Galanin és M15, M35 és C7 analógjai, valamint a somatostatin immunoneutralizáció hatása a gyomor-bélrendszerre emberben és állatkísérletben Doktori tézisek Dr. Kisfalvi István Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Budapest, 2006.
Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Szám: 082/2002 Galanin és M15, M35 és C7 analógjai, valamint a somatostatin immunoneutralizáció hatása a gyomor-bélrendszerre emberben és állatkísérletben Dr. Kisfalvi István Ph.D. értekezés Programvezető: Prof. Dr. Tulassay Zsolt egyetemi tanár Témavezető: Prof. Dr. Varga Gábor egyetemi tanár Hivatalos bírálók: Prof. Dr. Mózsik Gyula egyetemi tanár Dr. Herszényi László egyetemi adjunktus Szigorlati bizottság: Prof. Dr. Regöly-Mérei János egyetemi tanár Prof. Dr. Banai János egyetemi tanár Prof. Dr. Takács Tamás egyetemi tanár Budapest, 2006.
Bevezetés A gastrointestinalis traktusban az emésztő, szekréciós, motilitási és kiválasztási folyamatok szabályozása igen komplex, ezeket neuropeptidek, a centrális idegrendszer és enterikus idegek együttesen regulálják. A jelenleg ismert gastrointestinalis neuropeptidek száma 50 felett van, ezek között szerepel a somatostatin és az egyik legújabban felfedezett peptid, a galanin. Modern immunológiai és enzimológiai eljárások lehetővé teszik, hogy megismerjük és feltérképezzük a neuropeptidek elhelyezkedését, fiziológiás és patofiziológiás hatásait in vivo és in vitro körülmények között emberben és állatokban egyaránt. Szelektív receptor antagonisták és specifikus antitestek előállítása lehetővé tette, hogy megértsük az endogén regulátorok szerepét a fiziológiás és kóroki folyamatokban. Tanulmányaim során ezen modern technikák segítségével vizsgáltam két neuropeptid, a galanin és a somatostatin fiziológiás hatását a gyomorsav elválasztásra és az exokrin pancreas enzimszekréciójára. Elsőként írtam le a galanin jelenlétét és motilitásra kifejtett hatását emberi vékonybélben. A galanin 29 aminosavból álló neuropeptid, amelyet eredetileg sertés vékonybélből izoláltak és később az agyban és a gastrointestinalis traktus több részében is kimutattak. A galanin a biológiai hatások széles skálájával rendelkezik mind a központi idegrendszerben, mind a gastrointestinalis traktusban. Amíg azonban a központi idegrendszeri hatásait sokan és részletesen jellemezték, a gastrointestinalis hatásairól rendelkezésre álló információink szűkebb körűek és ellentmondásosak. A galanin központi idegrendszeri hatásai közül kiemelt jelentőségűnek tűnik a fájdalom, táplálékfelvétel, memória, kogníciós funkciók szabályozásában, illetve az Altzheimer-kór és az öregedéssel járó elváltozások létrejöttében játszott szerepe. Ezen okok miatt intenzív kutatás indult 1
antagonisták kifejlesztésére. A leghatásosabb antagonistáknak a peptid szerkezetű analógok bizonyultak, melyek közül a három legfontosabb az M15, M35 és C7. Tanulmányaimban lehetőségem volt ezen három analóg hatását vizsgálni a gastrointestinalis rendszerben és elsőként jellemezni emésztőszervi hatásaikat. Ezek az analógok továbbá abban is segítséget nyújtottak, hogy a gastrointestinalis rendszerben jelenlévő galanin receptorokról ismereteket szerezzünk. Célkitűzések A galanin és analógjainak hatását több gastrointestinalis funkcióban is megvizsgáltam: Galanin, M15, M35 és C7 hatását a gyomorsav szekrécióra éber patkányban Galanin, M35 és C7 hatását a pancreasenzim szekrécióra éber patkányban Galanin, M15, M35 és C7 hatását a gyomorürülés sebességére éber patkányban Galanin, M15, és M35 hatását patkányból kivett jejunum izomkontrakcióira in vitro körülmények között Galanin, M15 és M35 hatását izolált emberi jejunum simaizom kontrakciókra Specifikus antitest segítségével feltérképeztük a galanin immunreaktív rostok jelenlétét az emberi jejunum szöveteiben Specifikus monoclonalis antitest segítségével létrehozott somatostatin immunoneutralizáció során vizsgáltam az endogén keringő somatostatin szerepét a bazális és stimulált gyomorsav és pancreasenzim szekrécióra in vivo, altatott patkányban. Az értekezéshez közvetlenül nem kapcsolódó saját publikációk 1. Blazsek K, Offenmüller B, Burghardt B, Kisfalvi I, Birki K, Wenczl M, Varga G, Zelles T. Content compensation possibility of epidermal growth factor of saliva in rat. Inflammopharmacology, 1996, 4:279-295. 2. Blazsek J, Offenmüller K, Burghardt B, Kisfalvi I, Birki K, Wenczl M, Varga G., Zelles T. Content compensation possibility of epidermal growth factor of saliva in rat. In: Biochemical pharmacology as an approach to gastrointestinal disorders. Gaginella TS, Cowerlars (eds), Kluwer Academic Publ. (Dordrecht), pp. 7-23, 1997, Könyvfejezet. 3. Marton I, Kisfalvi I: Az oszteoporózis hormonpótló és SERM kezelésének onkológiai vonatkozásai MOTESZ Magazin, 2002/4: 25-31 2 11
Eredmények 4. Varga G, Bálint A, Kisfalvi I, Máté M, Ihász M. Vizi ES. Effect of galanin and its analogues M15 and M35 on human jejunal muscle contractions. Gastroenterology, 1996, 110. A1129. mpakt faktor: 8,203 5. Varga G, Fehér E, Kisfalvi I, Bálint A, Máté M, Ihász M, Vizi ES. Functional and immunocytochemical evidence that galanin is a physiological regulator of human jejunal motility. Regul Peptides, 1996, 64:196. mpakt faktor: 1,288 6. Varga G, Kisfalvi I, Wong H, Walsh JH, Solomon TE. Immunoneutralization of somatostatin stimulates basal gastric acid but not basal pancreatic enzyme secretion in anesthetized rats. 4 th Congress of the international Brain-Gut Society, Pécs. Dig. Dis 1996. Impakt faktor: 1,739 7. Kisfalvi I, Burghardt B, Bálint A, Vizi ES, Varga G. Antisecretory effects of galanin and its putative antagosits M15, M35 and C7 in the rat stomach. Dig. Dis Sci. 1998,3:2345 Impakt faktor: 8. Kisfalvi I, Bálint A, Máté M, Vizi ES, Varga G. Effects of galanin antagonists M15, M35 and C7 on exocrine pancreas and jejunal muscle. 2 nd European Congress of Pharmacol, Budapest, July 3-7. 1999. Fundamental and Clin Pharmacol. 1999, 13 (Suppl 1):307S. Impakt faktor: A galanin dózis-függően és reverzibilisen gátolta a pentagastrin által stimulált gyomorsav szekréciót in vivo, éber patkányban. Az M15, M35 és C7 nem gátolta a galanin hatását, sőt ezek a galanin agonistájaként hatottak. A galanin dózis-függő és reverzibilis módon gátolta a CCK- 8 által stimulált pancreas amilázszekréciót patkányban. Az M35 és C7 analógok agonista hatást fejtettek ki az amilázszekrécióban is, hasonlóan a gyomorsav termelődésnél megfigyeltekhez. Kísérleteinkkel igazoltuk, hogy a galanin analógok ugyanazokon a receptorokon keresztül fejtik ki szekréciót gátló hatásukat, mint a galanin és ezek a receptorok különböznek a központi idegrendszerben leírt galanin receptoroktól, ahol az analógok kompetitív antagonistaként hatnak. Sem a galanin, sem analógjai nem befolyásolták a folyékony tesztétel kiürülését a gyomorból azt jelezve, hogy a galanin nem játszik szerepet a gyomorürülés szabályozásában éber patkányban. A galanin koncentráció-függő módon stimulálta az izolált jejunalis simaizom kontrakcióját patkányban és hatékonysága az acetilkolinéval megegyező volt. M15 és M35 analógok nem gátolták a galanin simaizom kontrakciós hatását, inkább gyenge agonistaként viselkedtek. Emberből származó izolált jejunalis izomcsíkok kontrakcióját is koncentráció-függően fokozta mind a galanin, mind analógjai. A galanin kontrakciót indukáló hatása azonos erősségű volt az acetilkolinéval, ami azt sugallja, hogy a galanin valószínűleg fontos fiziológiás szerepet tölt be a vékonybél motilitás szabályozásában. Az analógok agonista hatása pedig arra utal, hogy a 10 3
jejunumban levő, motilitást mediáló galanin receptorok is különböznek a központi idegrendszerben leírt receptoroktól. A galanin kontrakciót stimuláló hatását nem gátolta sem kolinerg blokád, sem tetrodotoxin, ami azt jelzi, hogy a galanin közvetlenül is hat a jejunalis simaizomsejtekre. Immunhisztokémiai vizsgálatokkal elsőként mutattuk ki galanin immunreaktív idegrostok jelenlétét emberi vékonybélben. Ezek az idegrostok és hálózatok nagy számban vannak jelen a jejunum minden rétegében, legnagyobb sűrűségben a belső körkörös izomrétegben, ahol nagyon közel és párhuzamosan futnak a szomszédos simaizomsejtekkel. Monoclonalis antitesttel létrehozott somatostatin immunoneutralizáció dózis-függő módon, jelentősen fokozta altatott patkányban a bazális gyomorsav szekréciót és ez a hatás független volt az altató minőségétől (uretán és barbiturát). A gyomorsav szekrécióval ellentétben a somatostatin immunoneutralizáció nem befolyásolta a bazális pancreas amilázelválasztást, a CCK-8-al stimulált pancreas szekréciót azonban jelentősen fokozta. 5. Bálint A, Fehér E, Kisfalvi I, Máté M, Zelles T, Vizi ES, Varga G. Functional and immunocytochemical evidence that galanin is a physiological regulator of human jejunal motility. J Physiol (Paris), 2001, 95:129-135. Impakt faktor: 0,862 Az értekezéshez közvetlenül kapcsolódó idézhető absztraktok 1. Kisfalvi I, Bártfai T, Langel Ü, Vizi ES, Varga G. Effect of galanin antagonists M35 and C7 on galaninmodulated exocrine pancreatic and gastric acid secretion, and jejunal muscle contractions: evidence for receptor subtypes. Digestion, 1994, 55:309. Impakt faktor: 1,014 2. Kisfalvi I, Bártfai T, Langel Ü, Vizi ES, Varga G. Effect of galanin antagonists M15, M35 and C7 on exocrine pancreatic secretion and jejunal muscle contractions. Z Gastroenterol, 1995, 33:295 Impakt faktor: 0,632 3. Kisfalvi I, Bártfai T, Langel Ü, Vizi ES, Varga G. Actions of galanin and its antagonists M15, M35 and C7 on exocrine pancreatic secretion and jejunal muscle contractions. Gut, 1995, 37 (S2):A220. Impakt faktor: 3,023 4 9
Az értekezéshez közvetlenül kapcsolódó saját publikációk 1. Scarpignato C, Kisfalvi I, D`Amato M, Varga G. Effect of dexloxiglumide and spiroglumide, two new CCKreceptor antagonists, on gastric emptying and secretion in the rat: evaluation of their receptor selectivity in vivo. Aliment Pharmacol Ther. 1996, 10:411-419. Impakt faktor: 3.094 2 Varga G, Kisfalvi I, Kordás K, Wong H, Walsh JH, Solomon TE. Effect of somatostatin immunoneutralization on gastric acid and pancreatic enzyme secretion in anesthetized rats. J Physiol (Paris), 1997, 91:223-227. Impakt faktor: 0,707 3. Kisfalvi I, Burghardt B, Bálint A, Zelles T, Vizi ES, Varga G. Antisecretory effects of galanin and its putative antagonists M15, M35 and C7 in the rat stomach. J Physiol (Paris), 2000, 94:37-42. Impakt faktor: 1,339 4. Kisfalvi I, Rácz G, Bálint A, Máté M,. Oláh A, Vizi ES, Varga G. Effect of putative galanin antagonists M35 and C7 on rat exocrine pancreas. J Physiol (Paris), 2001, 95:385-389. Impakt faktor: 0,862 Következtetések A galanin valószínűleg szerepet játszik a gyomorsav és exokrin pancreas szekréció szabályozásában fiziológiás körülmények között. A gastrointestinalis szekréció szabályozásában részt vevő galanin receptorok eltérőek a központi idegrendszerben leírt galanin receptoroktól. A galanin jelentős regulátor a vékonybél motilitás szabályozásában, az acetlikolinnal megegyező erősséggel. Emberi vékonybélben jelentős mennyiségben található galanin immunreatív idegrost, ami arra utal, hogy a galanin emberben is fontos reguláló tényező a vékonybél fiziológiás funkcióinak fenntartásában (a motilitás szabályozásában nagy valószínűséggel részt vesz). A galanin direkt módon, közvetlenül a jejunalis simaizomsejteken is képes kifejteni hatását. A központi idegrendszerben hatásos antagonisták éppen ellenkezőleg, agonista hatást fejtenek ki a gastrointestinalis rendszerben, ami fokozott figyelmet és meggondolást igényel a galanin antagonista farmakológiai szerek jövőbeli alkalmazásánál. Az endogén somatostatin szerepet játszik a bazális gyomorsav szekréció fiziológiás csökkenésében alvás során, de nem vesz részt a csökkent bazális pancreas szekréció létrehozásában. Mindez a bazális gyomorsav és pancreasenzim szekréciót kialakító szabályozó mechanizmusok különbözőségét jelzi. A somatostatin azonban fiziológiás szabályozóként vesz részt a stimulált pancreasenzim szekréció regulálásában. 8 5
Köszönetnyilvánítás Nagyon nagy hálával tartozom Dr. Varga Gábor Professzor Úrnak, aki még medikus koromban tanítványai közé fogadott és bevezetett a kutatás rejtelmeibe, nagyon köszönöm a támogatását, odaadó segítségét. Professzor Úr nélkül e dolgozat nem jöhetett volna létre. Dr. Varga Gábor Professzor Úrtól rengeteget tanultam szakmailag és emberileg. Nagyon szerencsésnek érzem magam, hogy mellette és az ő nemzetközileg elismert, nagyra tartott kutatócsoportjában dolgozhattam. Nagy tisztelettel és hálával mondok köszönetet Prof. Dr. Tulassay Zsolt Akadémikus Úrnak, a Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinika igazgatójának a sok-sok támogatásért, segítségért, amelyet Professzor Úrtól kaptam. Köszönöm, hogy a PhD programjába kerülhettem és ott kutatómunkát végezhettem. Köszönöm korábbi főnökömnek, osztályvezetőmnek Dr. Marton István Professzor Úrnak, hogy nagyon sokat segített a klinikai orvosi munkámban, a klinikai szakma megtanulásában és hogy mindig támogatta és lehetővé tette a kutatómunkám végzését. Professzor Úrtól szakmailag és emberileg sokat tanultam. Nagyon köszönöm, hogy mindvégig bízott bennem és töretlenül támogatott. Köszönöm jelenlegi főnökömnek, osztályvezetőmnek Dr. Vermes Gábor Főorvos Úrnak, hogy mindenben támogatott. Őszintén köszönöm Dr. Vizi E. Szilveszter Professzor Úrnak, a Magyar Tudományos Akadémia elnökének, akadémikusnak, a MTA KOKI volt igazgatójának, hogy a nemzetközileg igen nagyra értékelt kutatóintézetébe befogadott és külsősként is lehetőséget biztosított számomra a kutatómunkám végzéséhez. Szeretnék köszönetet mondani a Kísérleti Orvostudományi Kutató Intézet munkacsoportja tagjainak a támogatásért. Különösen köszönöm Barabás Lilla, Harasztiné Jacsó Márta, Dr. Burghardt Beáta és Rácz Gábor segítségét. Nagyon nagy hálával tartozom Családomnak, Drága Szüleimnek és Testvéremnek, akik meleg, szerető és segítő családi környezetet biztosítottak számomra. Köszönöm Drága Anyukámnak, hogy mindvégig bíztatott, tanácsokat adott és meleg szeretetével halmozott el. Mindig számíthattam önzetlen anyai segítségére. Köszönöm Drága Apukámnak, hogy mindvégig segítségemre volt, hogy szerető támogatására mindig számíthattam. Köszönöm Drága Testvéremnek, hogy jóbanrosszban mindig önzetlen támogató és segítőkész volt hozzám. Neki is köszönöm, hogy összetartó, egymást segítő és szerető család lehettünk. 6 7