MODELLORGANIZMUSOK GENETIKÁJA Arabidopsis thaliana, lúdfű, thale cress, Arabidopsis Zárvatermő, kétszikű, keresztesvirágú Kis termet, rövid generációs idő (6 hét), igénytelen gyomnövény, hosszúnappalos, virág 3 mm, önbeporzó, de idegenbeporzás lehetséges keresztezés, becő termés 20-30 maggal, de 10.000-40.000 mag/növény! Sok utód tesztelése lehetséges kis helyen. A növénygenetika, a virágos növények fejlődésbiológiájának, a fotoszintézis, a növényi stresszválasz, a patogén kölcsönhatások modellnövénye. Klasszikus genetikai vizsgálatokban úttörő volt Rédei György (USA). Több ökotípus is elterjedt: Columbia (Col) kiváló szaporodás, Landsberg erecta (Ler) kis méret (mutagenezis után), Wassilewskija, természetes ökotípusok is DNS polimorfizmusok, RFLP, PCR, SNP elemzéshez, DNS-markerek térképezése Klasszikus genetikai térkép Az első szekvencia szinten megismert növényi genom (2000.) ATIDB The Arabidopsis thaliana Integrated Database http://www.atidb.org/ http://www.arabidopsis.org/index.jsp Barbara McClintock és Rédei György (1921-2008) Rédei György volt az Arabidopsis modellnövény bevezetésének egyik lelkes úttörője. 1956-ban emigrált az USA-ba néhány Arabidopsis maggal a zsebében. 1960 körül szinte csak ő dolgozott Arabidopsissal (Columbia, Univ. Missouri). Ma több mint 16 ezer laborban használják modellnövényként. Mára a legjobban ismert növény. 7-1
https://mizzoumag.missouri.edu/2014/08/from apathy to apogee/ 7-2
https://mizzoumag.missouri.edu/2014/08/from apathy to apogee/ 7-3
7-4
Felépítés és életciklus Ha tanulmányozni akarjuk a növények testfelépítését és kialakulását molekuláris szinten, akkor a folyamatokban hibás mutánsokat kell izolálnunk. Néhány egyszerűbb szerv és szövet. Föld feletti szár és föld alatti gyökér jelenti a fő tengelyt. Számos sejttípus az epidermális külső, a kortikális középső és a vaszkuláris (xylem, phloem) belső rétegben. A szárhoz kapcsolódó leveleknél szintén három réteg: epidermális (szőrsejtek és sztómák), mezofil fotoszintetizáló réteg és az anyagszállítást végző vaszkuláris szövetek. A gyökér és a szár növekedését az apikális merisztémák (csúcsmerisztémák) biztosítják. A szár esetében ennek oldalsó sejtjei hozzák létre az oldalhajtásokat, leveleket, a teljes föld feletti növényt. A virágzás előtti vegetatív fejlődésnél az apikális merisztéma hozza létre meghatározott szimmetriák szerint a leveleket. A reproduktív fejlődés kezdetén az apikális merisztémából kialakul az infloreszcens (virágzat) merisztéma, ami oldalsó, másodlagos virágzat merisztémákat hoz létre, florális merisztémák virágok kialakulása 7-5
A virág, a megtermékenyítés és az embrió A virág a legösszetettebb növényi szerv. Módosult levelek 4 koncentrikus körben (örv): csésze- és sziromlevelek (4-4), porzók (6) és két fúzionált termő. magkezdemény A magházban kb. 50 magkezdemény, embriózsák, 2 központi sejt és petesejt Pollen: vegetatív sejt, csíratömlő, mitózissal 2 hímivarsejt magház kettős megtermékenyítés. hímivarsejt + petesejt zigóta(2n) embrió hímivarsejt + központi sejt táplálószövet (3n) 7-6
Megtermékenyítés után a zigóta osztódik két sejtre. A kisebbikből fejlődik az embrió, a másikból a szuszpenzor. Globuláris, triangular, szív majd torpedó alakú embrió, sziklevelek, szár és gyökér, apikális merisztémák, hipokotil, csírázás gravitáció és fény fotomorfogenezis fény által szabályozott fejlődési program fotoperiódus 16 óra fénynél max. 10 levél és virágzás, 8 óra fénynél több mint 30 levél 7-7
Az Arabidopsis genom 5 kromoszóma, 125 Mb az egyik legkisebb növényi genom (élesztő 12 Mb) dohány 24 kr 4.500 Mb, borsó 7 kr 4.300 Mb, hagyma 8 kr, 15.000 Mb) jelentős eltérések a fizikai és genetikai távolságokban, arányokban 30-1600 kb / 1 cm (lásd a következő oldalon) A géndenzitás nagy, a 25.500 fehérjekódoló gén, a genom 40 %-át foglalja el - 1 gén / 4 kb, nagyon kevés repetitív DNS A fehérjék 65 %-a több mint egy gén által kódolt sok duplikált régió, tetraploid ősből származik. Alternatív splicing kb. 1600 génnél, a gének 6%-nál 1400 pszeudogén, melyek fehérjekódoló régiói is megváltoztak, sokban korai stopkodon található Mobilis genetikai elemek: 2300 különböző pozícióban, retrotranszpozonok, transzpozonok (lásd a jobb oldali táblázatot), pericentromerikus heterokromatin, mikroszatellita szekvenciák, rdns a 2. és 4. kromoszóma felső végén A növényi genomok evolóciójának megismeréséhez más rokon fajok szekvenálása is elkezdődött: Arabidopsis lyrata, Capsella rubella http://www.jgi.doe.gov/sequencing/cspseqplans2006.html 7-8
klasszikus molekuláris fizikai Rédei György izolálta az se (SERRATE) mutánst, a levél szél fogazott, számos pleiotróp hatás a sziklevelek fejlődésétől kezdve. A klasszikus térképezésnek és a genomprogramnak köszönhetően ma már ismert a gén helyzete, szerkezete, a kódolt fehérje funkciója. Az SE gén egy DNS-kötő zink finger fehérjét kódol. Klasszikus gén azonosítás, izolálás: map based cloning a mutáció térképezése molekuláris markerekhez (a régió géntár klónjainak izolálása, szekvenálása), a mutáció és vele a keresett gén azonosítása + bizonyítás: komplementáció, silencing. Jelentős eltérések a fizikai és genetikai távolságok arányában. A fizikai térképet a kék vonalak jelképezik. Mellettük a klasszikus markerek térképe és a molekuláris markerek rekombinációs térképe. 30-1600 kb / 1 cm 7-9
T-DNS Mutánsok A mutáció azonosítása, izolálása térképezés nélkül! Direkt klónozás a T-DNS révén. 1) átalakított Agrobacterium T-DNS alkalmazása 2) transzpozonok: kukorica és saját mobilis elemek 300.000 T-DNS inszerciót tartalmazó gyűjtemény 1600 protein kódoló génben még nincs inszerció További 300.000 mutáns elkészítése esetén is csak 94%-ról 98%-ra nőne a várható mutációval való telítettség. Más, új eszközök hatékonyabbak. A növényeknél nem alkalmazhatók a homológ rekombináción alapuló mutáció beviteli technikák (a baktériumoktól az emlősökig a knock out technika általában működik). 3) Új módszer: homológ rekombináció növelése élesztő RAD54 gén bevitelével. 27x gyakoribb a homológ rekombináció, ez már 0,01 0,1 gyakoriságot jelent, amit érdemes alkalmazni mutáns előállításra PCR screen 4) RNAi technika - géncsendesítés 5) Gyors neutron mutagenezis, ellenőrizhető gyakoriságú és méretű deléciók keltése, mutagenizált populációk átvízsgálása PCR segítségével az adott deléciós származék megkeresésére, Többszörös mutánsok! Keresztezések szükségesek az egyedi mutációk izolálására, a homozigóta egyedek előállítására. A lehetetlennel határos minden génben mutációt izolálni random mutagenezis segítségével. A számítógépes szimuláció azt mutatja, hogy a gének hány százalékát találhatjuk el, ha növeljük az izolált inszerciók számát. 7-10
T-DNS mutagenezis 1) Első eszköz a kémiai mutagenezis volt Az érett magot kezelik. Az apikális merisztémában 1-3 sejt képviseli a csíravonalat. A kifejlett növénynél önbeporzás. Ideális esetben (recesszív mutáció, látható fenotípus, egy sejt hozza létre a csíravonalat, 1 mutáns és 1 wt allél) a létrejött magok ¼-e homozigóta, mutáns embriót (utódot) hordoz. Az EMS alkalmazása általában G-A tranzíciót okoz, a besugárzás pedig kis deléciókat. 2) T-DNS mutagenezis: a mag, virág kezelése mutagenezisre alkalmas T-DNS konstrukciót tartalmazó Agrobacterium törzzsel (vákum, detergens). A baktériumok jelen vannak a növényben. A T-DNS a természetes folyamat révén jut be és random beépül a genomba (ált. több beépülés egy sejtmagban). Ha az utód (csíranövény) hordoz inszerciót, a szelekciós marker segítségével ki lehet válogatni (KmR). T-DNS átalakítás: a vad típusú változatok nem alkalmasak mutagenezisre az onkogének jelenléte miatt. Alapvetően csak a határoló régiók (LB, RB) szükségesek és egy szelektálható marker. riporter gének promóter nélküli alkalmazása, specifikus mutánsok keresésére (nem mutagenezis, ha a vizsgálandó promótert is tartalmazza a konstrukció génexpresszió vizsgálata) A mesterséges T-DNS alkotói: LB, RB antibiotikum rezisztencia: kanamicin, higromicin vagy herbicid rezisztencia riporter gének, a target hely klónozását segítő elemek, speciális célokra kifejlesztett származékok, GUS: E.coli β-glucuronidase, uida, x-glu kromogén szubsztráttal in vitro festés is lehetséges, a transzformált sejtek termelik és festhetők 7-11
Transzformációs vektorok: A T-DNS belsejét eltávolítják, csak a határoló régiók maradnak meg (LB, RB). Az új génkonstrukció beépítése (pl promóter-riporter gén + növényi szelektálható marker, ami lehet KmR gén is). Ekkor a transzformáns növényeket Km segítségével lehet kiválogatni. A T-DNS transzferhez szükséges vir gének egy másik plazmidon vannak (helper Ti plazmid). Transzgenikus növények létrehozásának bevett módja. Alapkutatási és biotechnológiai célokra egyaránt alkalmazzuk. 7-12
T-DNS mutagenezis egy adott gén direkt elrontása homológ rekombináció, knock out technika nem használható, random mutagenezis és PCR screen, a vad típusú szekvencia ismerete szükséges 7-13
3) transzpozonok, kukorica és saját mobilis elemek Ac/Ds elemek Mindegyik elem LB és RB által határolt, agrobaktérium transzformációval vihetők be a növénybe. A Ds elem: T-DNS konstrukcióban a transzpozon (promóter nélküli GUS és higromicin beékelve 35S promóter (CaMV= cauliflower mosaic virus) és egy herbicid rezisztenciagén közé. A Ds elem ugrásakor alakul csak ki herbicid rezisztenia. A rezisztensek potenciális mutánsok, a többi növény biztosan nem. Az Ac elem: A transzpozáz gén az Ac elemből külön TDNS konstrukción juttatják be Saját transzpozonok Vannak mobilis elemek Arabidopsisban is (lásd a 7-4 old. táblázatát) Többről kísérletesen is bizonyították, hogy képes mozogni, és más növényekben is használták az átalakított konstrukciókat mutagenezisre. 7-14
Mutáns fenotípus géncsendesítéssel (Gene silencing) A géncsendesítésnél egy természetes mechanizmust használunk ki, amely vírus RNS-eket ismer fel és degradál. A saját génexpresszió szabályozásra is egyre több példa van mrns lefedés vagy hasítás révén. Ebben a micro RNS-eknek (mirns) van szerepe. A target RNS-sel komplementer, 21 nukleotidnyi RNS teszi specifikussá a felismerést. Kettős szálú RNS (hairpin) kell az aktivitás kialakulásához. Ez származhat a következőkből: 1) vírus RNS, 2) transzgénről hairpin RNS, 3) vírus konstrukcióról target RNS szekvencia 4) tisztított ds vagy antisense RNS A DICER ribonukleáz komplex a különböző eredetű dsrns felhasználásával sirns-t készít (small interfering RNA). Az endonukleáz aktivitású RISC komplex (RNAi silencing complex) - mely specifitását a 21 nt egyszálú RNS adja - hasítja a target RNS-t. Tehát nem mutációt készítünk, hanem egy adott gén expresszióját akadályozzuk meg a mrns tönkretételével. Előnye: a) egyszerűbb, mint a mutáns izolálás, a csendesítő konstrukció T-DNS módszer segítségével random bejuttatható, bárhova beépül, működik b) több kópiás gén esetén akár mindegyik termékét inaktiváljuk, ami egy mutáció izolálásával nem teljesül. 7-15
A csírázás genetikai elemzése Az embrió fejlődését akadályozó mutációk izolálása. 500 különböző embrió letális vagy embrió-defektív mutáció, jelentős részük a triangular vagy transient forma kialakulása előtt hat (a szív forma előtti stádium). Ezek közül sok mutáció a háztartási génekben van. Kevés az anyai hatással járó mutáció hamar elindul az önálló génaktivitás az embrióban, kevés a bepakolt anyag (mrns, fehérje) szemben pl. a Drosophila esetében tapasztaltakkal. A leafy cotyledon (lec) mutációk: levél szerű sziklevél (levélre jellemző trichómák és szállító edénynyalábok) A lec/lec embriók nem képesek csírázni, mivel a mag érésével járó vízvesztést nem bírják. A LEC gének a mag érésében játszhatnak szerepet. A LEC2 gént klónozták. Egy transzkripciós faktort kódol, aminek alapvető szerepe van az embrionális sejtek differenciálódásában. wt A twin mutáció esetén két embrió alakul ki a magban, a szuszpenzor helytelen fejlődése következtében a TWIN gén egy negatív regulátort kódolhat, mely gátolja az embrió fejlődési programot a szuszpenzor sejtekben. Ha ez a hatás nincs, akkor a szuszpenzort létrehozó sejtből is embrió fejlődik. wt lec twin 7-16
wt A hormon termelés, érzékelés mutánsai wt etr1 etr1/ctr1 ctr1 ctr1/ein3 ein3 A növényi hormonok a fő belső szignálok a növényi differenciációhoz. Az etilén válasz számos mutációját izolálták. A sötétben tartott csíranövény megnyúlik, ezt az etilén gátolja. A mutáns csíranövény az etilén kezelésre nem reagál ábra Az etr1, ein2, ein3 mutációk esetén nem érvényesül az etilén gátló hatása, a ctr1 mutációt hordozó növény etilén nélkül is gátolt a növekedésben (mintha mindig lenne etilén). A dupla mutánsok fenotípusának elemzéséből a gének egymáshoz viszonyított szerepére következtethetünk. Ez az episztázis elemzés. Megválaszolható segítségével, hogy melyik gén van előbb a szabályozási útvonalban. Episztázis elemzés: az etr1 hatását a ctr1 felülírja, tehát későbbi lépést kódol, a ctr1 hatását viszont az ein3 módosítja, ezért a folyamatra a gének a következő sorrendben hatnak: etr1-ctr1-ein3 Az ETR1 gén egy bakteriális típusú receptor protein kináz. Élesztőben expresszáltatva a sejtek etilént kötnek. megnyúlás GÁTLÁSA A CTR1 gén eukarióta típusú MAP kináz kaszkádot indító fehérjét kódol, az EIN3 egy növényi transzkripciós faktort kódol. A receptor (ETR1)/CTR1 komplex negatívan szabályozza a EIN2 EIN3 működését. Etilén hatására a receptor/ctr1 nem működik, nem gátol EIN2 működik és a szignál transzdukció végig megy megnyúlás gátlás. (A mutánsban a CTR1 hiányában soha nincs gátlás.) 7-17
Gibberellin (GA) bioszintézis és érzékelés Törpe növésű mutánsok (lásd borsó le mutáció) Egy részük hormonnal (GA) menekíthető, normál növekedésű lesz. Ezek a hormon bioszintézis útban hibásak, pl. gal-1. Más mutánsokra (gai = gibberelline insensitive, shi = short internodes) nem hat a hormon. Ezek valószínű, hogy a hormon érzékelés vagy a válaszadás folyamatában sérültek. shi (for short internodes), a semidominant dwarfing mutation of Arabidopsis caused by a transposon insertion, confers a phenotype typical of mutants defective in the biosynthesis of gibberellin (GA). However, the application of GA does not correct the dwarf phenotype of shi plants, suggesting that shi is defective in the perception of or in the response to GA 7-18
Fotomorfogenezis Csírázáskor a csíranövény a fény érzékelésére szétnyitja a szikleveleket, kloroplaszt megjelenés (zöldülés) és a hipokotil megnyúlás gátolt. Két típusú fotoreceptor vesz részt a szabályozásban. A folyamatban hibás mutánsok elemzése segített megérteni a receptorok szerepét. fitokrómok vörös, távoli vörös érzékelés kriptokrómok kék fény érzékelés A fény gátolja a hipokotil növekedést és a hy mutánsokban a folyamat sérült. A hy3 és hy8 mutáció térképezésekor a phya és phyb fitokróm családba tartozó gének helyzetével mutatott egyezést a genom szekvenciában. A hy3 mutáció hatására a vörös, a hy8 mutáció hatására a távoli vörös spektrum érzékelése volt hibás. A hy4 mutáns rosszul reagál a kék fényre, a HY4 gén terméke tehát ennek érzékelésében vesz részt (kriptokróm flavoprotein). Klónozás, szekvenálás után kiderült, hogy a HY4 fehérje hasonló a bakteriális fotoliázokhoz, amelyek kék fény segítségével a timidin dimereket oldják fel (lásd: repair 5-8). A det (de-etiolated, fehér) és a cop (constitutive photomorphogenesis) mutánsok sötétben is úgy viselkednek, mintha fényen volnának. Recesszív mutációk. A COP és DET gének termékei feltehetően sötétben gátolják a fotomorfogenikus válaszokat vagy azok egy részét. A det mutáns fehér marad, tehát nem minden fotomorfogenikus válasz kapcsolódik be. 7-19
A virág kialakulása A virág kialakulását irányító géneket is azonosítottak. Mutációk következtében nem alakulnak ki a sziromlevelek és a porzók (APETALA3 vagy PISTILLATA), vagy a csésze- és sziromlevelek (APETALA2), vagy a termők és a porzók (AGAMOUS). A mutációk hatására az egyes képletek más képletté is alakulhatnak. Figyeljük meg ezt a rajzokon. 7-20
Az extranukleáris genom a kloroplaszt genetikája Genetika web jegyzet: http://www.ttk.pte.hu/biologia/genetika/atg/chap22/ch22a.htm 7-21