Tartalomjegyzék Abszorpciós spektroszkópia (Nyitrai Miklós; 2011 február 1.) Dolgozat: május 3. 18:00-20:00. Egész éves anyag. Korábbi dolgozatok nem számítanak bele. Felmentés 80% felett. A fény; Elektromágneses hullám kölcsönhatása anyaggal; Az abszorpció definíciója; Az abszorpció mérése; Alkalmazások; Speciális problémák, esetek. Emlékeztető Elektromágneses hullámok terjedése Emlékeztető növekvő energia távoli vörös vörös narancs sárga zöld kék ibolya UV 760nm 647nm 586nm 535nm 492nm 422nm 390nm Hogyan függ össze a frekvencia, hullámhossz és energia? A fény transzverzális elektromágneses hullám. Spektroszkópia energia (ev)* hullámhossz (nm) frekvencia (Hz) hullámhossz tart. Fényelnyelés híg oldatokban - transzmittancia -abszorpció *1eV = 1,602 x 10-19 J = 3,83 x 10-20 cal sp.-i módszer 1
Transzmittancia Abszorpció fényforrás anyag detektor T = / Általában százalékban (%) adjuk meg intenzitás Minta (homogén) Exponenciális függvény!!! = exp (-kx) vagy = e -kx Megj.: hasonló a radioaktív bomlás egyenletéhez! N = N 0 exp (-λt) vagy N = N 0 e -λt távolság minta Ez is exponenciális! A cél: Az abszorpció definíciója intenzitás - legyen könnyen érthető - legyen jól mérhető - legyen additív Megj.: a transzmittancia (T=/ ) nem additív: ha az egyik komponens átenged 30%-ot, a másik 60%-ot, akkor a kettő együtt NEM -10%-ot fog átengedni! ln(távolság) 2
A távolságfüggés más formában Miért ε(λ) és nemcsak ε? intenzitás minta távolság = 10 -ε(λ) c x Paraméterek definíciója! Miért ε(λ) és nemcsak ε? abszorpció Az ε értéke λ függő! Az abszorpció definíciója Mi áll a megfigyelések hátterében? A Born-Oppenheimer közelítés: Mag mozgás vs. elektron mozgás. anyag OD = A = - log ( / ) = ε (λ) c x Röv.: optical density = 10 -ε(λ) c x Az energia felbontása Az energia felbontása E összes = E elektron + E vibrációs + E rotációs Az energia típusok nagyságrendje: Az egyes energia típusok megváltozása független. A megváltozás írható mint: ΔE elektron ~ 1,000 * ΔE vibrációs ~ 1,000,000 * ΔE rotációs ΔE összes = ΔE elektron + ΔE vibrációs + ΔE rotációs 3
Emergia séma: sávos spektrum Fotometriai mérések megvalósítása fotometriai = abszorpciós spektroszkópiai Hogyan mérjük az abszorpciót? Egy fotométer egyszerű sémája. fényforrás monokromátor minta detektor Spektrofotométer Fő komponensek: 1. Fényforrás UV fényforrás (~180-350nm): Deutérium lámpa Látható fény forrása (~350-800nm): Wolfram-izzó 2. Monokromátor: egyedi hullámhosszak kiválasztása. 3. Mintatartó: a minta és a referencia behelyezése a fényforrás és a detektor közé (küvetta: kisméretű, fényáteresztő mintatároló egység) 4. fotodetektor: PMT, dióda 5. Egyebek: lencsék, szűrők, rések. Prizma Hogyan működik m a prizma? 4
A törésmutató hullámhosszfüggése A törésmutató hullámhosszfüggése n Monokromatikus fény Fehér fény piros sárga lila λ λ Egy és két-utas fotométerek Miért használunk referencia mintát? A fehérjék abszorpciója A fehérjék abszorpciója A fehérjék abszorpciójának értelmezése 5
abszorpció Miért jó az additivitás? (példa) fluoreszcens próba fehérje Alkalmazás: fehérjekoncentráció meghatározása A mért abszorbció: A Szükség van egy referencia számra (kalibráció): extinkciós koefficiens: ε ε szokásos egységei: M -1 cm -1, vagy (mg/ml) -1 cm -1 Ha A = 0.55 and ε = 1.1 (mg/ml) -1 cm -1 c = (A/ ε) in mg/ml; c = 0.5 mg/ml Példa egy másik alkalmazásra: elektroforézis eredmények kiértékelése A fotométer linearitása; stray light effect S 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 Megfigyelés: Abszorpció Várható tendencia Meredekség: ε Mérési eredmények 0.0 0 5 10 15 20 [mdia3-fh2] (μm) Koncentráció De miért nem mér lineárisan? A probléma forrása: elvileg sem tökéletesek a monokromátorok! Második, harmadik felharmónikusok! 2λ; 3λ Optikai rács A monokromátor működésének alapelve. 6
Tegyük fel, hogy az anyag csak a kiválasztott hullámhosszon nyel el! Nagy abszorbció mellett: Kicsi abszorbció mellett: 99% λ választ és anyag 89% λ választ. és 99% λ választ. és 1% λ felh.. anyag 1% λ választ. és 1% λ felh. 1% λ felh. 1% λ felh. Az átmenő fény összetétele A hatás! Kicsi abszorbció: / = 90 / 100 = 0.9 valódi érték = 89 / 99 ~ 0.9 A mért és a valódi közel azonos! Nagy abszorbció: / = 2 / 100 = 0.02 valódi érték = 1 / 99 ~ 0.01 Az eltérés nagy! Abszorpció Várható tendencia Meredekség: ε Koncentráció A lényeg - az abszorpció jelensége, értelmezése; - az abszorpció definíciója; - az abszorpció mérése; - az abszorpció alkalmazásai. Köszönöm a figyelmet! 7
Derivatív spektroszkópia Mikor és mire jó? A probléma pl. nagy fényszórás a mintában - optikailag sűrű minták - nagyon szóró minták - igen kicsi abszorbció változások Hasznos módszer a biokémiában, gyógyszerkutatásban.stb. abszorbció A látszólagos vagy mért abszorpció A valódi abszorpció A spektrum deriváltja! Emlékeztető! Deriválás: ΔA / Δλ, és Δλ nagyon kicsi, nullához tart: da / dλ abszorbció Δλ ΔA d (abszorbció) / d λ A spektrum (első) deriváltja! Mért spektrum Valódi spektrum A módszer előnyei A lényeg - az abszorpciós csúcsokat könnyebb azonosítani - alkalmas továbbra is koncentráció meghatározásra - az abszorbció definíciója - az abszorbció mérése - az abszorbció alkalmazásai 8