Biomolekuláris rendszerek vizsgálata

Hasonló dokumentumok
Biomolekuláris rendszerek. vizsgálata. Semmelweis Egyetem. Osváth Szabolcs. A mikroszkópok legfontosabb típusai

Biomolekuláris rendszerek. vizsgálata. Semmelweis Egyetem. Osváth Szabolcs

Biomolekuláris rendszerek. vizsgálata. Semmelweis Egyetem. Osváth Szabolcs

Biomolekuláris rendszerek vizsgálata

A biológiai anyag vizsgálatának mikroszkópi módszerei

Kis Petik Katalin. Semmelweis Egyetem. Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet

Fény- és fluoreszcens mikroszkópia. A mikroszkóp felépítése Brightfield mikroszkópia

Áttekintés 5/11/2015 MIKROSZKÓPIAI MÓDSZEREK 1 FÉNYMIKROSZKÓPIA FLUORESZCENCIA MIKROSZKÓPIA. Mikroszkópia, fénymikroszkópia

Rövid ismertető. Modern mikroszkópiai módszerek. A mikroszkóp. A mikroszkóp. Az optikai mikroszkópia áttekintése

Modern mikroszkópiai módszerek

Mikroszerkezeti vizsgálatok

Atomi és molekuláris kölcsönhatások. Pásztázó tűszondás mikroszkópia.

d z. nsin

Mozgékony molekulák vizsgálata modern mikroszkópiával

Ragyogó molekulák: dióhéjban a fluoreszcenciáról és biológiai alkalmazásairól

Pásztázó mikroszkópiás módszerek

OPTIKA. Vozáry Eszter November

5/11/2015 MIKROSZKÓPIAI MÓDSZEREK 2 FLUORESZCENCIÁN ALAPULÓ MODERN MIKROSZKÓPIAI MÓDSZEREK. Fluoreszcencia mikroszkópia

2008 Small World contest -18th Prize - Dr. Tamily Weissman (Harvard University - Cambridge, Massachusetts, United States) Specimen: Brainbow

PÁSZTÁZÓSZONDÁS MIKROSZKÓPIA

Speciális fluoreszcencia spektroszkópiai módszerek

A nanotechnológia mikroszkópja

ELTE Fizikai Intézet. FEI Quanta 3D FEG kétsugaras pásztázó elektronmikroszkóp

A szubmikronos anyagtudomány néhány eszköze. Havancsák Károly ELTE TTK Központi Kutató és Műszer Centrum július.

Fluoreszcencia módszerek (Kioltás, Anizotrópia, FRET)

Modern mikroszkópiai módszerek

Havancsák Károly Nagyfelbontású kétsugaras pásztázó elektronmikroszkóp az ELTÉ-n: lehetőségek, eddigi eredmények

Abszorpciós spektroszkópia

A nanotechnológia mikroszkópjai. Havancsák Károly, január

Az elektron hullámtermészete. Készítette Kiss László

Az elektromágneses hullámok

Nanotudományok vívmányai a mindennapokban Lagzi István László Eötvös Loránd Tudományegyetem Meteorológiai Tanszék

Havancsák Károly Az ELTE TTK kétsugaras pásztázó elektronmikroszkópja. Archeometriai műhely ELTE TTK 2013.

MIKRO- ÉS NANOTECHNIKA II: NANOTECHNOLÓGIA

Tartalomjegyzék. Emlékeztetõ. Emlékeztetõ. Spektroszkópia. Fényelnyelés híg oldatokban A fény; Abszorpciós spektroszkópia

Fluoreszcencia módszerek (Kioltás, Anizotrópia, FRET) Modern Biofizikai Kutatási Módszerek

Fluoreszcencia 2. (Kioltás, Anizotrópia, FRET)

Pásztázó elektronmikroszkóp. Alapelv. Szinkron pásztázás

MIKROSZKÓPIA. "mikrosz" (kicsiny) "szkopeo" (nézek)

BIOFIZIKA. Metodika- 1. Liliom Károly. MTA TTK Enzimológiai Intézet

Tartalomjegyzék. Emlékeztetõ. Emlékeztetõ. Spektroszkópia. Fényelnyelés híg oldatokban 4/11/2016. A fény; Abszorpciós spektroszkópia

Modern mikroszkópiai technikák

Az elektromágneses spektrum

Bevezetés a fluoreszcenciába

Az elektromágneses sugárzás kölcsönhatása az anyaggal

Optikai mikroszkópia. Bereznai Miklós SZTE Optika és Kvantumelektronikai Tanszék

BIOFIZIKA. Metodika- 2. Liliom Károly. MTA TTK Enzimológiai Intézet

ALKÍMIA MA Az anyagról mai szemmel, a régiek megszállottságával.

OPTIKA. Fénykibocsátás mechanizmusa fényforrás típusok. Dr. Seres István

Műszeres analitika. Abrankó László. Molekulaspektroszkópia. Kémiai élelmiszervizsgálati módszerek csoportosítása

Biofizika. Sugárzások. Csik Gabriella. Mi a biofizika tárgya? Mi a biofizika tárgya? Biológiai jelenségek fizikai leírása/értelmezése

Fókuszált ionsugaras megmunkálás

A fluoreszcencia orvosibiológiai. alkalmazásai. Fluoreszcencia forrása I. Fluoreszcencia alkalmazások. Kellermayer Miklós

Az áramlási citométer és sejtszorter felépítése és működése, diagnosztikai alkalmazásai

MIKROSZKÓPIA. "mikrosz" (kicsiny) "szkopeo" (nézek)

In vivo szövetanalízis. Különös tekintettel a biolumineszcens és fluoreszcens képalkotási eljárásokra

Atomi, illetve molekuláris kölcsönhatások és alkalmazásaik

Feloldóképesség Mikroszkópos módszerek. DIC mikroszkópia. Fáziskontraszt mikroszkópia. Barkó Szilvia A MIKROSZKÓPIA RÖVID TÖRTÉNETE

6. Fehérjék kimutatása. Biokémiai és sejtszintű vizsgálatok

Alapvető eljárások Roncsolásmentes anyagvizsgálat

Quanta 3D SEM/FIB Kétsugaras pásztázó elektronmikroszkóp. Havancsák Károly

E (total) = E (translational) + E (rotation) + E (vibration) + E (electronic) + E (electronic

Mikroszkóp vizsgálata Lencse görbületi sugarának mérése Folyadék törésmutatójának mérése

Laterális feloldás és képminőség javítása vonalpásztázó tomográfiás optikai mikroszkópban

11.3. Az Achilles- ín egy olyan rugónak tekinthető, amelynek rugóállandója N/m. Mekkora erő szükséges az ín 2 mm- rel történő megnyújtásához?

Abszorpciós fotometria

a. Nyugalmi potenciál b. Transzport proteinek c. Akciós potenciál. Nyugalmi potenciál. 3 tényező határozza meg:

6. Fehérjék kimutatása. Biokémiai és sejtszintű vizsgálatok

Abszorpció, emlékeztetõ

6. Fehérjék kimutatása. Biokémiai és sejtszintű vizsgálatok

Nusser Zoltan. Celluláris Idegélettani Laboratórium MTA Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet Budapest

NANOMEDICINA BIONIKA

Egy idegsejt működése. a. Nyugalmi potenciál b. Transzport proteinek c. Akciós potenciál

Sugárzás és anyag kölcsönhatásán alapuló módszerek

Biofizika 2 Fizika-Biofizika

Röntgensugárzás az orvostudományban. Röntgen kép és Komputer tomográf (CT)

Abszorpciós fotometria

Búza tartalékfehérjék mozgásának követése a transzgénikus rizs endospermium sejtjeiben

Citoszkeleton. Sejtek rugalmassága. Polimer mechanika: Hooke-rugalmasság. A citoszkeleton filamentumai. Fogászati anyagtan fizikai alapjai 12.

Név... intenzitás abszorbancia moláris extinkciós. A Wien-féle eltolódási törvény szerint az abszolút fekete test maximális emisszióképességéhez

Szentjánosbogár, trópusi halak, sarki fény Mi a közös a természet fénytüneményeiben?

Fényérzékeny amorf nanokompozitok: technológia és alkalmazásuk a fotonikában. Csarnovics István

Finomszerkezetvizsgálat

Szerkezetvizsgálat szintjei

MIKROSZKÓPIA. "mikrosz" (kicsiny) "szkopeo" (nézek)

Röntgen-gamma spektrometria

A módszerek jelentősége. Gyors-kinetika módszerek. A módszerek közös tulajdonsága. Milyen módszerekről tanulunk?

Jelátvitel az idegrendszerben:

Hemoglobin - myoglobin. Konzultációs e-tananyag Szikla Károly

TANULÓI KÍSÉRLET (45 perc)

Lumineszcencia spektrometria összefoglaló

Szerkezetvizsgálat ANYAGMÉRNÖK ALAPKÉPZÉS (BSc)

Gamma-röntgen spektrométer és eljárás kifejlesztése anyagok elemi összetétele és izotópszelektív radioaktivitása egyidejű elemzésére

Biofizika szeminárium. Diffúzió, ozmózis

Fókuszált ionsugaras megmunkálás

Kutatóegyetemi Kiválósági Központ 1. Szuperlézer alprogram: lézerek fejlesztése, alkalmazásai felkészülés az ELI-re Dr. Varjú Katalin egyetemi docens

Optika és Relativitáselmélet II. BsC fizikus hallgatóknak

A fény mint elektromágneses hullám és mint fényrészecske

Modern Biofizikai Kutatási Módszerek Kereskedelmi forgalomban kapható készülékek. Áramlási citometria (flow cytometry)

Nanomedicina Szimpózium, Nanomechanika: Egyedi Biomolekulák Manipulálása. Kellermayer Miklós

Átírás:

A mikroszkópok legfontosabb típusai Biomolekuláris rendszerek vizsgálata Osváth Szabolcs Semmelweis Egyetem - optikai mikroszkópok (Optical Microscope) - elektron mikroszkópok (Electron Microscope) - pásztázó mikroszkópok (Scanning Probe Microscope) Hans Jansen és Zacharias Jansen 1590-ben összetett mikroszkópot épít Antoni van Leeuwenhoek (Thonis Philipszoon) 1632-1723 1674-ben egyszerű mikroszkópot készít

Összetett mikroszkóp optikai útja Végtelenre korrigált optika Köhler megvilágítás Mikroszkóp objektív lencsék 1893-ban találta fel August Köhler a Carl Zeiss műveknél.

Mikroszkóp objektívek felépítése Színkorrekció Plánkorrekció Fényvisszaverődés a felszíneken

Numerikus apertúra Point Spread Function (PSF) A PSF a mikroszkóp átviteli függvénye. A (fluoreszcens) tárgy egy pontjának képe, nem egy pont, hanem adott intenzitáseloszlású folt. Ez a tulajdonság a fény hullámtermészetének a következménye. Az objektív segítségével egy térrészbe lehet a fényt fókuszálni, nem egy pontba. A numerikus apertúra hatása a PSF-re A fény hullámtermészetének hatása a képre

A fény hullámtermészetének hatása a képre Abbe elv Airy korongok A mikroszkópban akkor és csak akkor tudunk feloldani két tárgypontot, ha az elhajlott fényhullámból a főmaximumon kívül legalább az első rendben elhajlott fény is részt vesz a képalkotásban. d sin α = k λ Abbe összefüggés Ernst Karl Abbe (1840-1905) δ = 0,61 λ / (n sinω) Hallgatólagos feltevések: - a minta különböző részeiről egyszerre alkotunk képet Fizikus és társadalomreformer Az optikai eszközök gyártását tudományos alapokra helyezte. - a minta részleteit úgy különböztetjük meg, hogy a róluk jövő fény a létrejövő képben megkülönböztethető képfoltokat ad.

Objektívek numerikus apertúrája Fluoreszcencia mikroszkóp A konfokális fluoreszcencia mikroszkóp működése Epifluoreszcens és konfokális mikroszkóp összehasonlítása epifluoreszcens konfokális humán medulla nyúl izom pollen

Térbeli szeletelés Konfokális mikroszkóp Tubulin mikrotubulusok rekombináns tubulint kifejező sejtekben. Konfokális mikroszkóp Dendritikus sejt pollen szemcséket takarít el. Konfokális mikroszkópi technikával készített 3D kép. A kétfotonos mikroszkóp működési elve

Kétfotonos mikroszkópia Élőlények fluoreszcencia mikroszkópos tanulmányozása, nanosebészet Zöld fluoreszcens fehérjét (GFP) kifejező transzgenikus egerek vizuális kortexének kétfotonos mikroszkóppal készült képe. Caenorhabditis elegans 302 neuronja közül egyetlen idegsejt axonjának átvágása Egyedi sejtek fluoreszcencia mikroszkópos tanulmányozása, nanosebészet FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Az energiatranszfer hatásfoka: E = R 06 /(R 06 + r 6 ) Ahol R 0 a festékpárra jellemző állandó, r a festékek közötti távolság. Egyetlen mitokondrium elpusztítása élő szarvasmarha epitheliális sejtben

Fluoreszcens indikátorok FRET alkalmazások: távolságmérés Ioncsatorna működése a helyi ionkoncentráció mérése alapján Molekulán belüli konformációs változások Ionkoncentráció és konformációs változások együttes mérése Asszociáció és disszociáció Az ideális fluorofór Fluoreszcens kvantumpöttyök - kicsi - hidrofil - a látható tartományban nyel el és emittál - nagy Stokes eltolódás - specifikus kötődés (biotin/avidin, His-tag/Ni, antitest/antigén, NH2, SH) - fényes (abszorpció*fluoreszcencia hatásfok) - nem, vagy lassan ég ki - nem csinál fotokémiai reakciókat - nem pislog www.probes.com (Invitrogen) (a) CdSe-ből ZnS borítással készült kvantumpöttyök fluoreszcenciamikroszkópos képe A kvantumpöttyök mérete határozza meg az emittált fluoreszcencia színét. (b) tíz eltérő méretű, ezért elérő színben fluoreszkáló CdSe/ZnS kvantumpötty

Fluoreszcens kvantumpöttyökkel jelölt rákos daganatok Fluoreszcens fehérjék Aequorea victoria (medúza) GFP (Green Fluorescent Protein) 2008. évi kémiai Nobel díj Osamu Shimomura a '60 as években izolálta és elkezdte tanulmányozni Douglas Prasher 1992-ben klónozta és szekvenálta a génjét Martin Chalfie 1994-ben génkifejeződés indikátoraként használta Roger Y. Tsien 1995-ben előállított az első javított változatot Acropora millepora (korall) A fluoreszcens fehérjék sokfélesége A képet teljes egészében fluoreszcens fehérjéket kifejező baktériumokkal festették.

Fluoreszcens jelölő módszerek párhuzamos alkalmazása Egyedi molekulák vizsgálata Plenty of Room at the Bottom Öt különböző módszerrel megfestett HeLa sejtek. A vonal 20 µm hosszú. " The principles of physics, as far as I can see, do not speak against the possibility of maneuvering things atom by atom. It is not an attempt to violate any laws; it is something, in principle, that can be done; but in practice, it has not been done because we are too big." Richard Feynman, 1959 Hullám-részecske kettősség Hullám-részecske kettősség Louis De Broglie: λ = h/p fluorofullerén C 60 F 48 1632 Da tetrafenilporfirin C 44 H 30 N 4 Grafitról készült Pásztázó Alagútmikroszkópi (Scanning Tunneling Microscope, STM) kép

Egyedi Alexa molekulák kvarc felszínen Egyedi F1 motor (ATP szintáz) forgó mozgása [2 /64] 4 4 [2 /64] 0 max5000 photons Intensity [counts/bin] collected in total from a single dye Fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia (FCS) Autokorrelációs függvény egyensúly körüli fluktuációk megfigyelt térrész: fl koncentráció: 10 nm molekulák számának időátlaga: 6 Fluoreszcencia fluktuációk τ d - a karakterisztikus ideje annak, hogy egy molekula átdiffundáljon a fókusztérfogaton γ - a PSF alaki tényezője N a fókusztérfogatban lévő átlagos molekulaszám

Mikor mit határozzunk meg Abbe elv Ligandumkötődés kis jelölt ligandum+nagy fehérje Aggregáció jelölt fehérjék dimerei diffúziós állandó fényesség Koncentráció pl. nagy aggregátumok számának megállapítása az oldatban több komponens illesztése, PCH és autokorreláció Reakciósebesség autokorreláció illesztése modellel Diffúzió a sejt belsejében vagy membránban autokorreláció a megfelelő modellel illesztve A mikroszkópban akkor és csak akkor tudunk feloldani két tárgypontot, ha az elhajlott fényhullámból a főmaximumon kívül legalább az első rendben elhajlott fény is részt vesz a képalkotásban. δ = 0,61 λ / (n sinω) Hallgatólagos feltevések: a minta különböző részeiről egyszerre alkotunk képet; a minta részleteit úgy különböztetjük meg, hogy a róluk jövő fény a létrejövő képben megkülönböztethető képpontokat (foltokat) ad. Szuperrezolúciós mikroszkóp Abbe elv a minta térbeli frekvenciái szempontjából A szuperrezolúciós mikroszkópi technikák kidolgozásáért 2014-ben kémiai Nobel díjat kaptak: Eric Betzig Stefan W. Hell William E. Moerner A képben lévő térbeli frekvenciákból a mikroszkóp objektív csak egy szűk tartományt enged át, ami korlátozza a térbeli feloldást.

Strukturált megvilágításos mikroszkóp Strukturált megvilágításos mikroszkóp Hagyományos (bal) és strukturált megvilágításos mikroszkópi kép (jobb) idegsejtekről. STimulated Emission Depletion (STED) mikroszkóp STimulated Emission Depletion (STED) mikroszkóp Stefan Hell úttörő munkája nyomán Szinaptolizin szerveződése az újra-hasznosított szinaptikus vezikulákban. I max a használt maximális STED intenzitás I s a STED telítési intenzitása

Lokalizáció Lokalizáció és kolokalizáció A PSF illesztése alapján nm pontossággal tudjuk megállapítani a jelölt makromolekula helyét. Két különböző színű kromofór helyének megállapítása. A kolokalizáció nem feltétlen jelent kölcsönhatást. Photo-Activated Localization Microscopy (PALM) Eric Betzig és Harald Hess találmánya nyomán Photo-Activated Localization Microscopy (PALM) CD63, lizoszóma transzmembrán fehérje

Interferometric Photo-Activated Localization Microscopy (ipalm) Interferometric Photo-Activated Localization Microscopy (ipalm) Mikrotubulus szerkezete PtK1 sejtekben, amelyek humán tubulinhoz fuzionált m-kikgr fluorofórt fejeznek ki. Axonok citoszkeletális szerkezete Szuperrezolúciós technikák összehasonlítása

Pásztázó tűszondás mikroszkópok (Scanning Probe Microscopy SPM) A mikroszkópok olyan családja, amely a minta felszínének domborzati képét hozza létre. Egy hegyes tűvel pásztázzunk a felszínt és a hegy-minta kölcsönhatást mérjük. Atomerő mikroszkóp (Atomic Force Microscopy - AFM) AFM: a mért kölcsönhatás a hegy és minta közötti erő lézer STM feltalálói (1981): Heinrich Rohrer and Gerd Binnig 1986- ban Nobel díjat nyertek ezért a munkájukért lencse kvadráns dióda pásztázó tű minta piezoelektr. asztal A tű és a minta közötti erő A tű jellemzői: - tipikusan 100 μm hosszú, 1μm vastag, V alakú - kis rugóállandó - nagy rezonanciafrekvencia - szilícium (-oxid, -nitrid) Erő Contact Mode AFM A tű és a minta állandó kontaktusban vannak. A taszító tartományban dolgozik. Állandónak tartja az erőt: követi a felszín hullámzását. A mérőrugó függőleges deformációját detektáljuk. Lokális erő spektroszkópia: a felület egy adott pontjában az erő/elmozdulás függvény. taszítás vonzás Távolság Tapping Mode AFM A tű 20-100 nm amplitúdójú rezgéseket végez, minden rezgésnél érinti a felületet. A rezgési amplitúdó és fázis változik ahogy a felszínen a kiemelkedések és mélyedések vannak.

Előnyök és hátrányok Biológiai mintákról készült AFM képek Contact Mode AFM Előny: gyors pásztázás atomi felbontás érdes felületekre jó Hátrány: a vízszintes erők torzítják a képet torzítás a minta felületén lévő víz miatt a lágy biológiai mintákat megkarcolja Hősokk fehérjék Vörös vérsejtek Tapping Mode AFM Előny: nagyobb laterális felbontás (1 5nm) kevésbé teszi tönkre a lágy mintákat Hátrány: lassabb pásztázás Extra-celluláris konnexon AFM képe Az elektron mint hullám Kalcium-indukált konformáció változás az extra-celluláris konnexon felszínben. A vonal 23 nm hosszú. Louis de Broglie: λ = h / p λ az elektron hullámhossza h a Planck állandó p az elektron impulzusa Louis-Victor-Pierre-Raymond, de Broglie hetedik hercege

Transzmissziós elektronmikroszkóp Ruska 1933-ban épült elektronmikroszkópja Amiloid szálak transzmissziós elektronmikroszkópi képe Koleszterin kötődése amiloid fibrillumokhoz. Ernst August Friedrich Ruska és Max Knoll készítették az első elektronmikroszkópot 1931-ben. Ruska 1986-ban Nobel díjat kapott az elektronoptika fejlesztése terén elért eredményeiért. SEM SEM Electron gun Electron beam First condensor lens Second condensor lens Deflection coils X-ray detector Objective lens Backscatter electron detector Sample Vacuum pump Secondary electron detector

ESEM Pollen pásztázó elektronmikroszkópos képe p > 609 Pa p L = 1 Pa m előny: - hidratált minta - nem csak vezető minta - a gáz mint detektor hátrány: - a mintatér magassága: töredék mm < 10 mm - limitált képterület Vérsejtek pásztázó elektronmikroszkópos képe Optikai- és elektronmikroszkóp összehasonlítása - kis mélységélesség - alacsony felbontás + élő minta, életfolyamatok + légköri nyomáson + nagy mélységélesség + nagy felbontás - fixált, festett minta - vákuumban