Semmelweis egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola PATHOBIOKÉMIA DOKTORI PROGRAM A Vav2 fehérje szabályozásának vizsgálata az epidermális növekedési faktor jelpályájában Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei TAMÁS PÉTER Témavezeto: Dr. Buday László Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet BUDAPEST 2003
Bevezetés A tirozin kináz aktivitással rendelkezo növekedési faktor receptorok a proliferáció mellett számos más hatást is közvetítenek a sejt ek belseje felé. Aktivációjuk eredményeképpen a sejtek aktin citoszkeletonjának szerkezete átalakul. Az elmúlt években nyilvánvalóvá vált, hogy az aktin hálózat átrendezodéséért elsosorban a Rho családba tartozó kis G fehérjék a felelosek. A család legismertebb tagjai a Rho, a Rac és a Cdc42. A Rho aktivációját követoen a sejtekben kontraktilis aktin - miozin kötegek, ún. stressz rostok jönnek létre. A Rac aktivitás fokozódásának hatására lamellipódiumok és membrán fodrozódások alakulnak ki, a Cdc42 aktivációját pedig filopódiumoknak nevezett vékony tuszeru nyúlványok keletkezése követi a sejtekben. A Rho fehérjék, mint minden G fehérje, GDP kötött formában inaktívak és GTP kötött formában aktívak. A guanin nukleotidok cseréjét szabályzó fehérjék befolyásolják. A guanin nukleotid kicserélodési faktor (GEF) a GDP GTP-re való cseréjét katalizálja, s ezáltal a Rho fehérjék aktív formáját stabilizálja. A GTP-áz aktiváló protein (GAP) és a guanin nukleotid disszociációs inhibítor (GDI) szabályzó fehérjék ezzel szemben a GDP kötött inaktív állapotnak kedveznek. A kísérleteimben egy Rac-ot és Cdc42-t aktiváló kicserélodési faktornak a Vav2-nek a szerepét vizsgáltam az EGF receptor jelpályájában. Az irodalomból ismert, hogy az EGF receptor serkentését követoen a Rac aktiválódik, és a sejtekben lamellipódiumok és membrán fodrozódások jönnek
létre. A Rac aktiváció pontos mechanizmusa azonban ismeretlen, számos párhuzamos jelpálya létezését feltételezik. Több eredmény arra utal, hogy a Vav családba tartozó fehérjéknek szerepe lehet a folyamatban. A családnak jelenleg három tagja ismert. A Vav1 csak hemopoetikus sejtekben fordul elo, és szerepet játszik a T és B sejt receptor közvetítette jelpályákban. A Vav2 azonban minden szomatikus sejtben megtalálható. A Vav2, mint minden Rho kicserélodési faktor, tartalmazza a kicserélodési aktivitásért felelos Dbl homológ domént (DH) és a pleksztrin homológ domént (PH). A PH domén foszfatidilinozitol-3-foszfátokhoz kapcsolódhat, és szerepe lehet a fehérje kicserélodési aktivitásának a szabályozásában. Az adapter fehérjékre jellemzo SH2 és SH3 domének jelenléte a Vav2-ben, a fehérje számos más fehérjével való interakciójára utal. A Vav2 kapcsolódik az aktiválódott EGF receptorhoz, s az EGF receptor tirozinon foszforilálja a fehérjét. Az irodalmi adatok alapján a Vav2 kicserélodési aktivitása a foszforiláció következtében fokozódik. Az aktiváció pontos mechanizmusa azonban nem ismert. Munkámmal ennek tisztázásához szerettem volna hozzájárulni.
Célkituzések A Vav fehérjék szerepérol, muködési mechanizmusáról megjelent eddigi közlemények számos ellentmondást tartalmaznak és további kérdéseket vetnek fel. A munkánk során arra vállalkoztunk, hogy felderítjük a Vav2 szerepét és muködésének mechanizmusát az EGF receptor jelpályájában. Bizonyítani kívántuk, hogy a Vav2 sejten belül SH2 doménje közvetítésével kapcsolódik az aktiválódott EGF recetorhoz. Kíváncsiak voltunk, vajon az asszociációban az EGF receptor mely foszfotirozinjai vesznek részt. Terveinkben szerepelt a Vav2 foszforilációs helyeinek a meghatározása is. Az irodalmi adatok alapján a Vav2 aktivitásának a szabályozásában a tirozin foszforiláció és a PI 3- kináz lipid termékei vehetnek részt. Az eredmények azonban ellentmondásosak. Vizsgálni kívántuk mindkét jelpálya jelentoségét a Vav2 Rac-ot serkento kicserélodési aktivitására. Ismert tény, hogy a Vav2-t túltermelo sejtekben az aktin citoszkeleton átrendezodik. Jellemezni kívántuk a Vav2 overexpresszió hatására létrejövo morfológiai változásokat Cos7 sejtekben. A sejt aktin citoszkeleton változásainak nyomon követése is alapul szolgált a tirozin foszforiláció és a foszfatidilinozitol 3- foszfátok Vav2 aktivitásra gyakorolt hatásainak vizsgálatához.
Felhasznált módszerek DNS konstrukciók A Vav2 cdns-ét pgex bakteriális és GFP emlos expresziós vektorba klónoztam. A Vav2 egyes darabjait polimeráz láncreakció (PCR) segítségével állítottam elo. A Vav2-be illetve egyes darabjaiba célzott pontmutációkat vittem kétlépcsos polimeráz láncreakció segítségével. Az elso PCR egyik primere tartalmazta a kívánt mutációt, a második PCR-ben pedig az elso PCR termékét primerként alkalmaztam. A GST fúziós fehérjéket E. coli baktériumban expresszáltattam, s affinitás kromatográfia segítségével tisztítottam. A GFP konstrukciókkal lipofektaminos eljárás segítségével Cos7 sejteket tranziensen transzfektáltam. In vitro kináz assay EGF-fel kezelt A431 sejtekbol affinitás kromatográfia segítségével aktivált EGF receptort tisztítottam. A Vav2 különbözo mutánsainak in vitro foszforilációját ATP jelenlétében a tisztított EGF receptor hozzáadásával vizsgáltam. A foszforiláció mértékét anti-foszfotirozin Western blot segítségével határoztam meg. Foszfopeptidekkel végzett kompetíciós kísérlet Az EGF receptor ismert autofoszforilációs helyei alapján foszfopeptideket szintetizáltattam, s egy kompetíciós kísérletben vizsgáltam, hogy a Vav2 SH2 doménje az aktiválódott EGF receptor melyik foszfotirozinjához
kapcsolódhat. EGF kezelt sejtek kivonatához a különbözo foszfopeptidek jelenlétében Vav2 SH2 domént adtam, és vizsgáltam, hogy melyik foszfopeptid tudja leszorítani az aktivált EGF receptort a Vav2 SH2 doménjérol. Immunprecipitáció és Western blot A transzfektált sejteket EGF-fel kezeltem. A GFP fúziós fehérjéket anti- GFP ellenanyaggal immunprecipitáltam, majd SDS poliakrilamid gélelektroforézist követoen a fehérjék foszforilációját anti-foszfozirozin Western blot segítségével vizsgáltam. Rac aktivitás mérés A Ra c sejten belüli aktivitását PAK pull-down assay segítségével határoztam meg. A PAK a Rac egyik célfehérjéje. A glutation agaróz gyantához kötött PAK a sejtkivonatból csupán a Rac GTP kötött aktív formáját tudja megkötni. A precipitált Rac mennyiségét, mely bol következtethettem a Rac aktivitására anti-rac Western blot-tal határoztam meg. Immunfluoreszcencia A Vav2-t és különbözo mutánsait GFP fúziós fehérje formájában állítottam elo, ezért lehetoségem nyílt a fehérjék intracelluláris lokalizációjának vizsgálatára fluoreszcens mikroszkóp segítségével. A fixált és permeabilizált sejtekben az aktin polimereket TRITC-falloidinnel tettem láthatóvá. A falloidin gombaméreg specifikusan kötodik az aktin rostokhoz.
Eredmények Az EGF receptor foszforilálja a Vav2 142-es, 159-es és 172-es tirozinjait Az irodalomban található közlemények alapján az aktivált EGF receptor tirozinon foszforilálja a vav2-t. A foszforiláció pontos helye azonban nem ismert. A Vav2-t négy részre osztottam, és in vitro kísérletben vizsgáltam az egyes fragmentumok foszforilációjának mértékét. Megállapítottam, hogy az EGF receptor csupán a Vav2 N terminális doménjét foszforilálja. A Vav2 N terminális doménjében három olyan tirozin található, melyek szubsztrátjai lehetnek az EGF receptornak. Ezeket a tirozinokat sorra fenilalaninra cseréltem, s vizsgáltam a mutánsok tirozin foszforilációját. Az in vitro kísérlet alapján az EGF receptor foszforilálhatja a Vav2 N terminális doménjének mindhárom tirozinját, közülük azonban valószínuleg a 172-es és 159-es tirozin foszforilációja a jelentosebb. Sejten belül is megvizsgáltam a Vav2 EGF függo foszforilációját. A teljes hosszúságú Vav2 tirozin mutánsait Cos7 sejtekben expresszáltam, majd meghatároztam az EGF kezelés hatására létrejövo foszforilációjukat. A mutáns fehérjék foszforilációs mintázata jó összhangban volt az in vitro kísérlettel, s alátámasztotta annak eredményét.
A Vav2 foszforilációjának elofeltétele, hogy a fehérje SH2 doménje közvetítésével kapcsolódjon az EGF receptorhoz Az irodalomból ismert, hogy a Vav2 in vitro körülmények között SH2 doménje közvetítésével kapcsolódik az aktiválódott EGF recetorhoz. Sejten belül azonban ez az asszociáció nem bizonyított. A Vav2 SH2 doménjét pontmutáció segítségével elrontottam. A mutáns fehérjéket Cos7 sejtekben overexpresszáltam. Megállapítottam, hogy EGF kezelés hatására, szemben a vad típusú Vav2-vel, a mutáns fehérjék nem foszforilálódtak tirozinon, és nem koimmunprecipitálódott velük az aktiválódott EGF receptor sem. A kísérlet alapján tehát a Vav2 SH2 doménje közvetítésével kapcsolódik az aktiválódott EGF receptorhoz, s ez az asszociáció az elofeltétele annak, hogy az EGF receptor foszforilálja a fehérjét. Feltevésünket egy másik módon is bizonyítottam. A foszforilációs helyeket tartalmazó N terminális domén foszfo rilációját nem tudtam kimutatni EGF kezelést követoen. A Vav2 N terminális doménjéhez hozzáfuztem az SH2 domént. Az NT-SH2 fúziós fehérje szemben az N terminális doménnel EGF kezelés hatására foszforilálódott, s asszociálódott az EGF receptorral. Az SH2 domén elengedhetetlen szerepét úgy is igazoltam, hogy mutációkat vittem az NT-SH2 doméneket tartalmazó rekombináns fehérjébe. Elvárásainknak megfeleloen a mutánsok nem foszforilálódtak tirozinon, s nem kapcsolódtak az EGF receptorhoz s em.
A Vav2 SH2 doménje az EGF receptor 992-es és 1148- as foszfotirozinjához kapcsolódik A következo kísérletben arra vállalkoztam, hogy meghatározzam, hogy a Vav2 SH2 doménje az aktiválódott EGF receptor melyik froszfotirozinjához kapcsolódik. Az EGF receptor ismert autofoszforilációs helyei alapján foszfopeptideket szintetizáltattam, s vizsgáltam, hogy melyik foszfopeptid tudja leszorítani a Vav2 SH2 doménjérol az aktiválódott EGF receptort. EGF kezelt sejtek kivonatához a különbözo foszfopeptidek jelenlétében glutation agaróz gyantához kötött Vav2 SH2 domént adtam, s megállapítottam, hogy a 992-es és 1148-as foszfotirozinnak megfelelo peptidek 50µM -os koncentrációban leszorították az aktiválódott EGF receptort a Vav2 SH2 doménjérol. A Vav2 SH2 doménje tehát az aktiválódott EGF receptor 992-es és 1148-as foszfotirozinjához kapcsolódhat. A Vav2 tirozin mutánsai aktiválják a Rac-ot A Vav2 és az EGF receptor asszociációjának tisztázása után érdeklodésünk a Vav2 kicserélodési aktivitásának a szabályozása felé fordult. A Vav2 Rac-ot serkento aktivitását sejten belül PAK pull down assay segítségével határoztam meg. A GFP- Vav2 fúziós fehérje GFP részét termelo sejtekben EGF kezeléssel sem tudtam Rac aktivitást kimutatni. Ezzel szemben a GFP- Vav2-t túltermelo sejtekben EGF hatására jelentosen fokozódott a Rac aktivitása. Ismereteink szerint ez
az elso bizonyíték arra, hogy az endogén Rac aktivitását egy extracelluláris stimulus a Vav2 közvetítésével fokozza. Az irodalmi adatok alapján a Vav2 kicserélodési aktivitását a tirozin foszforiláció szabályozza. Ezért megvizsgáltam a különbözo tirozin mutáns Vav2 fehérjék hatását a Rac aktivitására. Meglepetéssel tapasztaltam, hogy az eltéro intenzitással foszforilálódó mutánsok azonos mértékben fokozták a Rac aktivitását. Az alig foszforilálódó 172/159-es kettos mutáns is a vad típusú Vav2-vel azonos mértékben serkentette a Rac aktivitását. A kísérlet alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a tirozin foszforiláció valószínuleg nincs hatással a Vav2 kicserélodési aktivitására. A PH domén szükséges a Vav2 EGF kezelés hatására létrejövo aktiválásához Az irodalomban találhatóak olyan adatok melyek szerint a PI 3- kináz részt vesz a Vav2 kicserélodési aktivitásának a szabályozásában. A PI 3- kináz szerepét az enzim specifikus gátlószerével az LY 29002-vel vizsgáltam. A GFP- Vav2-t túltermelo sejtekhez egy órával az EGF kezelés elott hozzáadtam a gátlószert. Az Ly megakadályozta az EGF kezelés hatására létrejövo Rac aktiválódást. Szerettük volna bizonyítani a PH domén közvetlen szerepét a folyamatban. Ezért pontmutációt vittem a Vav2 PH doménjébe, mely megszüntette annak foszfatidilinozitol 3- foszfát köto képességét. A mutáns fehérjéket termelo sejtekben nem tudtam EGF kezelést követoen Rac aktivitásfokozódást kimutatni. A
kísérlet alapján a Vav2 kicserélodési aktivitását a fehérje PH doménjének és a foszfatidilinozitol 3- foszfátoknak az asszociációja fokozza. Megvizsgáltam az Ly hatását a Vav2 tirozin foszforilációjára. A PI 3- kináz gátlása nem befolyásolta a Vav2 EGF kezelést követo tirozin foszforilációjának mértékét. A PI 3- kináz tehát nem vesz részt a Vav2 tirozin foszforilációjának a szabályozásában. A Vav2 foszforilációs mutánsai, szemben a PH domén mutánssal, a Cos7 sejtekben morfológiai változásokat okoznak Utolsó kísérletsorozatunkban megvizsgáltuk a Vav2-nek és különbözo mutánsainak a hatását a Cos7 sejtek aktin citoszkeletonjának szerkezetére. A GFP- Vav2-t overexpresszáló sejtek plazmamembránt övezo aktin hálózata megvastagodott, és hullámos lefutásúvá vált. A sejtek membrán fodrozódást, a Rac aktiválódás jellegzetes morfológiai képét mutatták. A GFP- Vav2 felhalmozódott a membrán fodrozódások helyén. Az alig foszforilálódó kettos tirozin mutáns overexpressziója a vad típusú Vav2-höz hasonlóan membrán fodrozódást idézett elo a sejtekben. Ezzel szemben a PH mutáns fehérjéket termelo sejtekben nem tudtam a Rac aktiválódás ezen jellegzetes morfológiai képét kimutatni. A különbözo mutáns fehérjék aktin citoszkeletonra kifejtett hatása jól összhangban volt az elozo kísérletben vizsgált Rac aktiváló képességükkel.
Összefoglalás Kísérleteim alapján körvonalazódik a Vav2 aktiválódás mechanizmusa. A Vav2 SH2 doménje közvetítésével kapcsolódik az aktiválódott EGF receptor 992-es és 1148-as foszfotirozinjához. Ez az asszociáció az elofeltétele annak, hogy az EGF receptor tirozinon foszforilálja a fehérjét. A Vav2 N terminális doménjének mindhárom tirozinja szubsztrátja az EGF receptornak. Közülük azonban valószínuleg a 159-es és a 172-es tirozin foszforilációja a jelentosebb. A foszforiláció elképzelésünk szerint nem játszik szerepet a Vav2 kicserélodési aktivitásának a szabályozásában. Úgy gondoljuk, hogy elsodleges funkciója más SH2 domént tartalmazó fehérjék megkötésében rejlik. A PI 3- kináz termékei kapcsolódnak a vav2 PH doménjéhez. Ez az asszociáció azonban nincs hatással a fehérje tirozin foszforilációjára, viszont ezen interakció következtében a Vav2 kicserélodési aktivitása fokozódik, s a Rac aktiválódik. A Rac aktiválódás eredményeképpen a sejtekben membrán fodrozódások alakulnak ki.
EGF EGF Foszfatidil inozitol 3 foszfátok EGF receptor? PI3 kináz P SH2 P P P Tyr Tyr Tyr P DH PH SH2 Vav2 Rac Lamellipódiumok, Membrán fodrozódás
Megjelent közlemények Péter Tamás, Zita Solti, László Buday: Membrane-targeting is critical for the phosphorylation of Vav2 by activated EGF receptor Cell Signal. 2001 Jul, 13(7):475-81 Péter Tamás, Zita Solti, Petra Bauer, András Illés, Szabolcs Sipeki, András Bauer, Anna Faragó, Julian Downward, László Buday: Mechanism of Epidermal Growth Factor Regulation of Vav2, a Guanine Nucleotide Exchange Factor for Rac J. Biol. Chem. Vol. 278, No. 7 February 14 pp. 5163-5171, 2003 Az értekezéshez nem szorosan kapcsolódó közlemény: László Buday, Livius Wunderlich, Péter Tamás: The Nck family of adapter proteins: regulators of actin cytoskeleton Cell signal. 2002 Sep, 14(9):723-31. Review