A GENOM MEGISMERÉSÉNEK MÓDSZEREI

A GENOM MEGISMERÉSÉNEK MÓDSZEREI 20 GENETIKA ALAPOK 3-1

Jóslatok és a valóság a molekuláris biológiában. Mennyire látható előre a tudomány fejlődése? 1968 Simone de Beauvoir "Minden ember halandó" 1-2

G. R. Taylor: Biológiai pokolgép 1968 1-3

A rekombináns DNS technológia a DNS szakasz azonosítása, izolálása A különböző DNS-szakaszok izolálására, vágására, összekapcsolására és megsokszorozására, a génszabászkodásra, a legegyszerűbb használatban lévő kifejezés a klónozás. Ezen azonban több dolgot is érthetünk. A klón valaminek a tökéletes mása, így a klónozás alatt a biológiában érthetjük az ivartalan szaporítást (dugványozás), de a sok vitát kiváltott legújabb technikát, a reproduktív klónozást is. A DNS-klónozás, vagy az in vitro rekombináns DNS technika már pontosabb kifejezés, csak nehézkes. Angolban a genetic engeneering vagy genetic manipulation meghatározásokat is alkalmazzák, de magyarra fordítva egyik sem hangzik valami jól. A gén manipuláció egyenesen valami rosszat sejtet, pedig erről szó nincs. Maradjunk a DNSklónozásnál. Ahhoz, hogy egy DNS-szakasz (gén) szerkezetét, működését megismerjük, el kell különíteni azt a genom többi részétől és meg kell sokszorozni. hordozóba építése VEKTOR + DNS-fragment REKOMBINÁNS DNS-molekula BEJUTTATÁS gazdasejtbe, pl.:transzformáció ELSZAPORÍTÁS TISZTÍTÁS és vizsgálat (DNS-szekvencia meghatározás és egyebek) 1-4

A restrikciós endonukleázok W. Arber feltárta a fágszaporodás korlátozását okozó jelenséget és felfedezte a restrikciós-modifikációs rendszereket A restrikciós rendszerek darabolják az idegen DNS-t, specifikus DNS-metiláz és endonukleáz aktivitások vannak a sejtben. A metiláz véd, a restrikciós endonukleáz pedig hasít, ha nincs metilálva a DNS. H. Smith - az első enzimek tisztítása, jellemzése (HindII) Werner Arber D. Nathans felhasználás, a fizikai térképezés ötlete Hamilton O. Smith 1978 Daniel Nathans D. E. Berg - felhasználás, az első DNS-klónozás megvalósítása SV40::lambda fág, 1972, klónozási moratórium INDULAKUTYASATYUKALUDNI Paul Berg INDULAKUTYASATYUKALUDNI 1980 1-5

A restrikciós endonukleázok (röviden restrikciós enzimek) a kettős szálú DNS molekula meghatározott bázissorrendű szakaszait ismerik fel és ha az nincs a megfelelő módon metilálva akkor mindkét cukorfoszfát láncot egy adott ponton hidrolizálják ("hasítják"). Több típusuk van aszerint, hogy a felismerés és hasítás hol és hogyan történik. A génsebészetben főleg a II. típusú restrikciós enzimek használatosak. Nevezéktan: A restrikciós enzimek arról a mikroorganizmusról kapják nevüket, amiből izolálták őket. Az első három betű a faj latin nevéből ered (Hin), a következő néhány betű/szám a törzsre utal (d), az elnevezés végén a római szám pedig a törzsben lévő többféle enzim megkülönböztetésére szolgál (lásd HindII, HindIII). A 3 adeninnél metilált szekvenciát az EcoRI restrikciós enzim nem hasítja. 1-6

A II. típusú restrikciós enzimek leggyakrabban 4-es vagy 6-os ún. palindrom szerkezetű (pontszimmetrikus) felismerőhellyel rendelkeznek és azon belül, az enzimre jellemző módon hasítanak. A keletkezett DNS fragmenteknek a hasítás következtében tompa végük (blunt end), vagy ragadós végük (cohesive vagy sticky end) lesz. Megfeleő enzimekkel ma már minden DNS vég tompa véggé alakítható, így bármilyen eredetű DNS-fragmentek szabadon összekapcsolhatók. Fragmentek összekapcsolása: ligálás Az oldatban lévő DNS-fragmentek összekapcsolódása csak a végek szerkezetétől függ. Bármilyen eredetű két vagy több DNS-fragment összekapcsolódhat, ha megfelelő, ún. kompatibilis ragadós véggel vagy tompa véggel rendelkezik. Az időleges kapcsolatot a foszfodiészter kötés kialakításával a DNS-ligáz enzimek stabilizálhatják. A reakcióban részt vevő ATP csak energiát szolgáltat! A kovalens kötés létrehozásának feltétele az 5 -P és a 3 -OH csoportok megléte. 1-7

A restrikciós enzimek ma már kereskedelmi forgalomban kaphatók. Sok esetben már nem az elnevezésüket adó törzsből tisztítják őket, mert ez költséges. A megfelelő géneket expressziós vektorba építve (lásd később) mesterségesen termeltetik a fehérjét. Így sokkal nagyobb mennyiségben és olcsóbban állíthatók elő. 1-8

Az agaróz gélelektroforézis Az agaróz a D-galaktóz és a 3,6 anhidro L-galaktóz lineáris polimere. Tengeri moszatból izolálják. A megfelelő koncentrációjú agaróz gélben egy lineáris duplex DNS molekula vándorlási sebessége (és ezért az adott idő alatt a megtett út) fordítottan arányos a molekula tömegének logaritmusával. etídium bromid A DNS ph 7 érték körül negatív töltésekkel rendelkezik, így az elektromos erőtérben a (+) pólus felé fog vándorolni. Lineáris molekulák ("fragmentek") esetében érvényes a jobb oldali görbesor. A DNS fragmentek a gélben csak akkor láthatók, ha etídium bromid interkaláló festéket alkalmazunk, és a gélt ultraibolya (UV) fénnyel megvilágítjuk. A DNS 260 nm, a bázisok közé ékelődött fluoreszcens festék 300 nm illetve 360 nm hullámhossznál rendelkezik elnyelési maximummal. A festék a gerjesztés hatására a látható tartományban bocsájt ki fényt (590 nm, narancspiros). 2-9

etídium bromid + UV megvilágítás Az újabb DNS-hez kötődő festékek nem toxikusak és nem kell UV fény, jobb kimutathatóság, kék fénnyel gerjeszthetők: pl. GR-green 2-10

A FIZIKAI TÉRKÉP Ahogy láttuk, egy adott 6 bázispár hosszú szekvencia átlagosan 4096 bázispáronként fordul elő. Természetesen ez az adott DNSszakasz bázissorrendjétől függ. Minden DNS-szakaszra jellemző, hogy milyen hasítási helyek találhatók rajta. A fizikai (vagy restrikciós) térkép egy adott DNS szakaszon belül a restrikciós endonukleáz hasítóhelyek egymástól való távolságának és sorrendjének ábrázolása. Egy DNS szakasz fizikai térképének elkészítése a szakaszon belüli "tájékozódás", a további molekuláris munka előfeltétele. A fizikai térkép elkészítéséhez több megfelelő restrikciós enzimmel fel kell darabolni a DNS-molekulát, a darabok (fragmentek) hosszúságát meg kell határozni, és a fragmentek számának, valamint méretének ismeretében megszerkeszthető a szakasz fizikai térképe. (Egyszeres, kétszeres és részleges emésztések.) Jobb oldalon az SV40 vírus DNS kör alakú fizikai térképe látható. Többek között a fizikai térképezés ötletéért kapott Nathans Nobel-díjat. Eredeti ábra Nathans Nobel-díj átadáson elhangzott előadásából. 2-11

A FIZIKAI ÉS GENETIKAI TÉRKÉP A genetikai térkép a gének egymáshoz viszonyított elrendeződését mutatja. Egy gén vagy DNS-szakasz megismeréséhez létre kell hozni és egyeztetni kell a fizikai és a genetikai térképet. Ehhez a klónozás mellett, genetikai, molekuláis biológiai kísérletek elvégzése szükséges (komplementáció, irányított mutagenezis, hibridizáció) Egy gén elhelyezkedéséről, szerkezetéről teljesen pontos képet csak a DNS szekvencia meghatározása után, számítógépes elemzés (lásd bioinformatika) és további biológiai kísérletek révén kaphatunk. Fontos állomása a molekuláris munkának a DNS-szekvencia meghatározása, ami egyben a fizikai térkép tökéletes megismerését is jelenti. A szekvencia ismeretében minden restrikciós enzimnek meg tudjuk keresni a hasítási helyét. A Tn5 transzpozon fizikai-genetikai térképe. A teljes DNS-szekvencia ismert, így egy program segítségével megkereshetők és felrajzolhatók a hasítási helyek. 2010.09.21. 2-12

KLÓNOZÓ VEKTOROK VEKTOROK A restrikciós enzimekkel létrehozott, és agaróz-gélen elválasztott DNS-fragmenteket vissza kell juttatni valamilyen sejtbe, hogy azzal együtt el tudjuk szaporítani (sok azonos molekula létrehozása= klónozás). Önmagában egy DNSfragment nem képes replikálódni a sejten belül, ezért olyan hordozó, vektor DNS molekulával kell összekapcsolni, ami képes egy adott rendszerben replikálódni. Ezek a klónozó vektorok lehetnek plazmid vagy vírus eredetűek, illetve akár mesterséges kromoszómák is. Három fontos jellemzője minden vektornak: 1) replikációs origo - a replikációt elindító DNSszekvencia, E. coli sejtekben: PLAZMID -transzformáció, elektroporáció BAKTERIOFÁG (fág) - fágént jut be és szaporodik el KOZMID - fágként jut be, de plazmid BAC (bacterial artificial chromosome) -elektroporáció, F-plazmid 2) szelektálható marker, olyan gén, aminek a jelenlétére lehet szelektálni, így a vektort tartalmazó sejtek szelektíven felnöveszthetők, elkülöníthetők a vektort nem tartalmazó sejtektől. A markergén általában valamilyen antibiotikummal szembeni rezisztenciát határoz meg (pl. ampicillin), élesztőben 3) klónozó hely, egy vagy több olyan restrikciós endonukleáz hasítóhely, amelyből a vektoron csak egy található, hogy az idegen, inszert DNS beépítését segítse. - vírusok - mesterséges kromoszómák YAC (yeast artificial chromosome) -elektroporáció más eukarióta (nem mikróba) 2-13

kromoszóma MESTERSÉGES PLAZMIDOK plazmid Elsők között állított elő mesterséges rekombináns DNS-t Paul Berg (SV40 vírus, Nobel-díj 1980). Napjainkban számtalan, in vitro rekombináns DNS technikával mesterségesen "összeállított" plazmid létezik. A génizolálás, a DNS szekvenálás, a génexpresszió vizsgálata, fehérjék termeltetése terén egyaránt hasznos eszközök. Milyen a jó klónozó plazmid? szelektálható marker - antibiotikum rezisztencia kis méret - könnyebb izolálni, transzformálni, nagy kópiaszám - kevés sejtből sok DNS tisztítható klónozóhely, MCS (multicloning site), vagy poliklónozó hely egyedi restrikciós hasítóhelyeket tartalmazó, megtervezett, szintetikus DNS-szakasz. Sokféle enzimmel létrehozott DNS-inszert építhető könnyen bele. inszert jelzés : az inszert beépülés észrevehető, tesztelhető vagy szelektálható tulajdonság, amely jelzi az inszert DNS jelenlétét. 2010.09.21. 2-14

E. coli esetében a megfelelően kezelt sejtek 10 7-109 transzformánst adnak / g plazmid DNS. TRANSZFORMÁCIÓ A transzformáció a tisztított DNS-molekula visszajuttatása a sejtekbe. A DNS felvételére természetes mechanizmusok is léteznek egyes baktériumokban (Bacillus, Streptococcus). Ez a jelenség is segített az örökítő anyag mibenlétének tisztázásában. Lásd Griffith és Avery kísérleteit. A kromoszómális DNS-preparátummal való transzformációt genetikai térképezésre használták (lásd majd Genetika ea.). A plazmidok felfedezése után alapvető módszer a klónozásban. Sajnos az E. coli aktívan nem vesz fel DNS-t, így ki kellett dolgozni a módszert (CaCl2). Kompetens sejt az, amelyik képes a DNS felvételére. Mi befolyásolja a hatékonyságot? - plazmid mérete - a kisebb jobb - a DNS mennyisége - telítési görbe (lásd fennt) - a genetikai háttér - vannak jól és rosszul transzformálható E. coli sejtek, lásd. restrikciósmodifikációs rendszerek szerepe Elektroporáció: magas feszültségű, elektromos impulzus, membránok fúziója, 10x hatékonyabb. Transzfekció = transzformáció, kapcsolatban használják. főleg emlős sejtekkel 2-15

GÉNTÁRAK Egy könyvtár rendezett formában és külön kötetekre bontva tartalmazza az információkat. Mi lenne, ha minden egybe lenne kötve és nem tudnánk, hogy mi hol található? Szét kellene szedni meghatározott darabokra, hogy az egyes művek olvashatók legyenek. 2-16

GÉNTÁRAK A genomikus géntár (klóntár, génkönyvtár, génbank, genomic library) egy adott élőlény teljes DNS-állományát (összes génjét) tartalmazza kisebb DNSfragmentek formájában (inszert), vektor molekulákba épíve. A klónok összessége reprezentálja a teljes genomot, abból minden gén kikereshető. Ezen kívül készíthetünk ún. cdns géntárat eukarióták esetében (mrns lenyomat, bővebben később). A plazmid vektorok eukarióta géntár készítésére nem alkalmasak, mivel kicsi a beépíthető DNS mérete, túl sok klón kellene. Hogyan lehet jobb géntárakat készíteni? A vektorok és a DNS bejuttatás fejlesztésével nőtt a beépíthető hasznos teher, vagyis az inszertek mérete. lambda fág 20-25 kb inszert max., in vitro pakolás, E. coli háttér kozmidok BAC 45 kb inszert max., in vitro pakolás, E. coli háttér 100-300 kb inszert, elektroporáció, E. coli háttér YAC 500-1000 kb inszert, elektroporáció, élesztó S. cerevisiae háttér 2-17

genomic library calculator: http://www.pitt.edu/~mcs2/teaching/biocomp/java/library.html 2-18

GÉNEK AZONOSÍTÁSA Genetikai komplementáció vagy DNS-DNS hibridizáció segítségével lehet egyes géneket azonosítani és izolálni ( kiszedni ) a géntárból. Komplementációs teszt: a mutáns fenotípus vad fenotípusra vált egy géntár klón jelenlétében. Pl. auxotróf mutánsok képesek ismét növekedni minimál táptalajon. Általában prokarióták esetében járható út, hatékony génbejuttatási módszer kell hozzá. Szelektálni tudunk a komplementáló klónt tartalmazó egyedekre a megfelelő táptalajon. Pl.: élesztő his1 mutáns segítségével a HIS1 gént hordozó YAC klón azonosítása. A HIS1 gén származhat más élőlényből is! Humán sejtciklus gének működhetnek komplementálhatnak élesztő mutánsokat. élesztőben, A HIS1 gént tartalmazó his1 élesztő mutáns nő a minimál táptalajon, az összes többi géntár klónt hordozó sejt nem. Nematoda, Arabidopsis, Drosophila mutánsok teljes géntárral való koplementálása technikailag lehetetlen. Transzgenikus élőlények létrehozása csak egy-egy gén funkciójának igazolására szolgálhat. Lásd később. 2-19

GÉNEK AZONOSÍTÁSA Hibridizáció Southern hibridizáció (Edwin Southern) DNS-DNS Northern RNS-DNS DNS hibridizáció in situ és filter hibridizáció alkalmazása, géntárban való keresésre az utóbbi használható A Southern hibridizáció Western fehérje kimutatás ellenanyaggal Southertn blott DNS lenyomat készítés membránon Northern blott RNS lenyomat készítés membránon Western blott fehérje lenyomat készítés membránon kolónia és plakk hibridizáció - jelölt DNS-próba ( 32P vagy fluoreszcens festék) A hibridizációt befolyásolja az ionerősség, a DNS-szakasz szekvenciája (Tm hőmérséklet) és a homológia (a próba és a keresett szakasz hasonlósága) CCTCGAGCGGTACGGCCTGTCTTCGATCCGTTCCCAAATCCCGGCACAGTCGACACTAACTTGGTCTACCAAGGCCT-CCGATACATGTG CCTCGAGCGATACGGTCTGTCTTCGATCCGTTCCCAAATCCCGGCACAGTCGACACTGACTTGGTCTACGAGGGT-TGCCGATACATGTG heterológ hibridizáció, heteroduplex Homológ próba: ha a keresett szekvencia legalább egy része már a kezünkben van (cdns géntár klónnal keresünk genomikus géntárban, mutáns gént keresünk vad típusú szekvenciával). 2010.09.21. Heterológ próba: más fajból származó DNS-szakasz segítségével keressük egy géntárban a hasonló (hibridizáló) szekvenciákat. Jelentősen eltérhet a két szekvencia, gyenge, nem specifikus hibridizáció az eredmény. A későbbi munka során bizonyítani kell, hogy valóban azonos funkciójú, működő gént azonosítottunk. 2-20

Plakk illetve kolónia hibridizáció az adott DNSszekvenciát hordozó géntár klón azonosítására. homológ vagy heterológ próba alkalmazása baktérium telepek vagy fág plakkok tartalmazzák az egyes géntár klónokat DNS lenyomat készítés filterre hibridizáció a megfelelő próbával (jelölt DNS-fragment) a próbával hibridizáló (azonos, hasonló szekvenciát tartalmazó) telep, plakk azonosítása tisztítás DNS-izolálás (plazmid, fág) további klónozás (szubklónozás), szekvencia meghatározás 2-21

Egy YAC géntár 384 klónjának hibridizációs tesztelése. Egy YAC klón hibridizál, a többi háttér. ( 1 db 96 zsebes mikrotiter lemez x 4 = 384)

DNS-szekvencia meghatározás Gilbert 1980 (1958) Sanger 3-23

Sanger, didezoxi láncterminációs módszer didezoxi származék + jelölés: pl. α32pdatp + jelölés: pl. α32pdatp + jelölés: pl. α32pdatp poliakrilamid gélelektroforézis 3-24

Poliakrilamid gélelektroforézis - PAGE AA Hagyományos szekvenáló készülék bisaa PAGE: a gél kialakítása polimerizációval, keresztkötések bisakrilamid segítségével, a két komponens aránya (AA, bis-aa), koncentrációja határozza meg a gél felbontó képességét. Egyszálú DNS elválasztás szekvenálás DNS, RNS elválasztás (etídium bromiddal festés) fehérje elválasztás denaturáló fehérje gél: SDS PAGE 2D PAGE poliszacharidok elválasztása DNS szekvenálás Denaturáló gél, urea, egyszálú, jelölt DNS felbontó képesség 1 bázis! (kb. 30-700 bázis hosszúságú tartományban). Szekvenáló automaták: fluoreszcens festékekkel a detektálás (leolvasás) automatizálható (lásd később) Bioinformatika: részszekvenciák összeszerelése, kiértékelése, génkeresés lásd Bioinformatika kurzus 3-25

Szekvenáló gélről készült autoradiogram és egy részlete. Az egy DNS mintához tartozó reakciók a filmre rajzolt vonalakkal utólag lettek bejelölve (A, C, G, T reakciók) 3-26

ACGT a aa cc t ct a t a 3-27

NEM RADIOAKTÍV JELÖLÉS Fluoreszcens jelölés fluoreszcein12- dutp 3-28

Négyféle, különböző hullámhosszon fluoreszkáló ddntp származék alkalmazásával, ugyanabban a reakcióban is meghatározható, hogy milyen bázisra végződik egy adott hosszúságú DNS-szál. 3-29

Automata detektálás az elválasztás során, automatizált DNS-szekvenáló készülék. Az informatka és a robotika fejlődése révén lehetővé vált nagy mennyiségű DNS-szekvencia meghatározása. Szekvenáló gyárak, genomprojektek. Bioinformatika. 3-30

GENOM SZEKVENÁLÁS A random tördelt fragmentek klónozása, sok millió klón szekvenálása, az adatok feldolgozása, a szekvencia összeszerelése automatikus. 12x es lefedettség minden egyes bázisra. Ha egy olvasásban egy ponton hiba van, még 11 másik szekvencia megmutatja a konszenzus, korrekt szekvenciát. Nincs szükség és lehetőség az egyedi olvasások hibáinak javítására. 3-33

PRC Polimeráz láncreakció polymerase chain reaction Kary Mullis 2010.11.07. 3-34

A PCR reakció összetevői A PCR ciklus 1) templát DNS 2) datp, dctp, dgtp, dttp (dntp-k) 3) hőstabil DNS polimeráz (Taq polimeráz) 4) 2 db oligonukleotid primer 1. denaturáció 94 oc A két primer által meghatározot DNS szakasz in vitro megsokszorozása egymást követő ciklusokban. DNS szálak szétválasztása 2. annealing 45-65 oc a primerek kötődése 3. extension 72 oc az új szálak szintézise ismétlés 30-35x 5 GACACCATCGAATCACGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCA - 100-2000 N --CAATTCAGGGTGGTGAATGTGAATGTCAGTAACGTTATACG 3 3 CTGTGGTAGCTTAGTGCGTTTTGGAAAGCGCCATACCGT - 100-2000 N --GTTAAGTCCCACCACTTACACTTACAGTCATTGCAATATGC 5 denaturáció és annealing 5 GACACCATCGAATCACGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCA - 100-2000 N --CAATTCAGGGTGGTGAATGTGAATGTCAGTAACGTTATACG 3 ACAGTCATTGCAATATGC 5 5 GACACCATCGAATCAC 3 CTGTGGTAGCTTAGTGCGTTTTGGAAAGCGCCATACCGT - 100-2000 N --GTTAAGTCCCACCACTTACACTTACAGTCATTGCAATATGC 5 felső primer: alsó primer: 5 GACACCATCGAATCAC 3 16-mer, 5 CGTATAACGTTACTGACA 3 18-mer, Tm= 54,3 C Tm= 54,2 C 3-35

2 (8) 3-45

2 (8) 3-46

8 (22) 3-47

22 (52) 3-48

A PCR program 1. 2. 3. 4. 5. 6. 2 perc 94 C 30 mp 94 C 30 mp 56 C - a hőmérséklet a primerek szekvenciájától függ 40 mp 72 C - az idő a termék hosszától függ (60 nt/sec) 32x GO TO 2. end 3-53

PCR alkalmazások 1) Klónozás - előny: géntár készítés nélkül; hátrány: max. 10.000 bp, nehezen!) 2) diagnózis, mutációk kimutatása 3) heterológ v. degenerált primerekkel rokon, homológ szekvenciák klónozása 4) génsebészet restrikciós helyek bevitele 5) mutáció, más szekvencia bevitele 6) régi szövetmintákből DNS felsokszorozása, szekvenálása (csont, mag honfoglalás kori leletek, neandervölgyi ember) 7) azonosítás kevés mintából: Romanovok, bűnüldözés, katasztrófáknál azonosítás, szülők azonosítása 8) genetikai térképezésnél DNS markerek RAPD, random amplified polymorfic DNA 9) Hibridizáció helyett DNS-szakasz azonosítás 10) mrns kimutatás, génexpresszió mérés, RT-PCR, real time PCR mennyiségi összehasonlításokhoz 3-54

Egyedi azonosítás: mikroszatellita vagy simple sequence repeat (SSR) nem kódoló régiók vizsgálata monoton, ismétlődő szekvenciák, két oldalukon egyedi szekvenciákkal, nem kódol, minden mutáció rögzül, populáción belül is sok eltérés, apai és anyai allél sok, hasonló szakasz vizsgálatával lehetséges a teljesen egyedi azonosítás 3-55

2010.11.07. 3-57

DNS- markerek a genetikai térképezésben RAPD technika (Random Amplified Polymorphic DNA) 10 bázis hosszú primerek, kis specifitás sok primer hely egyedi szekvencia variációktól (polimorfoizmusoktól) függő termékek A két szülő különbözik allélek, más fenotípus a DNS-fragmentek szintjén 2010.11.07. 3-58

V. vinifera Kunbarát V. amurensis eredetű Agrobacterium rezisztencia x V. vinifera Sárfehér (önbeporzásra képtelen) Rcg1 locus 272 u tód 2008. ápr. 2008. aug. 1. 2. 3.... 272. utód. 153 rezisztens, 119 fogékony utód 4 x 2-3 zölddugvány - - 4 különböző Agrobacterium fertőzés > 2500 növény mendeli 1:1 arány

Rezisztencia kapcsolt specifikus DNS-fragment (SCAR: sequence characterized amplified region) R: rezisztens, Sz: szenzitív, K: R szülő, S: sz szülő L: 100bp ladder RAPD kapcsolt fragment R: rezisztens, Sz: szenzitív K: R szülő, S: sz szülő L: 100bp ladder A biológiai tulajdonsághoz (pl. rezisztencia) kapcsolt DNS markerek keresése. A klasszikus genetikában az izolálható morfológiai mutánsok száma csekély, a mutáns izolálás nehézkes. DNS polimorfizmus nagy szánban előfordul. Gyorsan kimutatható az utódok DNS-ében. Marker Assisted Selection (MAS): egy kapcsolt DNS-marker segítségével válogatom ki azokat az utódokat, amelyekben az értékes biológiai tulajdonság benne lehet. Biológiai tesztben utólag igazolni kell ezt, de nem szükséges az összes utód biológiai vizsgálata. Munka és idő megtakarítás. Map Based Cloning, Positional Cloning: A kapcsolt DNS-marker segítségével klónozom azt a genomikus szakaszt (géntár klónokat), melyben a keresett gén feltételezhetően benne van. Cél, az értékes tulajdonságot meghatározó gén v. gének klónozása, megismerése. Lásd később transzgenikus növények. 3-60

A genetikai távolság - kapcsoltság Nem rekombináns Rekombináns OPQ15sc + / Rcg1 146 OPQ15sc - / rcg1 107 OPQ15sc + / rcg1 7 OPQ15sc - / Rcg1 7 5,2 cm 3-61

Hagyományos nemesítés vagy transzgenikus technika? rezisztens, nem nemesített növény genomja nem rezisztens haszonnövény genomja R R R gén izolálása X F1 GMO növény létrehozása (2-4 év) R F1 visszakeresztezés a jó fajtával R R Sok visszakeresztezés és az R-gén jelenlétének ellenőrzése Rekombináció, más gének is bent maradhatnak. (10-20-30 év, növénytől függően) Meg lehet állapítani, hogy hova épült be az új gén. 5-62