9. Szilárdfázisú szintézisek oligopeptidek, oligonukleotidok
Peptidszintézis Amidkötés kialakítása R O OH + H 2 N Q R O Q N + H 2 O H R O OH + H 2 N Q R O O + H 3 N Q sav-bázis reakció már nem nukleofil
Amidkötés kialakítása A karbonsavat aktiválni kell R O X + H 2 N Q R O N H Q + HX X = jó távozó csoport X = klorid, anhidrid, aktív észter
Dipeptid szintézis
Védőcsoportok N-terminális és amino-védőcsoportok (a teljesség igénye nélkül)
Védőcsoportok C-terminális és karboxil-védőcsoportok OH tercier-butil-észter (tbu) savra érzékeny pl. trifluorecet sav (TFA) OH benzil-észter (Bn) H 2 / Pd / C
Védőcsoportok Egyéb, oldallánc-védőcsoportok (Cys, Tyr, Ser, Thr, Lys)
-COOH aktiválás Aktív észterré alakítás (in situ)
-COOH aktiválás Aktív észterré alakítás (in situ) Átészterezés hidroxibenztriazolokkal (kevesebb racemizáció)
Aktiválás a gyakorlatban karbodiimid + triazol együtt DCC DIC EDC (EDAC)
Szilárd hordozók (gyanták) Két fő technika (Fmoc/tBu; Boc/Bn) Boc/Bn : Merrifield gyanta (polisztirol / divinil benzol) Fmoc/tBu : Wang gyanta (p-hidroxibenzil alkohol / polisztirol) egyéb gyanták : amid végű, hasíthatóság stb.
Szilárd hordozók (gyanták) Stabil legyen, kémiailag ellenálló Duzzadóképesség, jól átjárható legyen Az első aminosavat rá lehessen kapcsolni A szintézis végén le lehessen hasítani
Az első aminosav kapcsolása Eltér a többitől A COOH-csoporton keresztül történik A szilárdfázisú peptidszintézis során C felé haladunk! A szintézis végén le lehessen hasítani N
Szintézis első aminosav felkapcsolása N-védett elsõ aminosav O gyanta BocHN CH 2 C OH HO KF O BocHN CH 2 C O
Szilárd-fázisú szintézis
Védőcsoport eltolítás (Nterminális) O BocHN CH 2 C O 1. védõcsoport eltávolítás (TFA) O H 2 N CH 2 C O szabaddá váló N-terminális
Második aminosav felkapcsolása Gly-gyanta O H 2 N CH 2 C O O BocHN CH C CH 3 OH 2. Második, N-terminálisán védett aminosav (Boc-Ala)+ aktiválószer (DIC / HOBt) BocHN O CH C O H N CH 2 C O CH 3 Boc-Ala-Gly-gyanta
1. Védőcsoport eltávolítás 2. Boc-aminosav kapcsolása 3. Egy-egy kapcsolás hatékonysága ~99% 4. Csak 20 aminosav után nő meg a rövidebb peptidek száma jelentősen 5. Kapcsolások hatákonysága színreakcióval ellenőrizhető Lánchosszabítás BocHN BocHN BocHN BocHN Lys Val Val Ala Asp Lys Val Ala Gly 1. TFA 2. Boc-Val Gly 1. TFA 2. Boc-Lys Ala Ala Gly 1. TFA 2. Boc-Asp Gly
Kaiser teszt kapcsolás ellenőrzése Primer amino csoport (a-nh 2 ) Ha van szabad amino csoport (kék), meg kell ismételni a kapcsolást Prolinhoz izatin teszt
Kész peptid a gyantán Boc/Bn stratégia a kész peptid lehasítása a gyantáról és az összes védőcsoport eltávolítása (TFMSA, HF speciális berendezés) Fmoc/tBu stratégia: N-terminális Fmoc lehasítása utána a peptid és a többi oldallánc védőcsoport lehasítása egyben TFA-val Gyökfogók használata (víz, szilil, fenol stb) A kész peptid tisztítása HPLC-vel, (HPLC-MS) Hosszabb peptidek szintézise fragmeskondenzációval (rövidebb szakaszok szilárd fázison, majd ezeket oldatban kapcsolják össze megfelelő védőcsoportok kombinációja szükséges)
Oldatfázisú vs. Szilárdfázisú szintézis oldat Olcsóbb Homogén Nagyobb mennyiségekre, rövidebb peptidekre Lassú Nem automatizálható szilárd Drága, pazarló Heterogén Kisebb mennyiségre, hosszabb szekvenciákra Gyors Könnyű tisztítás automatizálható
Nem természetes aminosavak 22
Oligopeptidek módosításai Zsírsavakat kapcsolhatunk hozzá (lipoproteinek, lipopeptidek) Biotint kapcsolhatunk hozzá Gyógyszerhatóanyagot Szerves csoportokat pl. fémionokat komplexáló ligandumokat (PET jelzés) Ciklizálás (akár gyantán is, crgd-k) Automatizálás
Peptidek felhasználása Membránfehérjék modellezése (lipopeptidekkel) Assay készítés (biotinilált peptidek) Szállítópeptidek (gyógyszerek irányított célbajuttatása) Gyógyszerhatóanyagok szintézise (epitópok) Kombinatorikus szintézis polihis tag, microarray
Kombinatorikus peptidszintézis Furka Árpád (ELTE)
Kombinatorikus peptidszintézis 3 ciklus 4 ciklus Furka Árpád (ELTE)
Oligonukleotidok szintézise A nukleozid 3 / 5 foszfátok nem eléggé reaktívak 3 -O-foszforamidit származékok A többi funkciós csoportot inaktiválni kell (védőcsoportok) A származékok kereskedelmi forgalomban beszerezhetők
Védőcsoportok 5 -hidroxil csoport dimetoxi tritil (DMT) savérzékeny T (U) nem igényel védőcsoportot A, da aminocsoportját Bz védőcsoporttal C, dc aminocsoportját Bz, vagy Ac védőcsoporttal G, dg, aminocsoportját izobutiril csoporttal védik A foszfit csoportot cianoetillel védik A DMT kivételével bázisra érzékenyek A származékok kereskedelmi forgalomban beszerezhetők
Védőcsoportok
Védőcsoportok
Szintetikus ciklus 5 -véghez kapcsolódik a következő nukleotid 5 -DMT csoport eltávolítása, az 5 OH szabaddá válik A következő, 5 O-DMT nukleotid kapcsolása (tetrazol reagenssel) A kevés (<1%) elreagálatlan 5-OH t deaktiválják (capping) Ac 2 O-val Az új foszfit-triésztert (P(III)) oxidálni kell (nem stabil), meg nem is ez van a nukleinsavakban pl. I 2 /víz Hordozó: polisztirol (makropórusos), vagy üveg (controlled pore glass, CPG)
Nukleotidok összekapcsolása
Szintetikus ciklus
OLIGONUKLEOTIDOK UTÓKEZELÉSE Védőcsoportok eltávolítása, hordozóról való lehasítás A lúg hatására lehasad: - védőcsoportok a bázisokról - -cianoetil csoport a fosztátról - oligo a hordozóról - Liofilizálás, sómentesítés - Tisztítás: HPLC (méret szerint, ioncsere)
OLIGONUKLEOTIDOK: FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEK - primerek: DNS, RNS szekvenálás, PCR, mutagenezis - linkerek: mesterséges hasítóhelyek bevitele - adapterek: különböző (nem-kompatibilis) ragadós DNS végek összekötése, esetleg hasítóhely bevitelével - hibridizációs próbák, DNS diagnosztika - géndarabok - egyéb, pl. DNS affinitásoszlopok készítése, stb.
Oligonukleotid módosítások - primer, FISH-próba - azid / acetilén linkert tartalmazó (klikk-kémia) - tiol-linker (pl. arany felszínhez) - biotin linker - fluoreszcens módosítások (pl. molecular beaconhez) - géndarabok - egyéb, pl. DNS affinitásoszlopok készítése, stb. - nem természetes nukleotidok beépítése
Energiatranszfer (FRET) rendszerek Két fluorofór (Donor, akceptor) A donort gerjesztve az akceptor világít F 1 * + F 2 F 1 + F 2 * F 1 * + Q F 1 + Q A donor emissziós spektruma átfed az akceptor gerjesztési spektrumával
Energiatranszfer (FRET) rendszerek Távolságfüggő (10-100 Å) Képalkotó technikák (időbeli követés) Stokes-eltolódás változás Kinetikai mérések, konformációs változások, komplexálás stb
Molecular Beacon
Enzimhidrolízis - FRET
Membránfúzió
Alkímia Ma, 2009. január 8.
Oligonukleotid módosítások I / a.u. 14 12 10 8 6 4 2 DNA1-9 20 C 40 C 60 C 65 C 70 C 80 C 90 C 0 500 550 600 650 700 750 800 850 / nm
Oligonukleotid módosítások exc = 430 nm Kettősen jelölt primer. (zöld-piros) RT-PCR