!HU00000762T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 00 762 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 03 717407 (22) A bejelentés napja: 2003. 02. 18. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20030717407 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1480687 A1 2003. 09. 12. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1480687 B1 2009. 02. 11. (1) Int. Cl.: A61L 27/12 (2006.01) A61L 27/4 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 03074098 PCT/FR 03/00027 (30) Elsõbbségi adatok: 0202707 2002. 03. 04. FR (72) Feltalálók: BUJOLI, Bruno, F-44240 SUCE SUR ERDRE (FR); JOSSE, Solen, F-44360 CORDEMAIS (FR); GUICHEUX, Jérôme, F-4411 HAUTE GOULAINE (FR); JANVIER, Pascal, F-44000 NANTES (FR); BOULER, Jean-Michel, F-44300 NANTES (FR); DACULSI, Guy, F-44360 VIGNEUX DE BRETAGNE (FR) (73) Jogosultak: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE, 7016 Paris (FR); UNIVERSITE DE NANTES, 44000 Nantes (FR); INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM), 7013 Paris (FR) (74) Képviselõ: Baranyi Éva, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (4) Módosított kalcium-foszfor-vegyület és az ezt tartalmazó injektálható készítmény (7) Kivonat A találmány tárgya eljárás módosított kalcium-foszforvegyület elõállítására, amelyre jellemzõ, hogy, hogy egy gem-bifoszfonsavat vagy annak valamely alkálifém- vagy alkáliföldfémsóját hozzáadják egy prekurzor kalcium-foszfor-vegyület ultratiszta vízzel készített szuszpenziójához, a reakcióelegyet szobahõmérsékleten keverik, majd centrifugálással kinyerik a képzõdött vegyületet. A találmány az elõállított vegyületre és a vegyületet tartalmazó injektálható készítményre is vonatkozik. HU 00 762 T2 A leírás terjedelme 10 oldal (ezen belül 3 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1 HU 00 762 T2 2 A találmány tárgya egy gem-bifoszfon vegyülettel módosított kalcium-foszfor-vegyület, eljárás elõállítására és alkalmazása injektálható készítmény elõállításához. Ha egy egyénnél a csontaktivitás rendellenes, az számos csontbetegség alapja, ilyenek például az oszteoporózis, a Paget-kór vagy az oszteolitikus tumorok. Az emberek életkorának növekedése miatt az oszteoporózis közegészségügyi problémává vált, és számos kísérletet folytattak ennek gyógyítására. A szóban forgó csontbetegségeket a csontok újraalakulása egyensúlyának a megbomlása váltja ki, az oszteoklasztok aktivitásának növekedésével, ezért a tervezett kezelési módok egyike abból áll, hogy csökkentik azt oszteoklasztok aktivitását, hogy lassítsák a csontanyag lebomlását. A különféle gem-bifoszfonsavakra vonatkozó kutatások kimutatták ezeknek az oszteoklasztok aktivitására kifejtett gátló hatását (lásd G. A. Rodan és munkatársai, Therapeutic Approaches to Bone Diseases, 2000. szeptember 1., 289. kötet, Science, 108 114. oldal). Néhány ilyen vegyület gyógyszerként történõ alkalmazását különbözõ országokban már bevezették, ilyen vegyületek a következõk: etidronát, klodronát, pamidronát, alendronát, rizedronát, tiludronát és ibandronát. Közzétettek adatokat egyéb gem-bifoszfonsavakkal kapcsolatban is, ilyenek a zoledronát, az inkadronát, az olpadronát, a neridronát. A jelenleg a csontsérülések kezelésére használatos gem-bifoszfonsavakat szisztemikus úton alkalmazzák, és ezért ezek néhány nemkívánatos mellékhatást váltanak ki. Kiválthatnak vesezavarokat, amikor ezeket intravénásan adagolják, és emésztõrendszeri zavarokat, különösen nyelõcsõgyulladást és gyomorfekélyt, amikor orálisan adagolják [lásd Lin J. H., Bone, 18; 7 81996 (1996) vagy Thiébauld D. és munkatársai, Osteroporos Int., 76 73 (1994)]. Az orális úton történõ adagolás egy másik hátránya abból ered, hogy a hatóanyag nagyon kismértékben szívódik fel a csontanyagba. Ismertek olyan injektálható készítmények, amelyek csonthelyettesítõt képesek alkotni. Az FR¹27183 számú dokumentumban készítményeket írnak le támasztószövet reszorpciója/helyettesítése céljára szolgáló bioanyagok elõállításához, amelyek tartalmaznak egy szervetlen fázist, ez BCP-bõl vagy kalcium-titán-foszfátból áll, és egy folyékony vizes fázist, amely tartalmaz egy cellulózszármazék polimerbõl készített vizes oldatot. Ezek az injektálható készítmények semmilyen hatóanyagot nem tartalmaznak. A WO 00/47214 számú dokumentumban olyan készítményt ismertetnek, amely injekció útján alkalmazható oszteoporózis vagy lítikus tumor recidívák kezelésére az oszteoklasztok aktivitásának gátlása útján. Ezt úgy állítják elõ, hogy egy csontcementmasszát érintkeztetnek egy reszorpciót gátló szerrel, például egy biszfoszfonáttal. Ismertek továbbá nem injektálható csonthelyettesítõk is, amelyek implantátumok formájában készülnek. Például H. Denissen és munkatársai (J. Periodontal, 71. kötet, n 2, 280 296. oldal, 2000. február) hidroxiapatit-implantátumokat ismertet, ahol a hidroxi-apatit egy bizonyos gem-bifoszfonsav, nevezetesen a 10 1 20 2 30 3 40 4 0 60 (3¹dimetil-amino-1-hidroxi-propilidén)-1,1-bifoszfonsav vagy olpadronát adszorpciójával van módosítva. A sav in situ felszabadulása állítólag elõsegíti a csontrekonstrukciót. A hidroxi-apatitnak magának azonban az a hátránya, hogy nagyon kismértékben reszorbálható. A találmány célja olyan készítmény elõállítása, amely tartalmaz egy az oszteoklasztok aktivitását gátló hatóanyagot, és amelyet anélkül adagolhatunk, hogy a szisztemikus adagolási móddal vagy egy szilárd implantátum alkalmazásával kapcsolatos mellékhatásokat kiváltanánk. A találmány tárgya tehát egy módosított kalciumfoszfor-vegyület, eljárás elõállítására és alkalmazása hatóanyagként egy injektálható készítményben. A találmány szerint módosított kalcium-foszfor-vegyületet úgy állíthatjuk elõ, hogy egy prekurzor kalcium-foszfor-vegyület ultratiszta vízzel készített szuszpenziójához hozzáadunk egy gem-bifoszfonsavat vagy annak valamely alkálifém- vagy alkáliföldfémsóját, a reakcióelegyet szobahõmérsékleten keverjük, majd centrifugálással kinyerjük a keletkezett vegyületet. A vegyületet ezután tisztíthatjuk ultratiszta vízzel történõ mosással, majd leszûrjük és szoba-hõmérsékletû levegõn szárítjuk. A prekurzor kalcium-foszfor-vegyületet olyan kalcium-ortofoszfátok közül választjuk, amelyek vízben való oldhatósága nagyobb mint 4,10 9 mol/l. Például megemlíthetjük a BCPket, amelyek hidroxi-apatit és ¹trikalcium-foszfát (ezt általában ¹TCP-vel jelöljük) különbözõ arányú keverékei, továbbá a CDA¹t, amely egy kalciumhiányos hidroxi-apatit (ezt például úgy állítjuk elõ, hogy egy savas kalciumortofoszfátot lúgosan hidrolizálunk), és a ¹TCP¹t. Ultratiszta vízen a leírásban olyan vizet értünk, amelynek rezisztivitása 18 M cm körüli érték. A szobahõmérsékleten történõ keverést elõnyösen 1 óra és 72 óra közötti idõtartamon keresztül, például 48 órán keresztül végezzük. A keverés módjának és a prekurzor kalcium-foszfor-vegyület szemcseméret-eloszlásának hatása van az ojtható gem-bifoszfon vegyület arányára. Elõnyös tehát, ha kiválasztunk egy adott szemcseméretet a prekurzor kalcium-foszfor-vegyülethez, a keverést úgy beállítani, hogy az említett szemcseméret-eloszlás ne módosuljon. A savak vagy sók, amelyek felhasználhatók gembifoszfon vegyületként, az (OY) (OX)P(O)-CR 1 R 2 P(O) (OX) (OY) képlettel írhatók le, a képletben X vagy Y jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy alkálifém- vagy alkáliföldfémkation, R 1 jelentése H, OH vagy halogénatom, és R 2 jelentése: hidrogén- vagy halogénatom, alkilcsoport, amino-alkil-csoport, ahol az aminocsoport adott esetben egy alkil szubsztituenst hordoz, alkil-amino-csoport, alkilcsoport, amely egy legalább egy nitrogénatomot tartalmazó aromás szubsztituenst tartalmaz, alkilcsoport, amely aromás tioétercsoportot tartalmaz. Amikor R 1 és/vagy R 2 jelentése halogénatom, akkor különösen elõnyös a klóratom. Amikor R 2 jelentése alkilcsoport, elõnyösek az 1 6 szénatomos alkilcsoportok. 2
1 HU 00 762 T2 2 Amikor R 2 jelentése amino-alkil-csoport, elõnyösek az olyan NH 2 (CH) n képletû csoportok, ahol n értéke kisebb, mint 6. Amikor R 2 jelentése alkil-amino-alkil-csoport, elõnyösek az olyan R R N(CH 2 ) m ¹ általános képletû csoportok, ahol R és R jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy legfeljebb szénatomos alkilcsoport, és m értéke kisebb, mint 6. Amikor R 2 jelentése alkil-amino-csoport, elõnyösek az olyan R c NH- képletû csoportok, ahol R c jelentése 3 7 szénatomos cikloalkilcsoport. Amikor R 2 jelentése legalább egy nitrogénatomot tartalmazó aromás szubsztituenst hordozó alkilcsoport, elõnyösek a legfeljebb 3 szénatomos és piridinil- vagy imidazolilcsoportot hordozó alkilcsoportok. Amikor R 2 jelentése aromás tioétercsoportot tartalmazó alkilcsoport, elõnyösek a legfeljebb 3 szénatomos és fenil-tio-csoportot hordozó alkilcsoportok, ahol a fenilcsoport adott esetben egy halogén szubsztituenst tartalmaz. 10 1 20 A gem-bifoszfon vegyületek közül az alábbiakat említhetjük: etidronát (R 1 =OH, R 2 =CH 3 ), klodronát (R 1 =Cl, R 2 =Cl), pamidronát (R 1 =OH, R 2 = CH 2 CH 2 NH 2 ), alendronát (R 1 =OH, R 2 = (CH 2 ) 3 NH 2 ), rizedronát (R 1 =OH, R 2 = CH 2-3-piridin), tiludronát (R 1 =H, R 2 = CH 2 S C 6 H 4 Cl), ibandronát (R 1 =OH, R 2 = CH 2 CH 2 N(CH 3 )-pentil), zoledronát (R 1 =OH, R 2 = CH 2 -imidazol), inkadronát (R 1 =H, R 2 = NH-(cikloheptil)), olpadronát (R 1 =OH, R 2 =CH 2 CH 2 N(CH 3 ) 2 ), neridronát (R 1 =OH, R 2 = (CH 2 ) NH 2 ). Az olyan savak, ahol R 2 jelentése legalább egy nitrogénatomot tartalmazó aromás szubsztituenst hordozó alkilcsoport, mint amilyen a zoledronát vagy a rizedronát, különösen elõnyösek. Egy találmány szerint módosított kalcium-foszforvegyület az alábbi kémiai összetétellel jellemezhetõ: Ca (10 a )(Mg,K,Na) b (PO 4 ) 6 c (HPO 4,CO 3 ) d (OH) 2 e (F,Cl,CO 3 ) f 2 30 3 40 4 0 60 [(OA) (OE) P (O) CR 1 R 2 P (O) (OA) (OE)] g,aholaés E jelentése hidrogénatom, alkálifém, alkáliföldfém vagy hiányzik, és ahol R 1 és R 2 jelentése a fenti, és 0<a<9; 0<b<2; 0<c<; 0<d<2; 0<e<2; 0<f<2; g<0,. Amikor A vagy E jelentése hidrogénatom, az ezt hordozó oxigénatom nem kapcsolódik a kalcium-foszfor mátrixhoz, vagy csupán egyszerûen hidrogénkötéssel kapcsolódik. Amikor A vagy E hiányzik, az ezt hordozó oxigénatom koordinálva van a készítmény egy másik elemével, például egy kalciummal. Egy módosított kalcium-foszfor-vegyület gem-bifoszfonsav tartalmát UV¹látható spektroszkópiával határozhatjuk meg az alábbi irodalmi helyen ismertetett eljárás szerint: Ames, B. N., Methods in Enzymology, Colowick, S. P. és Kaplan, N. O. szerk., Academic Press, Orlando, 8. kötet, 11 118. oldal (1966). Ezt meghatározhatjuk még 31 P folyadék NMR eljárással is. A módosított kalcium-foszfor-vegyület jellemzését fõleg a szilárd 31 P MAS NMR¹je útján végezhetjük, ez ugyanis egyszerre mutatja a kalcium-foszfor-hordozó és a hatóanyag jelenlétét. A találmány további tárgya injekció útján alkalmazható készítmény oszteoporózis vagy lítikus tumorok kiújulása kezelésére az oszteoklasztok aktivitásának gátlása útján. Ez a készítmény a fentiekben meghatározott módosított kalcium-foszfor-vegyületnek egy oldatban készített szuszpenziója vagy egy olyan biokompatibilis gél, amelynek viszkozitása lehetõvé teszi a 40 m és00 m közötti méretû szemcsék szállítását. Például megemlíthetjük a biológiailag felhasználható hidrogéleket, amelyeket az alábbi irodalmi helyen írtak le: Chem. Rev. (2001).; 101 (7): 1869 1879, különösen a cellulózszármazék vagy nátrium-hialuronát-alapú hidrogéleket. Az adott átmérõ megválasztását részben a reszorpció kinetikája, másrészt az injekció reológiája szabja meg. A 40 m-nél kisebb átmérõjû részecskék bioreszorpciós kinetikája túl gyors, és az 00 m-nél nagyobb átmérõjû részecskék reológiai problémákat okoznak injekciónál. Mindazonáltal megjegyezzük, hogy egy kis mennyiségû részecske (legfeljebb 10 térfogat%¹ig) lehet 40 m-nél kisebb vagy 00 m-nél nagyobb átmérõjû. Egy találmány szerinti injektálható készítmény elõnyösen 40 7 tömeg% módosított kalcium-foszfor-vegyületet, 60 2 tömeg% hidrogélt és adott esetben különféle adalékokat tartalmaz. Az adalékokat olyan vegyületek közül választjuk, amelyek képesek különbözõ biológiailag fontos ionok, például K +,Na +,Zn 2+,Mg 2+, CO 3 2, HPO 4 2,F vagy Cl bevitelére. A készítményt úgy állíthatjuk elõ, hogy a megfelelõ közegben szuszpendáljuk az elõzetesen elõállított, módosított kalcium-foszfor-vegyületet. Elõállíthatjuk úgy is, hogy a módosított kalcium-foszfor-vegyületet in situ csapatjuk ki egy elõzõekben meghatározott hidrogélbõl, amelybe elõzetesen adagoltuk a foszfát- (illetve kalcium¹) ionokat, amelybe ezután adagoljuk a megfelelõ kalciumionokat (illetve foszfátionokat) tartalmazó és kívánt bifoszfonsavkoncentrációjú oldatot. A kalcium-foszfor mátrix és a bifoszfonsav közötti kapcsolat módja eltérõ attól függõen, hogy milyen kalcium-foszfor mátrixot alkalmazunk, és ez a különbség megjelenik a különbözõ biológiai hatékonyságban is, az oszteoklaszttenyészeteken in vitro végzett tesztek során. A találmány szerinti készítménnyel injektálható formában lokálisan lehet kezelni egy csontproblémát az azonosított kockázatú fõ helyeken (combnyak és gerinc) olyan hatóanyag segítségével, amelyrõl ismert, hogy szisztemikus úton alkalmazható és amely a korábban említett különbözõ hátrányokkal rendelkezik. Ezenkívül a kalcium-foszfor-fázis, amely a hatóanyag vektora szerepét tölti be, egy kiegészítõ hatást fejt ki abban az értelemben, hogy lehetõvé teszi a gem-bifoszfonsav helyben tartását, és ez biztosítja a csont-új- 3
1 HU 00 762 T2 2 raalakulás stimulálásához szükséges kalcium- és foszfátforrást. A korábbi szakirodalomból ismert hidroxiapatit (HA), amelyet egy hatóanyaggal impregnált implantátum mátrixaként írtak le, nem tartozik a találmány szerint alkalmazható kalcium-foszfor-vegyületek közé, mivel oldhatósága viszonylag alacsony, elválaszthatatlan tulajdonsága, hogy gyengén szívódik fel, és a gembifoszfonsav bevitele csökkenti általában a kalciumfoszfor-vegyületek felszívódási potenciálját. Példák A találmányt a következõkben részletesebben ismertetjük a példák segítségével, ezeket kizárólag illusztrációképpen adjuk meg, de a találmányt nem korlátozzuk ezekre. Az alábbi vegyületeket és reagenseket alkalmaztuk: ultratiszta víz: víz, amelynek rezisztivitása 18 M cm körüli érték nátrium-zoledronát: a Novartis cég által forgalmazott gem-bifoszfonsav nátrium-tiludronát: a Sanofi-Synthélabo cég által forgalmazott gem-bifoszfonsav CDA NaOH úton: kalciumhiányos hidroxi-apatit, amelyet úgy állítunk elõ, hogy dikalcium-foszfátdihidrátot vizes NaOH-oldattal hidrolizálunk (40 80 m közötti szemcseméretû szemcsék formájában) CDA ammónium-hidroxid úton (kalciumhiányos hidroxi-apatit, amelyet úgy állítunk elõ, hogy dikalcium-foszfát-dihidrátot ammónium-hidroxiddal hidrolizálunk) 40 80 m közötti szemcseméretû szemcsék formájában ¹TCP, 40 80 m közötti szemcseméretû szemcsék formájában BCP (70% ¹TCP)/2% HA) 40 80 m közötti szemcseméretû szemcsék formájában BCP (2% ¹TCP)/7% HA) 40 80 m közötti szemcseméretû szemcsék formájában 1. példa Módosított kalcium-foszfor-vegyület elõállítása Kalcium-foszfát-szuszpenziót állítunk elõ oly módon, hogy 700 mg BCP¹t, amelynek szemcsemérete 40 80 m, adagolunk 3, ml ultratiszta vízbe, majd hozzáadunk 6 mg (0,14 mmol) zoledronátot. A szuszpenziót szobahõmérsékleten tartott kémcsõbe helyezzük, és 16 fordulat/perccel forgó keverõvel 48 órán keresztül keverjük. Ezután a szuszpenziót centrifugáljuk, és elválasztjuk az üledéket a felülúszótól. A szilárd fázist ezután többször mossuk ultratiszta vízzel, majd szûrjük és szobahõmérsékleten szárítjuk. Az eljárást megismételjük az alábbi kalcium-foszfor-vegyületekbõl kiindulva is: CDA NaOH úton, CDA ammónium-hidroxid úton és ¹TCP. Módosított kalcium-foszfor-vegyületek jellemzése Az egyes kalcium-foszfor mátrixokba bevitt zoledronát mennyiségét különbséggel határozzuk meg úgy, hogy meghatározzuk a felülúszóban jelen lévõ zoledronát mennyiségét. Ezt a meghatározást a centrifugálás 10 1 20 2 30 3 40 4 0 60 után az üledéktõl elválasztott felülúszóval végezzük 31 P folyadék NMR eljárással, elõzetesen felvett kalibráló görbékbõl. Ezt elvégezhetjük az UV/látható spektroszkópiás eljárással is az elõzõekben említett Ames által leírt eljárás szerint. Az egyes prekurzor kalcium-foszfor-vegyületekre kapott eredményeket az alábbi táblázatban adjuk meg. Itt a T (%) a végtermék zoledronáttartalmát mutatja mg hatóanyagban kifejezve 100 mg kalcium-foszfor-vegyületre, és a P (%) a vegyülethez kapcsolódó zoledronát százalékát mutatja a reakcióelegybe beadagolt mennyiséghez viszonyítva. Prekurzor T (%) P (%) BCP (7% ¹TCP/2% HA) 1 13 BCP (2% ¹TCP/7% HA) 2,7 33 CDA NaOH úton,2 6 CDA ammónium-hidroxid úton 6,4 80 -TCP 6,4 80 Az 1. ábrán a reakcióelegy centrifugálása után kapott felülúszó 31 P folyadék NMR-spektrumát mutatjuk be, ez megfelel a CDA prekurzornak (NaOH úton). A jelek integrálása az egyes molekulafajták mennyiségére utal, és a kémiai eltolódás (ami az adott molekulára jellemzõ) az abszcisszán látható. Az 1¹essel jelölt csúcs a zoledronáttartalmat, a 2¹es csúcs a kalciumfoszfor-vegyület által a közegbe juttatott foszfátot és a 3¹as csúcs a referencia NaH 2 PO 4 ¹et mutatja. Az egyéb prekurzorokból kapott vegyületek (a hidroxi-apatitot kivéve) 31 P folyadék NMR-spektruma analóg, és minden esetben megfigyelhetõ a reakció során foszfátleadás. A kapott szilárd anyagok jellemzése azt mutatja, hogy két különbözõ zoledronátkapcsolódási mód figyelhetõ meg, a kiindulási kalcium-foszfor-vegyület minõségétõl függõen. A 2. ábrán pásztázó elektronmikroszkópos fényképet mutatunk be (M. E. B.), amelyet a ¹TCP-bõl származó vegyületen vettünk fel. Ez azt mutatja, hogy egy zoledronát forma (valószínûleg kalciumhoz kapcsolódva) kristályosodik a kalcium-foszfor mátrix felületén. Ugyanezt a jelenséget figyelhetjük meg a BCP¹k esetében, ezek akár nagy ¹TCP-tartalmúak (7% ¹TCP-2% HA), akár alacsony ¹TCP-tartalmúak (2% ¹TCP-7% HA). A szilárd 31 P MAS NMR adatokat a 3. ábrán mutatjuk be a ¹TCP-bõl származó vegyület esetén. Az 1¹essel jelölt spektrum, amelyet CP módban vettünk fel (keresztezett polarizáció) lehetõvé teszi a beépült zoledronát szelektív megfigyelését. A finom jelekbõl láthatjuk, hogy kristályos formában van jelen. A 2¹es számú spektrumot protonlecsatolás módban vettük fel, ez lehetõvé teszi a változatlan ¹TCP hordozó szelektív megfigyelését. A 4. ábrán a szilárd 31 P CP¹MAS NMR-spektrumát mutatjuk be a CDA-ból származó (ammónium-hidroxidos úton) vegyületre. A zoledronát jel (1¹gyel jelölt csúcs) nagyon széles. Az anyag felszínén semmilyen kristályos fázis nem mutatható ki, ami valószínûleg a 4
1 HU 00 762 T2 2 zoledronátnak a CDA felületre történõ kemiszorpcióját mutatja. A 2¹es csúcs jellemzõ a CDA¹ra. 2. példa Tiludronáttal és metilén-bifoszfonsavval módosított kalcium-foszfor-vegyületek elõállítása Kalcium-foszfát-szuszpenziót készítünk úgy, hogy 700 mg 40 80 m szemcseméretû ¹TCP¹t adagolunk 3, ml ultratiszta vízbe, majd hozzáadunk 2, mg (0,14 mmol) tiludronátot. A szuszpenziót szobahõmérsékleten tartott kémcsõbe helyezzük és 16 fordulat/perccel forgó keverõvel 48 órán keresztül keverjük, majd a szuszpenziót centrifugáljuk, és az üledéket elválasztjuk a felülúszótól. A szilárd fázist ezután többször mossuk ultratiszta vízzel, majd szûrjük és szobahõmérsékleten szárítjuk. A zoledronáttal tapasztalhatóhoz hasonló reaktivitást figyelünk meg. Az. ábrán mutatjuk be a tiludronáttal kezelt ¹TCP 31 P CP¹MAS NMR-spektrumát. A tiludronátot kristályos fázis formájában figyelhetjük meg (1¹es masszív jel, amely finom jelekbõl áll), ez a kalcium-foszfor-fázisra van deponálva (ez gyengén látszik) a spektrum felvételének ezen körülményei között (2¹es masszív csúcs). 3. példa Injektálható készítmény elõállítása Injektálható készítményt állítunk elõ az 1. és 2. példában elõállított módosított vegyületek mindegyikébõl, kivéve a hidroxi-apatitból kapott módosított vegyületeket, az alábbi eljárással: Az egyes módosított vegyületekbõl olyan szemcséket készítünk, amelyek 9 térfogat%-ban 40 és 80 m közötti ekvivalens részecske átmérõvel rendelkeznek, és ezeket a szemcséket olyan vizes oldatba visszük, amely 3% hidroxi-propil-metil-cellulózt tartalmaz, amely 21 tömeg% metilcsoportot és 8 tömeg% hidroxi-propilcsoportot tartalmaz, és polimerizációs foka 110. Ily módon olyan készítményt kapunk, amely 49 tömeg% szemcsét tartalmaz. Az így elõállított készítményeket üvegflakonba helyezzük és autoklávban 121 C¹on 20 percen keresztül sterilizáljuk. 4. példa In vitro teszt a módosított kalcium-foszfátokkal A módosított kalcium-foszfor-vegyület kombináció hatékonyságának meghatározására újszülött nyulak hosszú csontjából izolált teljes csontsejteket használtunk. Az 1. példában kapott módosított BCP és ammónium-hidroxid úton elõállított CDA tulajdonságait mértük, és összehasonlítottuk a gem-bifoszfonsavval nem kezelt megfelelõ kalcium-foszfor prekurzor tulajdonságaival. Az egyes vizsgálatoknál egy elsõ tenyésztõlyukba két ámbráscet-dentinpasztillát (ez a referenciavegyület a reszorpcióméréshez) és egy nem kezelt kalciumfoszfor-vegyület pasztillát helyezünk, egy második tenyésztõlyukba két dentinpasztillát és egy felületen kezelt kalcium-foszfor-vegyület pasztillát helyezünk. 10 1 20 2 30 3 40 4 0 60 Az ilyen tenyésztõ körülmények közötti oszteoklaszt reszorpciós aktivitást ( nappal késõbb) három különbözõ paraméter révén határoztuk meg: 1. Az ámbráscetdentin felületén képzõdött összes hézag száma 2. A hézagok átlagos felülete 3. A reszorbeált dentin felülete Az alábbiakat állapítjuk meg: 1 tömeg% zoledronáttal módosított BCP pasztillák jelenlétében nem kimutatható a kísérlet csontsejtjeinek a reziduális reszorpciós aktivitása. A jelenség valószínûleg a citotoxikus hatású zoledronát jelentõs mennyiségének a leadásával kapcsolatos. Tulajdonképpen, ha vízbe BCP¹t vagy módosított ¹TCP¹t teszünk, jelentõs mennyiségû feltöltött zoledronát gyorsan oldatba megy. Például, ha 60 mg módosított ¹TCP¹t 1 ml vízben 8 órán keresztül szuszpenzióba viszünk, akkor körülbelül 2% feltöltött zoledronát, vagyis 10 2 M mol koncentráció leadásra kerül. 6,4 tömeg% zoledronáttal módosított CDA pasztillák jelenlétében a sejtek reszorpciós aktivitása körülbelül 80%-kal csökken a zoledronát nélküli kontrollhoz viszonyítva. A módosított ¹TCP esetéhez hasonlóan, ha 60 mg módosított CDA¹t 1 ml vízben 8 órán keresztül szuszpendálunk, akkor semmilyen zoledronát nem mutatható ki (UVlátható eljárással). Ez azt jelzi, hogy a zoledronát potenciálisan csak 10 4 molnál kisebb koncentrációban lehet jelen (ez a mi elemzési körülményeink között a kimutathatóság határa). A fenti eredmények azt mutatják, hogy az anyag tulajdonságai nem egyedül a kalcium-foszfor mátrixra kapcsolódó zoledronát mennyiségétõl függ, hanem függ a zoledronát leadási sebességétõl is, és igazolják a módosított kalcium-foszfor mátrix táv hatását.. példa Több (200 mg¹os) az 1. példa szerinti eljárásnak megfelelõen zoledronát hozzáadásával módosított CDA mintát és több nem módosított CDA mintát inkubáltunk ml tenyésztõközegben 37 C¹on. 96 órán keresztül végzett inkubálás után a különbözõ felülúszókat összegyûjtöttük, és nyúloszteoklaszt kísérletben használtuk tisztán, 10¹, 100- és 1000-szeresre hígítva. Az eredményeket a 6. ábrán mutatjuk be, ahol az ordinátán az R reszorpciót, és az abszcisszán a körülményeket tüntetjük fel. A körülmények az alábbiak: Vivõanyag a tiszta tenyésztõközeget jelenti CDA tisztán a tiszta CDA tenyésztõközegben történõ inkubálásában keletkezõ felülúszót jelenti; CDA1/10, CDA1/100 és CDA1/1000 rendre az 1/10¹, 1/100- és 1/1000-szeresre hígított fenti oldatot jelenti. Tiszta zo egy 10 6 mol¹os zoledronátoldatot jelöl a tenyésztõközegben, zo1/10, zo1/100, zo1/1000 rendre a fenti oldat 1/10¹, 1/100- és 1/1000-szeres hígítását jelöli. CDAzo tisztán a zoledronáttal töltött CDA tenyésztõközegben történõ inkubálásából kinyert
1 HU 00 762 T2 2 felülúszót jelöli, CDAzo1/10, CDAzo1/100 és CDAzo1/1000 rendre a fenti oldatot jelöli 1/10¹, 1/100- és 1/1000-szeresre hígítva. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy. a kalcium-foszfor-fázis által felszabadított zoledronát (CDAzo) megõrzi az oszteoklaszt reszorpció gátló hatását kifejezett dózisfüggõ módon, önmagában a CDA úgy tûnik nem befolyásolja az oszteoklaszt reszorpciót, függetlenül a felülúszó hígításától, a zoledronát oldatban (zo) megõrzi biológiai hatását, és egy dózis/hatás arány szerint gátolja a reszorpciót. Ha összehasonlítjuk a CDA/Zo kombináció által és a tiszta zoledronát által (10 6 mol¹os oldat, amelyet tisztán, 10¹szeresre, 100-szorosra és 1000-szeresre hígítva használunk) kiváltott oszteoklaszt reszorpció inhibiciós profiljait, akkor arra következtethetünk, hogy az anyag egy 10 6 mol körüli koncentrációnak megfelelõ mennyiségû zoledronátot szabadít fel. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás módosított kalcium-foszfor-vegyület elõállítására, azzal jellemezve, hogy abból áll, hogy egy gem-bifoszfonsavat vagy annak valamely alkálifémvagy alkáliföldfémsóját hozzáadunk egy prekurzor kalcium-foszfor-vegyület ultratiszta vízzel készített szuszpenziójához, a reakcióelegyet szobahõmérsékleten keverjük, majd centrifugálással kinyerjük a képzõdött vegyületet. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy azok a savak vagy sók, amelyeket alkalmazunk gem-bifoszfon vegyületként az (OY) (OX)P(O CR 1 R 2 P(O) (OX) (OY) képlettel írhatók le, a képletben X vagy Y jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy alkálifém- vagy alkáliföldfémkation, R 1 jelentése H, OH vagy halogénatom, és R 2 jelentése: hidrogén- vagy halogénatom, alkilcsoport, amino-alkil-csoport, ahol az aminocsoport adott esetben egy alkil szubsztituenst hordoz, alkil-amino-csoport, alkilcsoport, amely egy legalább egy nitrogénatomot tartalmazó aromás szubsztituenst hordoz, alkilcsoport, amely aromás tioétercsoportot hordoz. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy R 1 és/vagy R 2 jelentése klóratom. 4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy R 2 jelentése 1 6 szénatomos csoport. 10 1 20 2 30 3 40 4 0. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy R 2 jelentése egy NH 2 (CH) n képletû amino-alkilcsoport, ahol n értéke kisebb mint 6. 6. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy R 2 jelentése egy R R N(CH 2 ) m képletû alkilamino-alkil-csoport, ahol R és R jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy legfeljebb szénatomos alkilcsoport, és m értéke kisebb mint 6. 7. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy R 2 jelentése egy R c NH- képletû alkil-amino-csoport, ahol R c jelentése 3 7 szénatomos cikloalkilcsoport. 8. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy R 2 jelentése legfeljebb 3 szénatomos alkilcsoport, amely egy piridinil- vagy imidazolilcsoportot hordoz. 9. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy R 2 jelentése egy legfeljebb 3 szénatomos alkilcsoport, amely fentiltiocsoportot hordoz, ahol a fenilcsoport adott esetben halogén szubsztituenst hordoz. 10. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy R 1 jelentése hidroxilcsoport, R 2 jelentése CH 2 - imidazol-csoport, A és E jelentése hidrogénatom. 11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a képzõdött vegyületet ultratiszta vízzel történõ mosással tisztítjuk, amelyet szûrés és szobahõmérsékleten történõ szárítás követ. 12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kalcium-foszfor-vegyületet a következõk közül választjuk: a BCP, a CDA, amely egy kalciumhiányos hidroxi-apatit, és a ¹TCP. 13. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szobahõmérsékleten végzett keverést 1 óra és 72 óra közötti idõtartamon keresztül fenntartjuk. 14. Módosított kalcium-foszfor-vegyület, amely az 1 13. igénypontok bármelyike szerinti eljárással állítható elõ. 1. A 14. igénypont szerinti módosított kalciumfoszfor-vegyület, ahol a kalcium-foszfor-vegyületet a BCP, a CDA, amely kalciumhiányos hidroxi-apatit, és a ¹TCP közül választjuk. 16. Injekció útján alkalmazható készítmény oszteoporózis vagy litikus tumorok kiújulása kezelésére az oszteoklasztok aktivitásának gátlása útján, azzal jellemezve, hogy 40 7 tömeg% 14. vagy 1. igénypont szerinti módosított kalcium-foszfor-vegyület 60 2 tömeg% hidrogélben készített szuszpenziójából áll. 17. A 16. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a biokompatibilis gél egy biológiailag használható hidrogél. 18. A 17. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a gél egy cellulózból származó hidrogél vagy egy nátrium-hialuronát-alapú gél. 6
HU 00 762 T2 Int. Cl.: A61L 27/12 7
HU 00 762 T2 Int. Cl.: A61L 27/12 8
HU 00 762 T2 Int. Cl.: A61L 27/12 9
Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest