kutatásainak támogatásáért Kovács László predoktori ösztöndíjáért
Köszönöm a megtisztelı figyelmet!