A membrán-fehérjék térbeli szerveződése a plazmamembránban: Fehérje asszociáció, klaszterek, hálózatok

Hasonló dokumentumok
A sejtmembrán molekuláris szerveződése, membrán mikrodomének

3. A plazmamembrán molekuláris szerveződése és annak dinamikája

ZÁRÓJELENTÉS. A pályázat címe: Az MHC I. sejtfelszíni szerveződése. OTKA ny. sz.: T Témavezető: Dr. Mátyus László. Magyar nyelvű összefoglalás

Az ellenanyagok orvosbiológiai. PhD kurzus 2011/2012 II. félév

Speciális fluoreszcencia spektroszkópiai módszerek

Mozgékony molekulák vizsgálata modern mikroszkópiával

ADATÉRTÉKEL ELJÁRÁSOK SEJTFELSZÍNI FEHÉRJEMINTÁZATOK ANALÍZISÉRE SZENTESI GERGELY

Biológiai membránok és membrántranszport

A T sejt receptor (TCR) heterodimer

Modern mikroszkópiai módszerek


Daganat immunterápia molekuláris markereinek tanulmányozása biofizikai módszerekkel. Áramlási és képalkotó citometria

Biomolekuláris rendszerek. vizsgálata. Semmelweis Egyetem. Osváth Szabolcs. A mikroszkópok legfontosabb típusai

Membrán mikrodomének, mikrovezikulák, membrán nanocsövek és szerepük a sejtfunkciókban. A sejtmembrán ultrastruktúrája

(1) A T sejtek aktiválása (2) Az ön reaktív T sejtek toleranciája. α lánc. β lánc. V α. V β. C β. C α.

térrészek elválasztása transzport jelátvitel Milyen a membrán szerkezete? Milyen a membrán szerkezete? lipid kettısréteg, hidrofil/hidrofób részek

Részletes szakmai beszámoló Az erbb proteinek asszociációjának kvantitatív jellemzése című OTKA pályázatról (F049025)

Fluoreszcencia módszerek (Kioltás, Anizotrópia, FRET)

Fluoreszcencia módszerek (Kioltás, Anizotrópia, FRET) Modern Biofizikai Kutatási Módszerek

Atomi és molekuláris kölcsönhatások. Pásztázó tűszondás mikroszkópia.

1. Előadás Membránok felépítése, mebrán raftok

Immunológia alapjai előadás MHC. szerkezete és genetikája, és az immunológiai felismerésben játszott szerepe. Antigén bemutatás.

1. előadás Membránok felépítése, mebrán raftok, caveolák jellemzője, funkciói

Rövid ismertető. Modern mikroszkópiai módszerek. A mikroszkóp. A mikroszkóp. Az optikai mikroszkópia áttekintése

Biomolekuláris rendszerek. vizsgálata. Semmelweis Egyetem. Osváth Szabolcs

A fluoreszcencia orvosibiológiai. alkalmazásai. Fluoreszcencia forrása I. Fluoreszcencia alkalmazások. Kellermayer Miklós

Fény- és fluoreszcens mikroszkópia. A mikroszkóp felépítése Brightfield mikroszkópia

Pásztázó mikroszkópiás módszerek

Immunológia alapjai előadás. Az immunológiai felismerés molekuláris összetevői

Immunológia alapjai előadás. Az immunológiai felismerés molekuláris összetevői.

Fluoreszcencia 2. (Kioltás, Anizotrópia, FRET)

Immunológia alapjai előadás Az immunológiai felismerés molekuláris összetevői. Az antigén fogalma. Antitestek, T- és B-sejt receptorok:

Immunológiai módszerek a klinikai kutatásban

ORVOSI BIOFIZIKA. Damjanovich Sándor Mátyus László QT Szerkesztette

Sejt - kölcsönhatások az idegrendszerben

Ragyogó molekulák: dióhéjban a fluoreszcenciáról és biológiai alkalmazásairól

Az áramlási citométer és sejtszorter felépítése és működése, diagnosztikai alkalmazásai

Sejtmozgás és adhézió Molekuláris biológia kurzus 8. hét. Kun Lídia Genetikai, Sejt és Immunbiológiai Intézet

Immunológiai Gyakorlatok II április

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Az Oxidatív stressz hatása a PIBF receptor alegységek összeszerelődésére.

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Antigén, Antigén prezentáció

A LÉZERSUGÁRZÁS ALAPVETŐ ISMÉRVEI SPONTÁN VS. INDUKÁLT EMISSZIÓ A FÉNYERŐSÍTÉS FELTÉTELE A POPULÁCIÓ INVERZIÓ FELTÉTELE

Speciális fluoreszcencia spektroszkópiai alkalmazások. Emlékeztető: az abszorpció definíciója. OD = A = - log (I / I 0 ) = ε (λ) c x

Transzporterek vizsgálata lipidmembránokban Sarkadi Balázs MTA-SE Molekuláris Biofizikai Kutatócsoport, MTA-TTK Budapest

Avidin biotin rendszer

Immunológiai módszerek a klinikai kutatásban

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Ellenanyag reagensek előállítása II Sándor Noémi

A membrán koleszterin és sziálsav szerepe az immunrendszer sejtjeinek működésében: vizsgálatok monoklonális ellenanyagok segítségével

Áramlási citometria, sejtszeparációs technikák. Immunológiai és Biotechnológiai Intézet ÁOK, PTE

Biomolekuláris kölcsönhatások vizsgálata felületi plazmonrezonancia elvén működő Biacore keszülékkel

Egyetemi doktori (PhD) értekezés tézisei. IL-2 és -15 receptorok kölcsönhatásainak vizsgálata humán T limfóma sejteken.

A lézer-szkenning citometria lehetőségei. Laser-scanning cytometer (LSC) Pásztázó citométer. Az áramlási citometria fő korlátai

Immunológia alapjai. 16. előadás. Komplement rendszer

Membrántranszport. Gyógyszerész előadás Dr. Barkó Szilvia

Immunológiai módszerek a klinikai kutatásban

Glükoproteinek (GP) ELŐADÁSVÁZLAT ORVOSTANHALLGATÓK RÉSZÉRE

6. Fehérjék kimutatása. Biokémiai és sejtszintű vizsgálatok

A lipid raft mikrodomének (MLR CSK rendszer) szerepe az immunsejtek. sejtérés jelátávitel/aktiváció sejthalál effektor funkciók és betegségek...

A keringı tumor markerek klinikai alkalmazásának aktuális kérdései és irányelvei

7. előadás: A plazma mebrán szerkezete és funkciója. Anyagtranszport a plazma membránon keresztül.

6. Fehérjék kimutatása. Biokémiai és sejtszintű vizsgálatok

Modern Biofizikai Kutatási Módszerek Kereskedelmi forgalomban kapható készülékek. Áramlási citometria (flow cytometry)

Immunológia alapjai 5-6. előadás MHC szerkezete és genetikája, és az immunológiai felismerésben játszott szerepe. Antigén bemutatás.

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Sejt. Aktin működés, dinamika plus / barbed end pozitív / szakállas vég 1. nukleáció 2. elongáció (hosszabbodás) 3. dinamikus egyensúly

AKADÉMIAI DOKTORI ÉRTEKEZÉS

A plazma membrán mikrodomének szabályzó szerepe a sejtek növekedési és stressz érzékelési folyamataiban. Csoboz Bálint

Natív antigének felismerése. B sejt receptorok, immunglobulinok

d z. nsin

A koleszterinben gazdag lipidtutajok szabályozó hatásai a limfociták effektor funkciói, differenciálódása és kommunikációja során.

MULTICELLULÁRIS SZERVEZŐDÉS: SEJT-SEJT (SEJT-MÁTRIX) KÖLCSÖNHATÁSOK 1. Bevezetés (2.)Extracelluláris mátrix (ECM) (Kollagén, hialuron sav,

Áramlási citometria / 4. Immunológiai és Biotechnológiai Intézet PTE KK

6. Fehérjék kimutatása. Biokémiai és sejtszintű vizsgálatok

Az adaptív immunválasz kialakulása. Erdei Anna Immunológiai Tanszék ELTE

Receptorok és szignalizációs mechanizmusok

Bevezetés a fluoreszcenciába

Immunológia alapjai. 10. előadás. Komplement rendszer

Röntgendiffrakció, tömegspektrometria, infravörös spektrometria.

TDK lehetőségek az MTA TTK Enzimológiai Intézetben

a. Nyugalmi potenciál b. Transzport proteinek c. Akciós potenciál. Nyugalmi potenciál. 3 tényező határozza meg:

Membránszerkezet Nyugalmi membránpotenciál

Mikroszerkezeti vizsgálatok

Szerkezet és funkció kapcsolata a membránműködésben. Folyadékkristályok típusai (1) Dr. Voszka István

Immunológia Alapjai. 13. előadás. Elsődleges T sejt érés és differenciálódás

Nusser Zoltan. Celluláris Idegélettani Laboratórium MTA Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet Budapest

TRIPSZIN TISZTÍTÁSA AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA SEGÍTSÉGÉVEL

EGYETEMI DOKTORI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI. Áramlási citometriás FRET mérések optimalizálása és alkalmazása a majdnem teljes

Szerkezet és funkció kapcsolata a membránműködésben. Folyadékkristályok típusai (1) Dr. Voszka István

Az ellenanyagok szerkezete és funkciója. Erdei Anna Immunológiai Tanszék ELTE

Az áramlási citometria gyakorlati alkalmazása az ondó rutin analízisben. Hajnal Ágnes, Dr Mikus Endre, Dr Venekeiné Losonczi Olga

Atomi, illetve molekuláris kölcsönhatások és alkalmazásaik

Folyadékkristályok; biológiai és mesterséges membránok

Az élő sejt fizikai Biológiája:

Vezikuláris transzport

KIS G-FEHÉRJE AKTIVÁLÓDÁS VIZSGÁLATA ANGITENZIN HATÁSMECHANIZMUSÁBAN

Immunológia 4. A BCR diverzitás kialakulása

Egy idegsejt működése. a. Nyugalmi potenciál b. Transzport proteinek c. Akciós potenciál

Átírás:

2. A membrán-fehérjék térbeli szerveződése a plazmamembránban: Fehérje asszociáció, klaszterek, hálózatok

A membránfehérjék globális szerkezete és kapcsolódása a lipid kettősréteghez: osztályozási elvek, kategóriák Ext. 1 2 8 3 4 membrán 9 - + - - ++ 5 Int. 1.) antigének, receptorok 2.) multi-span fehérjék 3.) transzport fehérjék (multi-alegység komplexek) 4.) glikozil-foszfatidilinozitol (GPI) horgonyzott külső perifériás fehérje 5.) zsírsavval (mirisztoil-, palmitoil-, prenyl-) acilált belső perifériás fehérje 6.) sejtváz struktúrfehérje (pl. spektrin és analógjai, aktin filamentum) 7.) dinamikus kapcsoló fehérjék (pl. ERM fehérjecsalád) 8.) transzmembrán adaptor fehérjék (pl. LAT, NTAL) 9.) pányvázó (scaffolding) fehérjék 6 7 7

A membránfehérjék dinamikus, szupramolekuláris klaszterei ( mintázatai ) a sejtfelszínen: molekuláris homo- és heteroasszociátumok; clusterek; membrán mikrodomének Ezeket kiváltó/stabilizáló tényezők: genetikailag determinált komplexek (pl. TcR/CD3, BcR komplex, FcεRI) ligand indukált aggregáció (pl. EGF-receptor TK család) fehérje-fehérje kcsh.: konformáció/affinitás hajtott asszociációk (pl. MHChomoasszociáció, MHC-I és MHC-II közötti hetero-asszociációk, tetraspan web ) lipid mikrodomének általi kompartmentalizáció (diffúziós barrier, fehérjelipid kölcsönhatás): raftok, caveolák (pl. GPI-fehérjék /CD14,CD48/,acilált Src kinázok összegyüjtése, IL-2/IL-15 receptorkomplex alegység kompartmentalizáció) citoszkeletális kihorgonyzás/kapcsolás: adhéziós (vinculin/talin), accessory/kapcsoló/adapter fehérjék (pl. LAT, NTAL, Gab1, MAGUK-family, ERM-family)

A fehérje-asszociáció / csoportosulás (clustering) különböző szintjei membránokban: molekuláris szint Homo-asszociáció: (5-10 nm) Hetero-asszociáció: (5-10 nm) pl. HLA-DR pl. FasR (CD95) pl. HLA-I Insulin Receptor szupramolekuláris szint Fehérje cluster: (50 500 nm) Membrán mikrodomén: (20 nm 2 μm) pl. (TcR-CD3) n aktivált T sejteken pl. raft (tutaj)

burkolt csapda vezikuláris transzport, fúzió a sejtmembránnal Dinamikus szupramolekuláris membrán struktúrák (mikrodomének) Chlatrin burok R ligand asszociáció speciális lipid mikrodoménekkel (raft, caveola) (Golgi) Kölcsönhatás a membrán szkeletonnal: kötődés, kerítéshatás Fehérje asszociáció, aggregáció Jelátviteli kaszkádok (PTK, G-protein, PI, kalcium)

Többláncú Immunfelismerő Receptorok családja ( Multichain Immune Recognition Receptor, MIRR) BCR TCR FcεR I

PM organization of the interleukin-2 receptor complex Nanometer-scale organization of the alpha subunits of the receptors for IL2 and IL15 in human T lymphoma cells Bärbel I. de Bakker, Andrea Bodnár, Erik M. H. P. van Dijk, György Vámosi, Sándor Damjanovich, Thomas A. Waldmann, Niek F. van Hulst, Attila Jenei, María F. Garcia-Parajo. J Cell Sci 2008 121: 627-633; doi: 10.1242/jcs.019513

Az IL-2 és IL-15 citokinek immunszabályozó funkciói függenek az aktuális membrán receptor szerveződéstől/affinitástól

A plazmamembránok laterális doménszerkezete Laterális fehérje denzitás: 10-30.000/μm 2 ; lipid fajlagos felület: 0.68 nm 2 ; α-helix fajlagos felület: 1.1 nm 2 ; fehérjék által elfoglalt terület: single-span: ~ 1 nm 2, tetraspan: 4.5 nm 2, sevenspan: ~ 8 nm 2 Egy 30x30 nm 2 területű membrándoménbe belefér pl. : vagy 32 lipid, vagy 15 single-span fehérje, vagy 12 tetraspan, vagy 8 sevenspan fehérje ill. ezek megfelelelő kombinációi

Plazma membrán mikrodomének: lipid raft caveola

A tetraspan web : TM4-SF fehérjék 34 tetraspan fehérje ismert emlősökben, ebből 33 humán is Képesek konformációs pányvázóként (scaffolding) többféle fehérje szelektív horgonyzására a membrán egy területén. A kapcsolódó fehérjékkel nagyobb, több száz fehérjéből álló hálózatot is tudnak képezni a membránban TM4-SF specifikum: erősen konzervatív szekvencia/motívum (LED) N-glikoziláció (SED) palmitoiláció

Sejtkommunikáció: Komplex fehérje hálózatok-jelátviteli és regulációs rendszerek Modellezés (in silico): Interactome analízisfehérjeszerkezeti, kölcsönhatási (vektoriális) adatbázisok alapján DNS (sejtmag) Sejtfelszínen: in situ biofizikai képalkotó technikákmobilitás és kölcsönhatás mérése (FRET, FRAP, SPT, stb...)

Betegségek sejtszintű jelátviteli, kommunikációs zavarainak felismerése a protein-interactome tanulmányozásával Példa: a szindrómás autism spectrum disorder kulcsfehérjéinek interactome térképe

Hogyan vizsgálhatjuk a membránfehérjék molekuláris szerveződését, a fehérjék asszociációit/csoportosulásait? klasszikus immun-biokémia: pl. immun-koprecipitáció Fluoreszcens immuncitokémia/mikroszkópia: CLSM, SRM - cocapping (sapkásodás) - kolokalizáció (intenzitás kereszt-korreláció és cluster-analízis) Fluoreszcencia Rezonancia Energia Transzfer (FRET): - mikroszkópiás photobleaching FRET (pbfret) vagy - intenzitásmérésen alapuló FRET (RI-FRET) Nagyfeloldású (~nm- ~ x10 nm) optikai (STED,SIM, STORM, PALM), ill. pásztázó szonda- mikroszkópiák: atomi erőmikroszkópia (AFM) ill. közeli mező mikroszkópia (SNOM) sejtfelszíni topográfia

Molekuláris ko-lokalizáció detektálása immuno-koprecipitációval Protein G gyöngy (A)-specifikus mab Overnight, 4 o C Mosás, forralás SDS PAGE puff. centrifugálás B SDS PAGE A A Sejtlizátum, Ag + anti-b mab + HRP-anti Ig + ECL reagens blotting

Hogyan mutatható ki élő sejteken a membránfehérjék in situ molekuláris szintű szerveződése? - homo- és hetero-asszociációik - membrán lipid mikrodoménekhez való viszonyuk

Élő sejtek immunfluoreszcens jelzése Ellenanyag konjugálása fluoreszcens festékkel; sejt jelölése fluoreszcens ellenanyaggal vagy biotin-avidin reakcióval a. NH 2 (-SH) (R: isothiocianát, v. szukcinimid, ill. maleimid) kovalens + R- (pl. FITC, Cy2,3,5,7; APC; RPE; Alexa 488,546,647) (NaHCO 3, ph:8.0) b. Ig Fab Immunoglobulinok (mab) avidin Kd: 10-6 10-8 M biotin (Fab ) 2 M 20-30 perc, jégen M

Konfokális fluoreszcens mikroszkópia (lézer-pásztázás: point scanning X-Y, optikai szeletelés: Z-scan, 200-500 nm, digitális fluoreszcens képalkotás, 3D-rekonstrukció)

Példa: Az IL-2 citokin-receptor lokalizációja és kompartmentalizációja a T sejtek plazmamembránjában. Az IL2-R és a GPI-horgonyzott CD48 raft-asszociált membránfehérje viszonya Immun-koprecipitáció (mindkét irányban) pozitív Jelentős mértékű co-capping figyelhető meg a két fehérjénél green channel: XSF-anti-CD48 red channel: Cy5-anti-CD25 A CD25 (IL-2Rα) és a CD48 kolokalizáltak T sejt-membránban (azonos mikrodoménben vannak)

MOLEKULA-KOLOKALIZÁCIÓ CLSM-el j Pixel: pl. 0.1 x 0.1 μm Két, spektrálisan izolált optikai csatorna: (pl. zöld: x, vörös: y) -kettősen jelölt sejtminta - digitálisan rögzített képek -a kolokalizációt a kereszt-korrelációs koefficiens (CC) értéke alapján kvantitatívan is megítélhetjük egy pl. 512x512 v. 1024x1024 pixeles image-ből. i A Pearson s koefficiens definíciója: CC = Σi Σj (xi,j - <x>) (yi,j - <y>) / Σi Σj (xi,j - <x>) 2 Σi Σj (yi,j - <y>) 2, ahol x i,j ill. y i,j az i és j koordinátákkal jellemzett pixel fluoreszcencia értékei az x (zöld) ill. y (vörös) képen (optikai csatornában). Csak a detektálási küszöb (zaj/háttér) fölötti értékekkel rendelkező pixeleket vesszük figyelembe a summázás során. A CC szélső értékei: CC= 1, két teljesen azonos kép esetén, CC = -1 a kétféle festék (jelölt molekula) teljesen szeparált lokalizációja esetén CC: 0-1 a random eloszlástól eltérő mértékű valós molekuláris kolokalizáció

Fehérje-fehérje, fehérje-lipid kolokalizáció: CLSM képalkotás j b c T sejten GM-1 gangliozidok, FITC-CTX B-vel jelölve (a raftok lipid markere) T sejten IL-2 receptor α (CD25) Cy-3- monoklonális antitesttel jelölve Overlay (pixel-helyes) A + B image. i Pearson koefficiens: > 0.6! Probléma: nincs molekuláris szintű feloldás! (LF: 200-250 nm)

Ki kihez van közel vagy távol a molekuláris,nanométeres skálán? Az optikai képalkotás feloldási határral rendelkezik (Abbe-korlát) és egy kompromisszum: nem látjuk közvetlenül a molekuláris kölcsönhatást, (d:<10-20 nm) de detektálhatjuk pl. a pixelenkénti Förster-Rezonancia Energia Transzfer (RET) hatásfokának meghatározása alapján

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) A D* A* D* Donor and acceptor far apart - No FRET Donor and acceptor close together - FRET Nem-sugárzó (elektromágneses/rezonancia) energiaátadás egy fluoreszcens (donor) molekuláról egy energia-felvevő (acceptor) molekulának dipól-dipól csatolás útján (Förster, 1958) A dinamikus Förster-típusú energiaátadás erősen távolság függő, a sebességi állandó (valószínűség) ~ 1/R 6 Hatékony módszer az intra-és intermolekuláris távolságok (molekuláris konformációváltozások, asszociációk) vizsgálatában

Példa: az Akceptor photobleaching mérése

Nagyfeloldású, nem diffrakció-korlátozott pásztázó szonda-mikroszkópiák : 1.) Atomic Force Microscopy /AFM/ - Transzmissziós Elektron mikroszkópiával és immunogold jelzéssel kombinálva 2.) Scanning Near Field Microscopy /SNOM/ *Feloldás: igen jó, elvben a szonda mérete határozza meg: ~ 5-50 nm z irányban, 50-100 nm x-y irányban **Hátrány: a mintaelőkészítés (beágyazás, fixálás, dehidratálás, stb.) erősen befolyásolhatja a natív struktúrát!

Atomi erő mikroszkópia (AFM) működési elve (G. Binnig 1996 Nobel díj) - pn/nn erőállandójú rugó (kar) - pásztázó hegy (tip:sin3 kristály) mérete (alakja) határozza meg a feloldási határt (elvben néhány Angstrom z irányban). - piezo-vezérelt vonal-pásztázás - lézerfény visszaverődés kvadráns diódával történő detektálása: pozíciójelzés

Immuno-gold jelzés arany-gyöngy átmérő: 5-50 nm (5 nm-ként elérhető) gold R anti-fc mab-al fedett aranygyöngy primer antitest sejt

MHC-I glikoproteinek sejtfelszíni eloszlása (clusterei) AFM: immunogold jelölést követően humán T limfóma sejteken

MHC-I és MHC-II molekulák hetero-asszociációja APC-n, szekvenciális immunogold jelölést (2 féle méretű gold bead) követően, TEM és AFM pásztázó mikroszkópiákkal detektálva TEM image AFM image

A TEM és AFM image fehérjeeloszlásának cluster-analízise random eloszlás: Poisson eloszlás (üres karika) immunogold szám (gyakoriság) mátrix elemenként a mintában (fekete karika) -függvényillesztés A jelölt fehérje (MHC-II) Klaszteresedést mutat B limfómák felszínén (n obs > n elm ) Proc Nat Acad Sci USA,1997