Az Európai Bizottság 589/2014 dioxin rendelete és a TSQ 8000 Evo GC-MS/MS rendszer Dr. Kóréh Orsolya Unicam Magyarország Kft.
Tartalom POP és dioxin vegyületek Az új EU dioxin szabályozás EU rendelet a dioxin azonosítására Különbség a szűrővizsgálat (screening) és megerősítés között Azonosítás, érzékenység és linearitás Az új hármas kvadrupol GC-MS és az EU rendelet követelményei Érzékenység és linearitás Ismételhetőség és robosztusság Összehasonlítás a HR-MS adatokkal Összegzés: dioxin rendelet Az új TSQ 8000 Evo GC-MS/MS kiemelt műszaki paraméterei 2
Mik a dioxinok és miért szükséges a kimutatásuk? A mérgező és tartósan megmaradó szerves szennyezők az égés, klórfenol gyártás melléktermékeiként keletkeznek. kohászat, papíripar, Rákkeltők, hormonális és immunrendszert károsítják, születési rendellenességek, tanulási problémák okozói. Állati eredetű élelmiszer bevitelével kerülnek az emberi szervezetbe (80%). 17 poliklórozott dibenzo-p-dioxin és furán kongener toxikus. PCDD 75 kongener, 7 toxikus PCDFs 135 kongener, 10 toxikus Cl Cl Cl Cl O Cl O Cl Cl Cl Cl O Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl 4
A dioxinok elemzése SZŰRŐVIZSGÁLAT: GC-MS, GC-MS/MS, mágneses szektor, bioassay (CALUX) MEGERŐSÍTÉS: Mágneses szektor GC-MS és hármas kvadrupol GC-MS A dioxin nyomnyi mennyiségben található az élelmiszer és takarmánymintákban, így a detektáláshoz és azonosításhoz szelektív és érzékeny rendszer szükséges. A mágneses szektor tömegspektrométer érzékeny, de: Drága megvásárolni és drága üzemeltetni, szakértő kezelő szükséges GC-MS/MS érzékenysége megközelíti a szektor MS-t. EU dioxin rendelet változás 2014 április. Elérhető ár, sokoldalú, könnyű használat és karbantartás 5
POP elemzés munkafolyamata Mintaelőkészítés Élelmiszer, takarmány PCDD/F, PCB, OCP, BFR, toxafének,stb. Soxhlet ASE SPE Szűrővizsgálat Negatív (TEQ < ML) Elemzés kész GC-MS/MS Megerősítés Pozitív (TEQ > ML) Negatív Elemzés kész GC-HRMS Végső TEQ kiszámítás Pozitív Azonosítási riport LIMS rendszer 6
Screening és azonosítási módszerek definíciója Szűrővizsgálat: Nagy mintaszámú elemzés Kis fals negatív arány (< 1%) Korlátozott pontosság (<30 % RSD) Érzékenység 25%-kal az ML alatt Megerősítés: HRMS módszer szükséges Nagy pontosság (<15 % RSD) Nagy érzékenység Maximum Level (ML) TEQ 30 % RSD 15 % RSD Élelmiszer biztonság Screening Azonosítás 7 Source: EU Directives 96/23/EC, 1883/2006
Az ÚJ POP elemzés munkafolyamata Mintaelőkészítés Élelmiszer, takarmány PCDD/F, PCB, OCP, BFR, toxafének, stb. Soxhlett ASE FMS PowerPrep Szűrővizsgálat Negatív (TEQ < ML) Elemzés kész GC-MS/MS Megerősítés Pozitív (TEQ > ML) Negatív Elemzés kész GC-MS/MS Végső TEQ kiszámítás Pozitív Azonosítási riport LIMS rendszer 8
ÚJ EU Bizottság rendelet 2014 április SPECIFIKUS KÖVETELMÉNYEK, HOGY A GC-MS/MS MÓDSZER MEGFELELJEN A MEGERŐSÍTÉSNEK: Legalább 2 specifikus anyaion monitorozása, mindenik egy megfelelő specifikus leányionnal az összes jelzett és jelzetlen mérendő vegyület esetén A legfeljebb megengedett tolerencia a relatív ion intenzitás esetén ±15% a kiválasztott leányion és a számolt vagy mért értékek (kalibráló standardok átlaga) összevetésében, azonos MS/MS körülmények esetén, különösen az ütközési energia és ütközési gáz nyomása, a vegyület minden átmenete esetén. Minden kvadrupol felbontása egységnyi vagy annál jobb, hogy kiszűrhetők legyenek az interferenciák. A nemzetközi szabványokban vagy az EPA 1613 és 1668 módszerekben megadott követelmények teljesítése, kivéve a GC-HRMS használatának kötelezettsége. Érzékenység: megfelelőség az LOQ követelményekkel, WHO TEQ (Toxic Equivalent Quantities) Maximum Limits Linearitás - 5 (vagy több) relatív válaszjel (RRF) %RSD értéke minden nem jelzett PCDD/PCDF és jelzett belső standard esetén nem haladhatja meg a 20%-ot. 9
Azonosítás: Specifikus anyaion monitorozása 100 322 COCl vesztés 2378-TCDD 320 257 2378-TCDD 322 259 320 Legalább 2 specifikus anyaion monitorozása, mindkettő egy megfelelő specifikus leányionnal. 50 324 257 259 MS/MS Leányionok MS/MS Anyaionok 321 323 326 325 287 327 0 253 257 261 265 269 273 277 281 285 289 293 297 301 305 309 313 317 321 325 329 (mainlib) 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin 10
12 TSQ8000 Evo GC-MS/MS Megfelelőség az EU rendeletnek
Azonosítás: specifikus anyaionok monitorozása SRM átmenetek és a kapcsolódó CE értékek optimálása nagy koncentrációjú dioxin standardok (EPA 1613CS5) és AutoSRM funkció alkalmazásával Compound RT Quan Conf CE 13-2378-TCDF 10.43 315.94 251.97 26 13-2378-TCDF 10.43 317.94 253.97 26 2378-TCDF 10.44 303.89 240.94 26 2378-TCDF 10.44 305.89 242.94 26 13-1234-TCDD 10.49 331.94 267.97 20 13-1234-TCDD 10.49 333.93 269.97 20 2378-TCDD 10.63 319.89 256.93 20 2378-TCDD 10.63 321.89 258.93 20 13-2378-TCDD 10.63 331.94 267.97 20 13-2378-TCDD 10.63 333.93 269.97 20 13-12378-PeCDF 11.83 351.89 287.93 26 13-12378-PeCDF 11.83 353.89 289.93 26 12378-PeCDF 11.84 339.86 276.89 26 12378-PeCDF 11.84 341.86 278.89 26 13-23478-PeCDF 12.24 351.89 287.93 26 13-23478-PeCDF 12.24 353.89 289.93 26 23478-PeCDF 12.25 339.86 276.89 26 23478-PeCDF 12.25 341.86 278.89 26 13-12378-PCDD 12.39 367.89 303.93 22 13-12378-PCDD 12.39 369.89 305.89 22 12378-PeCDD 12.4 355.85 292.89 20 12378-PeCDD 12.4 357.85 294.89 20 13-123478-HxCDF 13.91 383.86 319.89 26 13-123478-HxCDF 13.91 385.86 321.89 26 123478-HxCDF 13.92 371.82 308.86 28 123478-HxCDF 13.92 373.82 310.86 28 13-123678-HxCDF 13.99 383.86 319.89 26 13-123678-HxCDF 13.99 385.86 321.89 26 123678-HxCDF 14 371.82 308.86 28 123678-HxCDF 14 373.82 310.86 28 13-234678-HxCDF 14.39 383.86 319.89 26 13-234678-HxCDF 14.39 385.86 321.89 26 234678-HxCDF 14.4 371.82 308.86 28 234678-HxCDF 14.4 373.82 310.86 28 13-123478-HxCDD 14.5 399.86 335.89 20 13-123478-HxCDD 14.5 401.86 337.89 20 123478-HxCDD 14.51 387.82 324.86 20 123478-HxCDD 14.51 389.82 326.85 20 13-123678-HxCDD 14.58 399.86 335.89 20 13-123678-HxCDD 14.58 401.86 337.89 20 123678-HxCDD 14.59 387.82 324.86 20 123678-HxCDD 14.59 389.82 326.85 20 13-123789-HxCDD 14.78 399.86 335.89 20 13-123789-HxCDD 14.78 401.86 337.89 20 123789-HxCDD 14.79 387.82 324.86 20 123789-HxCDD 14.79 389.82 326.85 20 13-123789-HxCDF 15.03 383.86 319.89 26 13-123789-HxCDF 15.03 385.86 321.89 26 123789-HxCDF 15.04 371.82 308.86 28 123789-HxCDF 15.04 373.82 310.86 28 13-1234678-HpCDF 16.28 419.82 355.86 28 13-1234678-HpCDF 16.28 421.82 357.85 28 1234678-HpCDF 16.29 407.78 344.82 26 1234678-HpCDF 16.29 409.78 346.82 26 13-1234678-HpCDD 17.3 435.82 371.85 20 13-1234678-HpCDD 17.3 437.81 373.85 20 1234678-HpCDD 17.32 423.78 360.81 20 1234678-HpCDD 17.32 425.77 362.81 20 13-1234789-HpCDF 17.78 419.82 355.86 28 13-1234789-HpCDF 17.78 421.82 357.85 28 1234789-HpCDF 17.79 407.78 344.82 26 1234789-HpCDF 17.79 409.78 346.82 26 13-OCDD 20.46 469.78 405.81 20 13-OCDD 20.46 471.78 407.81 20 OCDD 20.47 457.74 394.77 20 OCDD 20.47 459.74 396.77 20 OCDF 20.62 441.76 378.79 26 OCDF 20.62 443.76 380.79 26 13
Érzékenység: TSQ8000 Evo LOD megfelelősége az LOQ-nak EU Bizottság irányelve: LOQ a kalibráció legalsó pontja, amely elfogadható (<30%) és állandó eltérést ad a kalibráció minden pontja esetén számolt átlag RRF értékhez képest. A TSQ 8000 Evo érzékenység teszt esetén az EPA 1613B CS1 standard hígítási sorát alkalmazták. Az LOQ-t 99 %-os megbízhatósági értékkel számolták ki, statisztikai módszereket alkalmazva, minden hígítási pont esetén 10 x ismétléssel. 14
Érzékenység: TSQ8000 Evo LOD megfelelősége az LOQ-nak LOQ megadása: a leghígabb kalibrálási standard (CSL) n=10 injektálása és 3 egymás utáni hígítási sor elkészítése Vegyület pg/μl 2378-TCDF 0.01 2378-TCDD 0.01 12378-PeCDF 0.02 23478-PeCDF 0.02 12378-PeCDD 0.02 123478-HxCDF 0.04 123678-HxCDF 0.04 234678-HxCDF 0.03 123478-HxCDD 0.06 123678-HxCDD 0.03 123789-HxCDD 0.04 123789-HxCDF 0.04 1234678-HpCDF 0.02 1234678-HpCDD 0.05 1234789-HpCDF 0.02 OCDD 0.05 OCDF 0.03 15
Érzékenység: TSQ8000 Evo LOD megfelelőség az LOQ-nak 2378-TCDD érzékenysége mint csúcs alatti terület EPA-1613CSL hígítás 1:1 (balra) és EPA-1613CSL hígítatlan (jobbra). Injektálás: 2 µl, splitless. TCDD 0.05 pg/µl TCDD 0.1 pg/µl PA= 5767 PA= 10702 16
Válaszjel linearitása: TSQ8000 Evo eredmények Átlag RF értékek számolása EPA1613 CSL - CS4 standard 17
Linearitás 2378-TCDD Koncentráció tartomány: 0.1 40 pg/µl 40 pg/µl 0.1 pg/µl 18
Linearitás: TSQ8000 Evo megfelelőség EPA 1613 RRF kiszámolása 17 nativ PCDF/PCDD vegyület esetén a kalibrációs görbéből (CSL CS4). 5 (vagy több) relatív válaszjel (RRF) %RSD értéke minden nem jelzett PCDD/PCDF és jelzett belső standard esetén nem haladhatja meg a 20%-ot. 20 Compound RF area CSL RF area CS0.5 RF area CS1 RF area CS2 RF area CS3 RF area CS4 average STDEV %RSD 2378-TCDF 1.09 1.01 1.05 1.04 1.05 1.05 1.05 0.03 2.4 12378-PeCDF 0.98 0.99 1.0 1.02 1.02 1.01 1.0 0.01 0.6 23478-PeCDF 1.02 1.03 1.01 1.01 1.01 1.02 1.01 0.01 0.9 123478-HxCDF 0.99 1.03 1.0 1.04 1.03 1.03 1.02 0.02 1.6 123678-HxCDF 1.05 1.03 1.0 1.01 1.01 1.01 1.02 0.01 1.4 234678-HxCDF 0.98 1.02 1.07 1.08 1.08 1.08 1.05 0.02 2.1 123789-HxCDF 0.95 0.94 0.93 0.95 0.95 0.96 0.95 0.01 0.8 1234678-HpCDF 1.07 1.03 1.09 1.02 1.03 1.04 1.05 0.03 2.4 1234789-HpCDF 1.08 1.04 1.05 1.04 1.04 1.03 1.05 0.01 1.1 OCDF 1.49 1.56 1.53 1.51 1.58 1.53 1.53 0.03 2.1 2378-TCDD 1.11 1.09 1.12 1.07 1.08 1.13 1.10 0.02 1.9 12378-PeCDD 1.02 1.05 1.08 1.07 1.09 1.10 1.07 0.01 1.2 123478-HxCDD 1.27 1.19 1.20 1.27 1.24 1.23 1.24 0.03 2.7 123678-HxCDD 1.27 1.19 1.20 1.27 1.24 1.23 1.24 0.03 2.7 123789-HxCDD 1.44 1.46 1.48 1.63 1.56 1.58 1.53 0.04 2.7 1234678-HpCDD 1.07 1.08 1.10 1.11 1.12 1.11 1.1 0.01 0.6 OCDD 1.16 1.11 1.07 1.06 1.08 1.08 1.09 0.02 2.2 2378-TCDD 13C12 STD 1.38 1.39 1.35 1.33 1.36 1.33 1.36 0.02 1.1 2378-TCDF 13C12 STD 2.45 2.44 2.31 2.3 2.29 2.3 2.35 0.04 1.5 12378-PeCDD 13C12 STD 1.19 1.12 1.03 1.06 1.06 1.05 1.09 0.04 3.5 12378-PeCDF 13C12 STD 1.97 1.94 1.79 1.85 1.79 1.87 1.87 0.06 3.2 23478-PeCDF 13C12 STD 2.06 2 1.88 1.9 1.89 1.91 1.94 0.05 2.4 123478-HxCDD 13C12 STD 0.71 0.73 0.71 0.67 0.72 0.68 0.7 0.02 3.0 123678-HxCDD 13C12 STD 0.71 0.73 0.71 0.67 0.72 0.68 0.7 0.02 3.0 123478-HxCDF 13C12 STD 1.22 1.27 1.18 1.13 1.21 1.13 1.19 0.04 3.5 123678-HxCDF 13C12 STD 1.17 1.2 1.14 1.07 1.14 1.07 1.13 0.04 3.2 234678-HxCDF 13C12 STD 1.2 1.27 1.13 1.07 1.13 1.09 1.15 0.05 4.7 123789-HxCDF 13C12 STD 1.23 1.19 1.23 1.17 1.21 1.16 1.2 0.02 2.0 1234678-HpCDD 13C12 STD 0.61 0.6 0.56 0.54 0.57 0.57 0.57 0.02 2.9 1234678-HpCDF 13C12 STD 0.98 0.94 0.89 0.88 0.91 0.88 0.91 0.02 2.5 1234789-HpCDF 13C12 STD 0.94 0.92 0.92 0.89 0.93 0.91 0.92 0.01 1.4 OCDD 13C12 STD 0.4 0.41 0.43 0.4 0.43 0.42 0.42 0.01 2.7
Ismételhetőség csúcs alatti terület Csúcs alatti terület ismételhetősége n=16 injektálás a leghígabb standardból (CSL): Koncentráció 18 15 12 9 6 3 0 Tetra-Cl: Penta-Cl-Hepta-Cl: Octa-Cl: 0.1 pg/µl 0.5 pg/µl 1.0 pg/µl %RSD 2378-TCDD Inj. no Filename Peak area 1 107 8513 2 106 7739 3 105 8120 4 104 7989 5 103 9439 6 102 8613 7 101 8528 8 100 9569 9 99 9694 10 98 8326 11 97 9574 12 96 9904 13 95 8209 14 94 9670 15 93 9419 16 92 8276 average 8849 sd 730 %CV 8.3 21
Ismételhetőség Ionarány Ionarány (menny/kon) ismételhetőség, CSL standard Eltérés (%) az elméleti értéktől ±15%. 1,4 Compound theoretical Average Std.Dev %RSD % difference 1,2 1.9 2378-TCDD 1.04 1.06 0.11 10.5 1.9 12378-PeCDD 0.48 0.48 0.02 4.2 0.0 1 123478-HxCDD 0.63 0.62 0.04 6.5-1.6 123678-HxCDD 0.63 0.65 0.06 9.2 3.2 123789-HxCDD 0.63 0.63 0.03 4.8 0.0 1234678- HpCDD 0.79 0.80 0.05 6.3 1.3 OCDD 1.04 0.94 0.05 5.3-9.6 0,8 0,6 0,4 0,2 0.0 1.6 3.2 0.0 1.3 9.6 1.9 0.0 0.0 0.0 3.2 1.6 0.0 0.0 0.0 10.6 2378-TCDF 1.04 1.06 0.09 8.5 1.9 12378-PeCDF 0.48 0.48 0.01 2.1 0.0 0 23478-PeCDF 0.48 0.48 0.02 4.2 0.0 123478-HxCDF 0.63 0.63 0.03 4.8 0.0 123678-HxCDF 0.63 0.65 0.03 4.6 3.2 234678-HxCDF 0.63 0.64 0.02 3.1 1.6 123789-HxCDF 0.63 0.63 0.01 1.6 0.0 1234678- HpCDF 0.79 0.79 0.03 3.8 0.0 1234789- HpCDF 0.79 0.79 0.02 2.5 0.0 theoretical Average OCDF 1.04 0.93 0.03 3.2-10.6 22
2378-TCDD 12378-PeCDD 123478-HxCDD 123678-HxCDD 123789-HxCDD 1234678-HpCDD OCDD 2378-TCDF 12378-PeCDF 23478-PeCDF 123478-HxCDF 123678-HxCDF 234678-HxCDF 123789-HxCDF 1234678-HpCDF 1234789-HpCDF OCDF Ismételhetőség Ionarány CS3 kalibrációs ellenőrző standard 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 CS3 ion ratios average 0,20 0,00 15,00 10,00 5,00 0,00 % difference -5,00-10,00 23-15,00
Reprodukálhatóság - Ionarány CSL 1613 pontossági teszt Ionarány reprodukálhatósága (%RSD) n=14 ismételt injektálás CSL standard. 14 12 10 8 6 4 native labelled IS 2 0 24
Reprodukálhatóság - Ionarány CSL 1613 pontossági teszt QC határok az elméleti közelében IR: ± 15% 1,4 1,2 3.3 1 0,8 13.0 0.4 11.0 0,6 0,4 5.5 2.6 1.5 0.0 2.1 1.6 2.8 0.9 2.5 2.6 1.8 2.6 3.2 theoretical average 0,2 0 25
26 TSQ8000 Evo GC-MS/MS Szelektivitás és rutin alkalmazás
Összehasonlítás a HR-GC-MS adatokkal Öt valós minta (takarmány, tej, 3 hal), GC-HRMS és TSQ 8000 Evo dioxin mérési eredményeinek összehasonlítása. Dioxin tartalom megadása a WHO alapján: pg TEQ/g zsír 27
Calculated concentration (pg/g) Eredmények: mátrix minták, spike-olt takarmány Belső referenciaanyag: spike-olt takarmány (0686/2012-PX). Minta spike-olása: CSL szint (TCDD/F 0.1 pg/µl, PeCDD/F HpCDD/F 0.5 pg/µl, OCDD/F 1.0 pg/µl. 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0686/2012-PX HRGC-MS gc-ms/ms 0,40 0,20 0,00 28
2,3,7,8-TeCDD 1,2,3,7,8-PeCDD 1,2,3,4,7,8-HxCDD 1,2,3,6,7,8-HxCDD 1,2,3,7,8,9-HxCDD 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD OCDD 2,3,7,8-TeCDF 1,2,3,7,8-PeCDF 2,3,4,7,8-PeCDF 1,2,3,4,7,8-HxCDF 1,2,3,6,7,8-HxCDF 1,2,3,7,8,9-HxCDF 2,3,4,6,7,8-HxCDF 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF OCDF Eredmények: mátrix minták, spike-olt takarmány % különbség GC-HRMS 50 40 30 20 10 0-10 -20-30 -40-50 29
% difference WHO TEQ összehasonlítás GC-HRMS adatokkal GC-MS/MS és GC-HRMS adatok közti különbség PCDD/F pg TEQ /g. 25 PCDF/PCDD TEQ pg/g 20 15 10 5 0-5 AL ML fish 1 fish 3 fish 2 0 1 2 milk 3 4 5 6 feed -10 AL ML -15-20 -25 AL ML TEQ pg/g 30
Feladatra optimált POP adatkiértékelés TSQ8000 Evo TargetQuan szoftver POP elemzésre kifejlesztve, tartalmazza az EPA 1613 or EPA1668 speciális számolási algoritmust Alkalmas mennyiségi elemzésre,izotóp hígítási technika RRF mennyiségi elemzés Kiszámolja a TEQ értékeket (alacsony, középső, felső értékek) Tartományon kívül eső ionarányok jelzése Megfelel az EPA 1613 B módszernek Automatizált QA/QC ellenőrzés 31
Összegzés: az új EU dioxin szabályozás EU bizottság GC-MS/MS azonosítási kritériumok 2 specifikus anyaion 2 specifikus leányionnal TSQ 8000 Evo GC-MS/MS teljesítménye Módszerfejlesztés a követelmények alapján Teljesen optimált AutoSRM Megfelelőség igazolása Igen Ionarányok toleranciája ±15 % <10 % EPA 1613 CSL n=14 Igen Kvadrupolok felbontása egységnyi vagy jobb 5 (vagy több) RRF RSD <20 % minden jelzetlen PCDD/PCDF és jelzett belső standard esetén Módszerfejlesztés Q1 és Q3 0,7 Da 6 pontos kalibráció EPA 1613 CSL- CS4 2% Igen Igen 32
33 Változó jogszabályok Nyomnyi koncentrációk Több komponens, összetett mátrix Kevesebb idő
EvoCell - 666 komponens rizsből (5496 SRM) Szélsőséges körülmények között is (>5000 SRM) átlag LOD 1.83 ppb (262 megmért peszticidre) Hagyományos ütközési cella: átlag LOD 2.63 ppb 1300 SRM Expect More Capacity 36
Timed SRM Expect More Capacity 37
A teljes ionforrás kivétele vákuumvesztés nélkül Ionforrás csere a rendszer lelevegőztetése nélkül A karbantartás offline elvégezhető 24/7 üzemeltetés egy tartalék ionforrással Expect More Robustness 41
TRACE 1300 gázkromatográf Moduláris felépítés, könnyen, felhasználó által cserélhető injektorok és detektorok Percek alatt új műszaki tartalom 45
46 Köszönöm a figyelmet!