Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Dr Bélteki Gusztáv Új módszerek a transzgénes egér technológiában Témavezető: Opponensek: Szigorlati Bizottság: Prof. Dr. Falus András Dr Prohászka Zoltán Dr Polgár Beáta Prof. Dr. Schaff Zsuzsa Prof. Dr. Dinnyés András Dr. Tóth Sára Budapest és Cambridge (UK), 2005
Tartalomjegyzék 1 Bevezetés 7 1.1 A transzgénes egér technológia jelentősége a posztgenomikus korban 7 1.2 Az embrionális őssejtek (ES sejtek) szerepe a transzgénes 8 technológiában 1.2.1 Az embrionális őssejtek eredete és jellemzői 8 1.2.2 Az ES sejteken alapuló transzgenezis előnyei az egyéb technikákkal 10 szemben 1.3 Az ES sejtek genetikai módosításának lehetőségei 10 1.3.1 Klasszikus transzgenezis ES sejtek segítségével 11 1.3.2 Gén targeting 11 1.3.2.1 Null mutáció létrehozása egérben: knock-out 12 1.3.2.2 Specifikus genetikai változások létrehozása: knock-in 12 1.4 Nagyléptékű mutagenezis egérben 14 1.4.1 Kémiai mutagenezis egérben 14 1.4.2 Géncsapdázás ( gene trapping ) 15 1.4.3 RNS interferencia 17 1.5 Feltételes (kondicionális) genetikai módosítások egérben 17 1.5.1 A klasszikus knock-out technológia korlátai 17 1.5.2 A helyspecifikus rekombinázok jellemzői 18 1.5.3 A kondicionális módosítás példái 20 1.5.3.1 Kondicionális gén targeting 20 1.5.3.2 Transzgének kondicionális overexpressziója 20 1.5.4 A kondicionális rendszerek korlátai 23 1.5.4.1 Nemkívánatos rekombináz expresszió 23 1.5.4.1.1 Liganddal indukálható Cre rekombinázok 23 1.5.4.1.2 Tetraciklinekkel indukálható transzgénes rendszerek 24 1.5.4.1.3 Egyéb inducibilis rendszerek 24 1.5.4.2 Genomiális integrációra építő stratégiák 26 1.5.4.2.1 A pop-in integráció 26 2
1.5.4.2.2 A rekombináz-mediált kazetta csere (RMCE) 27 1.6 A φc31 integráz rendszer 29 1.6.1 A φc31 integráz jellemzői 29 1.6.2 A φc31 integráz felismerési helyei 30 1.6.3 A φc31 integráz működése heterológ környezetben 30 2 Célkitűzések 32 3 Módszerek 33 3.1 Transzgénes vektorok létrehozása 33 3.1.1 φc31 integráz kísérlet 33 3.1.1.1 Felismerési helyek 33 3.1.1.2 Dokkoló vektorok 33 3.1.1.3 Inszerciós plazmidok 36 3.1.2 Reverz tetraciklin transzaktivátor kísérlet 38 3.1.2.1 Target vektor készítése 38 3.2 Sejtkultúra protokoll 38 3.2.1 ES sejtek tenyésztése, passzálása, tárolása 39 3.2.1.1 ES sejtek tenyésztése 39 3.2.1.2 ES sejtek passzálása 39 3.2.1.3 ES sejtek tárolása 39 3.2.2 ES sejtek genetikai módosítása 41 3.2.2.1 DNS bejuttatása ES sejtekbe 41 3.2.2.2 ES sejtek drogszelekciója és a kolóniák expanziója 42 3.2.3 Genomiális DNS izolálása ES sejtekből 42 3.2.4 ES sejtek előkészítése az embrió aggregációra 43 3.2.5 ES sejtek transzfekciója lipofekcióval 43 3.3 Southern blotting 43 3.4 Polimeráz láncreakció 44 3.5 Embriológiai módszerek 45 3.5.1 ES sejt diploid morula aggregáció 45 3
3.5.2 Pronukleáris mikroinjekció 46 3.5.3 Egérembriók X-gal festése 46 3.5.4. Fluoreszcens detektálás 47 4 Eredmények 48 4.1 φc31 integráz kísérlet 48 4.1.1 Dokkoló helyet tartalmazó ES sejtvonalak létrehozása és molekuláris 48 jellemzése 4.1.2 A φc31 integráz működőképes egér ES sejtekben 49 4.1.2.1 Helyspecifikus integráció a φc31 integrázt expresszáló ES sejtekben 49 4.1.2.2 A rekombináz-mediált kazetta csere (RMCE) echanizmusának elemzése 52 4.1.2.2.1 A helyspecifikus integráció lehetőségei 52 4.1.2.2.2 Az integrációs termékek elemzése 53 4.1.2.3 A rekombinációs helyek molekuláris vizsgálata 57 4.1.3 A φc31 integráz expressziója nem befolyásolja az ES sejtek fejlődési 59 potenciálját 4.1.4 A φc31 integráz használata szelekciót igényel 59 4.1.4.1 Genomiális integráció vizsgálata a zigótában 59 4.1.4.2 Genomiális integráció ES sejtekben nem szelektív körülmények között 61 4.2 Reverz tetraciklin transzaktivátor kísérlet 62 4.2.1 Rosa26-rtTA knock-in ES sejtvonal létrehozása 62 4.2.2 A tetraciklinnel indukálhatóság vizsgálata ES sejtekben 64 4.2.3 Rosa26-rtTA knock-in egér létrehozása 66 4.2.4 A Cre-kondicionalis Rosa26-rtTA egértörzs tesztelése in vivo 67 4.2.4.1 A Rosa26-rtTA egértörzs használatának elvi sémája 67 4.2.4.2 A VEGF-A embrionális konstitutív overexpressziója embrionális 69 letalitást okoz 4.2.4.3 Peliosis hepatis és thymus atrophia a VEGF-A posztnatális 72 overexpressziója esetén 4.2.4.4 A VEGF-A központi idegrendszeri overexpressziója az embrionális életben idegrendszeri vérzések kialakulásához vezet 72 4
4.2.4.5 A VEGF-A overexpressziója a vese podocytáiban nephrosis szindrómát okoz 73 5 Megbeszélés 74 5.1 φc31 integráz projekt 74 5.1.1 A φc31 integráz működése és annak korlátai ES sejtekben 74 5.1.1.1 A helyspecifikus rekombináció lehetséges iránya 74 5.1.1.2 A genomiális integráció mechanizmusáról 76 5.1.1.3 A φc31 integráz mediálta genomiális integráció hatékonysága 77 5.1.1.4 A φc31 integráz lehetséges káros hatásai az ES sejtekre 78 5.1.2 A φc31 integráz rendszer lehetséges alkalmazásai az ES sejt 79 technológiában 5.1.2.1 Géncsapda inszerciók másodlagos módosítása 79 5.1.2.2 Transzgének kiszámítható expressziója jól jellemzett genomiális 81 dokkoló helyeken 5.1.3 A φc31 integráz egyéb alkalmazási területei 81 5.2 Reverz tetraciklin transzaktivátor projekt 84 5.2.1 Az indukálható génexpressziós rendszerek sajátságai 84 5.2.2 A Rosa26-rtTA stratégia alkamazhatóságának elemzése 84 5.2.2.1 A genom manipuláció és az induktor hatása 85 5.2.2.2 Alacsony háttéraktivitás és gyorsan indukálható génexpresszió 85 5.2.2.3 A szövetspecificitás biztosítása 86 5.2.3 A VEGF-A overexpressziójának következményei egérben 87 5.2.4 A Rosa26-rtTA stratégia korlátai és továbbfejlesztési lehetőségei 88 6 Következtetések 90 6.1 φc31 integráz projekt 6.2 Reverz tetraciklin transzaktivátor projekt 91 7 Köszönetnyilvánítás 92 8 Irodalomjegyzék 93 5
9 Saját közlemények jegyzéke 101 10 Összefoglaló 102 11 Summary 103 12 Ábrák és táblázatok jegyzéke 104 13 A dolgozatban használt rövidítések 106 6
1. Bevezetés 1.1 A transzgénes egér technológia jelentősége a posztgenomikus korban A XX. század utolsó és a XXI. század első évtizedének legjelentősebb biológiai felfedezése a genom projektek kidolgozása és megvalósítása. A genom projekt elnevezés élőlények genetikai programjának DNS szekvencia-szintű meghatározását jelenti. Legismertebb a saját fajunk genetikai információját felderítő Humán Genom Projekt (1,2,3), ezzel egy időben folyik azonban kísérleti modellként szolgáló élőlények (pl. Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Mus musculus) és fontos kórokozó organizmusok (pl. Mycobacterium tuberculosis) genom projektje is (4,5,6,7). E munkák eredményeképpen nagy számú új gén válik ismertté becslések szerint az emberi és az egér genomban egyaránt kb. 20000-30000 a fehérjét kódoló gének száma. E gének jelentős részének funkciója ismeretlen (8). A szekvencia-adatbázisok segítségével a DNS-szekvenciából megjósolható a kódolt fehérje aminosav-sorrendje, abból azonban csak általában csak durva becslés tehető a működésre nézve. A korábbiakban két módon lehetett kísérleti betekintést nyerni egy emberi gén működésébe: a kódolt fehérje tulajdonságainak vizsgálatával és a gén mutációja által eredményezett kóros állapot vizsgálatával. Sok fehérje azonban igen nehezen izolálható, és az in vitro funkcionális vizsgálatokkal csak korlátozott információ nyerhető. Az örökletes emberi betegségek csak génjeink kis részét jellemzik működési szempontból. Számos gén nélkülözhetetlen az egyedfejlődés igen korai szakaszában, és működésének kiesése az embrió pusztulását okozza, vagyis beteg egyed nem születik meg. Az is gyakori, hogy a kieső funkciót más gének képesek teljességgel átvenni, és ezért nem jelentkezik kóros fenotípus. A fenti meggondolások teszik szükségessé a transzgénes egerek létrehozását és vizsgálatát a gének funkcionális jellemzése céljából. A gének szerkezete és szerveződése valamint a legtöbb biológiai folyamat (pl. biokémiai reakcióutak, fejlődési mintázatképzés) nagyfokú hasonlóságot mutat emberben és egérben, így az egérmodellen nyert adatok - megfelelő kritikával - emberre is átvihetők. Az egér génjei célzottan vagy random módon megváltoztathatók, s a mutációk következményei kísérletesen vizsgálhatók. Embriológiai vizsgálatok végezhetők az embrionális letalitással járó mutációk funkcionális jellemzésére. Az utóbbi két évtized technológiai haladásának 7
(l. lentebb) eredményeképpen ma már gyakorlatilag bármilyen kívánt genetikai változtatás előidézhető az egér genomjában. Nincs pontos adat arról, hány gén mutációját idézték már elő egérben, de a szám bizonyosan meghaladja a 3000-et (9). 1.2 Az embrionális őssejtek (ES sejtek) szerepe a transzgénes technológiában 1.2.1 Az embrionális őssejtek eredete és jellemzői Az embrionális őssejtek (ES sejtek) pluripotens őssejtek, melyek az embrionális fejlődés korai szakaszában izolálhatók. A blasztula stádiumú embrióban két sejttípus található: a külső sejtréteget képező trophoectoderm és a belül elhelyezkedő embriócsomó (más néven belső sejttömeg). Utóbbi sejteket megfelelő körülmények között in vitro tenyésztve ES sejtvonal hozható létre (10, 11). E sejtek táptalajon sok generáción át fenntarthatók és szaporíthatók, közben genetikai állományuk célzottan megváltoztatható és a megfelelő mutációt hordozó klónok izolálhatók (1A. ábra). Az in vitro manipuláció közben az ES sejtek megőrzik eredeti fejlődési potenciáljukat, és képesek az embrió valamennyi szervévé illetve szövetévé differenciálódni (de nem képesek részt venni a trophoectoderm és a visceralis endoderm képzésében). Amennyiben injekció vagy aggregáció segítségével az ES sejteket egy blasztula stádiumú embrióval hozzuk össze, a születendő egyed kiméra lesz, vagyis szervezete tartalmazni fog az eredeti zigótából és az ES sejtekből származó sejteket egyaránt (1B. ábra). Amennyiben az egyed ivarsejtjei között is található ES sejt eredetűek, akkor azok révén az ES sejt genetikai állománya az utódra átörökíthető; ezt nevezik germinális transzmissziónak. Ily módon a genetikailag megváltoztatott sejtből genetikailag megváltoztatott (transzgénes) élőlény hozható létre (12). 8
1. ábra: ES-sejtek és alkalmazásuk A. ES-sejtek izolálása, módosítása, transzgénes egér létrehozása Blasztula ES-sejt izolálás DNS Transzgénes egér Germinális transzmisszió Drogszelekció Kiméra egér Szubklónok izolálása, expanziója és genetikai jellemzése Kiméra embrió ES-sejt embrió aggregáció B. ES-sejtek és diploid egérembrió aggregációjából származó kiméra 9
1.2.2 Az ES sejteken alapuló transzgenezis előnyei az egyéb technikákkal szemben Transzgénes élőlények létrehozásának alternativ módja az egyed sejtjeinek in vivo genetikai módosítása. Ennek két fő lehetősége a sejtek transzdukciója rekombináns vírusokkal illetve a DNS közvetlen bejuttatása fizikai módszerekkel (pl. mikroinjekcióval). Amennyiben örökölhető genetikai változtatást tervezünk, akkor annak germinális transzmissziója szükséges. Ez csak az ivarsejtek vagy az igen korai stádiumú embriók (optimálisan a zigóta) genetikai állományának megváltoztatásával érhető el. A gyakorlatban leggyakrabban a bejuttatandó DNS szakasz (transzgén) pronukleáris injekcióját végzik a megtermékenyített petesejt pronucleusába. A pronukleáris injekció (és az egyéb technikák) alkalmazhatóságát két tényező korlátozza, melyek az ES sejt technológiával áthidalhatók: 1. A bejuttatott DNS szakasz előre nem megjósolható helyen és példányszámban épül be a sejt saját DNS-ébe. Ez az esetek kb. 5-10 %-ában fenotípusosan megjelenő mutációt okoz. Ennél jelentősebb azonban, hogy a random módon beépült DNS-szakasz a szomszédos endogén génszabályozó elemek pozícióhatása alá kerül, és ilyen módon expressziója nem a kívánt módon alakul. Ahhoz, hogy megbízható transzgén expressziót érjünk, nagyszámú egértörzset kell létrehozni és expressziós szempontból jellemezni. 2. A fenti technikákkal csak a kívülről bevitt DNS-szekvenciák vizsgálatára van mód, a sejt saját génjeit nem lehet célzottan megváltoztatni. 1.3 Az ES sejtek genetikai módosításának lehetőségei Az ES sejtekben (és a belőlük létrehozott transzgénes egerekben) előidézhető genetikai változások fogalmilag két csoportba oszthatók. Az egyik lehetőség külső, idegen DNS-szakaszok beépítése a sejt genomjába. Ezzel az adott DNS-szakasz által előidézett fenotípusbeli változások vizsgálhatók in vitro és in vivo. Szűkebb értelemben e DNS-szakaszokat nevezik transzgéneknek. Tágabb értelemben azonban transzgénes egérnek neveznek minden, mesterségesen megváltoztatott genetikai állományú egértörzset. Közéjük sorolják tehát a másik fő lehetőséget, a saját DNS-állomány célzott megváltoztatását is. 10
1.3.1 Klasszikus transzgenezis ES sejtek segítségével Az ES sejteken alapuló transzgenezis több előnnyel rendelkezik a klasszikus módszerrel, a pronukleáris microinjekcióval szemben. Pozitív drogszelekcióval kiválaszthatók azok a sejtek, melyek felvették és stabilan expresszálják a transzgént. Genetikai módszerekkel (pl. Southern hibridizáció) megállapítható, hány példányban épült be a transzgén a sejt DNS-ébe, kiválaszthatók az egyetlen kópiát tartalmazó sejtvonalak. Amennyiben a transzgénben található egy vizualizálható riportergén (pl. lacz vagy egfp), akkor képet kaphatunk a transzgén expressziójáról differenciálatlan ES sejtekben vagy in vitro valamely szöveti sejttípussá differenciált sejtekben (13, 14). Összességében tehát lehetőségünk van, hogy a különböző random inszerciókat tartalmazó sejtvonalakat előzetesen in vitro jellemezzük, s csupán az igéreteseket vizsgáljuk tovább in vivo transzgénes egér formájában. 1.3.2 Gén targeting Gén targeting -nek nevezzük valamely endogén DNS-szakasz megváltoztatását egy külsőleg bejutatott DNS-molekula segítségével. A módszer alapja a homológ rekombináció jelensége: amennyiben a bejuttatott DNS-szakasz és valamely saját DNSszakasz között megfelelő hosszúságú átfedés van, akkor rekombináció (crossing over) következhet be a két szakasz között. Ennek eredményeként a külső DNS-szakasz a vele homológiát mutató lókuszra beépül, annak mutációját okozva (15). A homológ rekombináció ES sejtekben igen ritka esemény. A sejtek többségének genomjába egyáltalán nem épül be a bejuttatott DNS, és a beépülés a legtöbb esetben random és nem homológ módon történik. Ezért mindenképpen szükséges, hogy pozitív drogszelekcióval ki tudjuk választani a külső DNS-t a genomba beépítő sejtvonalakat, és hogy ezek közül genetikai analízissel azonosítsuk azokat, amelyekben homológ rekombináció zajlott le. 1.3.2.1 Null mutáció létrehozása egérben: knock-out 11
Knock-out -nak nevezik valamely gén megváltoztatását ES sejtekben homológ rekombináció segítségével olyan módon, hogy a gén ne legyen képes működőképes fehérje termelésére. A klasszikussá vált technikát a 2. ábra mutatja be. A rekombináció helyéül a gén olyan szakaszát választják, mely a szekvenciából feltételezett funkció alapján létfontosságúnak tűnik a géntermék működőképessége szempontjából (pl. egy enzim esetében a katalitikus helyet kódoló exon). A két megfelelő hosszúságú (> 1 kb) homológ szakasz ( homológ karok ) egy pozitív szelekciós markert fognak közre; a karokon kívül negatív szelekciós marker helyezkedik el. Pozitív szelekciós markerként használatos a neomycin foszfotranszferáz (neo) és a puromycin aciltranszferáz (puro) génje, a megfelelő antibiotikumok (G418 illetve puromycin) alkalmazásával. Negatív szelekciós marker a herpes vírus timidin kináz génje (tk) és a diphteria toxin A alegysége (DT-A); az előbbi gén expresszáló sejtek gancyclovir hatására elpusztulnak, a DT-A gént kifejező sejtek elpusztulásához nincs szükség drogra (16). Kettős (pozitív-negatív) szelekció alkalmazásával izolálhatók azok a sejtvonalak, amelyeknél mindkét homológ karban 1-1 rekombinációs esemény történt, és ezért a gén karok közötti szakasza a pozitív szelekciós markerre cserélődött. Az előidézett genetikai változás rendszerint a gén működésének kieséséhez vezet (pl. csak jelentősen rövidebb és/vagy instabil mrns termelődik vagy a fehérje létfontosságú doménjei hiányoznak), ez azonban nem minden esetben jósolható meg biztonsággal. Fontos megjegyezni, hogy a beépülő szelekciós marker és annak promotere távoli DNS-szakaszok, így szomszédos gének kifejeződését is befolyásolhatja (17). Megszokott eljárás ezért a szelekciós marker in vitro deléciója a knock-out egér létrehozása előtt. Ez valamely helyspecifikus rekombináz-rendszer alkalmazásával érhető el (l. lentebb). 1.3.2.2 Specifikus genetikai változások létrehozása: knock-in A spontán mutációk csupán kis része okozza a gén működésének teljes kiesését. Hasonlóképpen, egy gén funkciójának tanulmányozásához a null mutáció okozta 12
2. Ábra: Knock-out allél létrehozása homológ rekombinációval Genom DNS Target vektor * neo tk Megváltoztatott gén neo mrns Fehérje 13
fenotípuson kívül egyéb genetikai változások következményét is meg kell vizsgálni. A fenti szakaszban részletezett technika módosításával erre lehetőség van: az így létrehozott alléleket nevezik knock-in -nek. Lehetőség van pl. hypomorph vagy hypermorph allélek létrehozására; adott esetben egy bizonyos pontmutáció is illeszthető a génbe. Olyan genetikai változások is létrehozhatók, melyek spontán nem fordulhatnak elő: a gén kódoló szekvenciája kicsélhető egy másik génével, amelynek expressziója így az eredeti gén szabályozó régióinak irányítása alá kerül. Ha a beépített DNS szakasz egy hisztokémiailag (pl. lacz) vagy fluoreszcenciával (egfp) vizualizálható fehérjét kódol, akkor az eredeti gén expressziója in vivo követhető (18). 1.4 Nagyléptékű mutagenezis egérben A homológ rekombináció segítségével elméletileg bármely gén tetszőlegesen megváltoztatható. A technika azonban általában igen munka- és eszközigényes. Egyrészt általában nagyszámú (több száz) drog-rezisztens sejtvonal közül kell kiválasztani a megfelelő genetikai eltérést hordozókat, másrészt a germinális transzmisszió elérése majd pedig a homozigóta egerek előállítása nagy számú egér keresztezését és genotípusvizsgálatát igényli. Ezért a hagyományos módszerekkel a knock-out technológia nem alkalmazható nagyszámú gén funkcionális szűrővizsgálatára, ami pedig a genom projektek során felszínre kerülő új kódoló szekvenciák elemzéséhez kívánatos lenne. Ennek áthidalása három, egymástól alapvetően eltérő módon lehetséges. 1.4.1 Kémiai mutagenezis egérben Ha hím egerek ivóvízébe erősen mutagén hatású etil-nitrozureát (ENU) teszünk, akkor ivarsejtjeik jelentős része indukált pontmutációkat fog hordozni. Ezen egerek utódaiban a domináns mutációk fenotípusos következményeit már közvetlenül vizsgálhatjuk. További előny, hogy az így létrehozott pontmutációak túlnyomóan nem null mutációk, hasonlóan a spontán fellépő genetikai változásokhoz. A módszer fő hátulütője, hogy a fenotípus alapján nem tudjuk, melyik génben történt a mutáció. Ennek meghatározásához a gén pozicionális klónozására van szükség, mely ugyan a ma rendelkezésre álló nagyfelbontású genetikai és fizikai térképek birtokában jelentősen 14
leegyszerűsödött, de még mindig igen erőforrás-igényes. A másik probléma, hogy közvetlenül csak a domináns mutációk okozta fenotípusok vizsgálhatók; a recesszív mutációk analíziséhez keresztezési sémák végrehajtása szükséges. Jelenleg több nagyléptékű ENU mutagenezis program van folyamatban világszerte (19, 20, 21). Az ENU mutagenezis ES sejtekben is alkalmazható (22). 1.4.2 Géncsapdázás ( gene trapping ) A géncsapdázás inszerciós mutagenezis ES sejtekben, amelynek során a sejtekbe elektroporációval vagy retrovírus fertőzéssel bejuttatott DNS molekula (vektor) random módon épül be a sejt genomjába, mutációt idézve elő abban (23). A beépülő DNS szakasz tartalmaz egy vizualizálható fehérjeterméket kódoló riportergént és pozitív szelekciós markert (l. 3. ábra). A promoterrel nem rendelkező riportergént egy splice akceptor (SA) szekvencia előzi meg. Ha a vektor egy gén intronjába épül be, akkor a génnek az inszerciós helytől 5 irányba eső részéből és a riporterből álló fúziós mrns illetve fúziós fehérje jön létre, melyben a riporter fehérje általában megőrzi aktivitását. A szelekciós marker rendelkezhet saját promoterrel, vagy szintén alá lehet rendelve az endogén gén szabályozó elemeinek; utóbbi esetben csak azok a gének érhetők el mutagenezis céljából, amelyek expressziót mutatnak differenciálatlan ES sejtekben. A géncsapda-vektor beépülésének három lényeges következménye van (24): 1. A szóban forgó gén transzkripciója az inszerciónál általában megszakad, ami az esetek többségében a gén null mutációját eredményezi. 2. A létrejövő fúziós mrns információt hordoz az endogén génről és a riporterről egyaránt, így izolálható, és megfelelő módszerrel a szóban forgó gén egyszerűen azonosítható. 3. A riporter gén expressziója híven tükrözi az endogén gén expresszióját, és az vizualizálható in vitro és in vivo egyaránt. Több nagyléptékű gene trap projekt van folyamatban jelenleg is (25, 26, 27). Ezek során nagyszámú (több ezer) mutáns sejtvonalat állítanak elő. A mutáns egerek létrehozása előtt az inszerciókat jellemzik, és érdekesség szerint rangsorolják. Ez 15
3. Ábra: Géncsapda mutagenezis ES sejtekben Az ábrán látható vektorok random beépülése valamely gén intronjába a gén null mutációját eredményezi. A poliadenilációs jel az mrns szintézisének befejezéséhez vezet, így a további exonok nem íródnak át. A lacz gén termékének hisztokémiai vizsgálatával lehetséges a gén expressziójának követése. A β-geo gént a lacz és neo fúziójával hozták létre. Az A ábrán látható vektorral potenciálisan valamennyi gént vizsgálhatjuk, a B ábrán szereplő vektor csak a differenciálatlan ES sejtekben aktív gének elemzésére alkalmas. (Pr: promoter, SA: splice akceptor, a többi rövidítést l. a szövegben.) A Genom DNS Pr Géncsapda vektor Pr SA-lacZ-pA PGK-neo-pA mrns lacz pa B Genom DNS Pr Géncsapda vektor Pr SA-βgeo-pA mrns βgeo pa 16
történhet az endogén gén szekvenciája alapján, és történhet a sejtvonalak funkcionális jellemzésével (pl. markergén-expresszió változása külső ágensek vagy in vitro differenciálódás hatására). A gene trap vektor módosításaival lehetőség nyílik speciális géncsoportok célzott keresésére is (28, 29). 1.4.3 RNS interferencia (RNAi) Az utóbbi években vált ismertté, hogy a sejtekbe bejuttatott vagy ott termelődő rövid, 20-30 nukleotid hosszúságú kétszálú RNS (rövid interferáló RNS, sirna) specifikusan képes gátolni a vele azonos szekvenciát tartalmazó gén expresszióját. A módszert először C. elegans-ban alkalmazták a génműködés külső befolyásolására (30). A technológia továbbfejlesztése mára lehetővé tette RNS interferencia könyvtárak létrehozását, melyek a vizsgált élőlény összes génjére (vagy azok jelentős hányadára) tartalmaznak sirna-t. E könyvtár felhasználásával C. elegans-ban teljes genom screeneket végeztek, vagyis a genom összes génjét megvizsgálták, hogy a gén inaktiválása képes-e egy bizonyos fenotípusbeli eltéréshez vezetni (31). Tenyésztett emlős sejtekben is végezhetők hasonló screen-ek, amennyiben a keresett fenotípus sejtszinten azonosítható (pl. apoptosis) (32, 33). RNS interferencia alkalmazásával specifikus null mutáció idézhető elő ES sejtekben ( knock-down ) is, mely a rövid RNS-ek stabil expressziója esetén a transzgénes egérben is megfigyelhető (34, 35). Nincs szükség nagy számú ES sejtvonal előzetes genetikai vizsgálatára, és recesszív mutációk esetén is azonnal (keresztezés nélkül) null fenotípust kapunk. E módszer még technológiai fejlesztésre szorul, de potenciálisan lehetővé teheti igen nagy számú gén funkcionális analízisét viszonylag kevés ráfordítással. 1.5 Feltételes (kondicionális) genetikai módosítások egérben 1.5.1 A klasszikus knock-out technológia korlátai Génjeink jelentős hányadára jellemző a pleiotrópia, vagyis a gén terméke a különböző szervekben és szövetekben vagy az egyedfejlődés különböző szakaszaiban egyaránt jelentős feladatot lát el. E gének működése nehezen vizsgálható olyan egyedben, 17
amelynek minden sejtje a gén null mutációját tartalmazza. Ha például egy gén működése elengedhetetlen valamely létfontosságú szerv kifejlődéséhez az embrionális fejlődés során, akkor annak kiesése az egyed méhen belüli elhalásához vezet. A gén működése más szervekben és/vagy az egyedfejlődés későbbi szakaszaiban nem vizsgálható. E gének analíziséhez szomatikus mozaik élőlények előállítása szükséges, amelyekben a gén funkciója izoláltan vizsgálható valamely szövetben. További lehetőségeket nyit meg, ha a gén be- és kikapcsolása időben is szabályozható. E technikákat gyűjtőnéven kondicionális (feltételes) génmódosítási stratégiáknak nevezzük. (36). Alkamazásukat a helyspecifikus rekombinázok használata tette lehetővé. 1.5.2 A helyspecifikus rekombinázok jellemzői A helyspecifikus rekombinázok genetikai átrendeződések katalízisére képes enzimek. Jelenleg két rekombináz használata terjedt el széleskörben ES sejtekben: az E. coli P1 fágjából származó Cre rekombináz (37, 38), és az élesztő (Saccharomyces cerevisae) Flp rekombináza (39, 40). Gazdaszervezetében mindkét rekombináz a genom megkettőződése során játszik fontos szerepet. A genetikai átrendeződés minden esetben a rekombináz két felismerési helye között történik. A Cre rekombináz felismerési helyét loxp helynek, Flp rekombinázét FRT helynek nevezzük. Mindkét felismerési hely 34 bp hosszúságú DNS szakasz, mely palindrom karokból és a közöttük elhelyezkedő magból áll (4A. ábra). A mag aszimmetrikus szekvenciájának iránya határozza meg a felismerési hely orientációját. A rekombináció eredménye a két felismerési hely relatív helyzetétől függően deléció, inszerció, inverzió és transzlokáció egyaránt lehet (4B. ábra és l. 40. hivatkozás). A lehetséges különböző reakcióutak azonban termodinamikai és reakció-kinetikai kontroll alatt állnak. Az intramolekuláris átrendeződések (pl. deléció) általában előnyt élveznek az intermolekulárisokkal (pl. inszerció vagy transzlokáció) szemben, és minél nagyobb a két felismerési hely távolsága, annál kevésbé valószínű az intramolekuláris reakció lezajlása is. Megfelelő szelekciós stratégiák alkalmazásával azonban lehetséges kedvezőtlen reakcióirányok megvalósítása is. (41, 42, 43) 18
4. ábra: A helyspecifikus rekombinázok jellemzői A. loxp és FRT felismerési helyek A nyilak a palindrom karokat jelzik, az aszimmetrikus központi szekvenciát aláhúzással jelöltük. A felismerési hely irányultságáért az utóbbi a felelős. Az FRT felismerési hely nagyobb betűmérettel jelölt timidinje szintén megtöri a szimmetriát. loxp: FRT: ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC B. Helyspecifikus rekombinázokkal létrehozható genetikai átrendeződések Deléció Transzlokáció szelek ció szelek ció Inverzió = loxp or FRT 19
1.5.3 A kondicionális módosítás példái 1.5.3.1 Kondicionális gén targeting A kondicionális gén targeting során az adott gént nem inaktiváljuk az ES sejtekben, hanem az csak a sejtekből létrehozott egér bizonyos szöveteiben történik meg egy helyspecifikus rekombináz segítségével (44). Az ES sejtekben homológ rekombináció segítségével elhelyezzük a gén két intronjában a helyspecifikus rekombináz két felismerési helyét. Ez általában nem befolyásolja a gén működését. Utóbbi épségéhez rendszerint szükséges a homológ rekombináció során beépült szelekciós marker kazetta deléciója, ez ES sejtekben in vitro történik ugyanazon vagy másik helyspecifikus rekombináz segítségével (l. 5A. ábra). Az ilyen módon megváltoztatott ES sejtekből származó egerek általában nem mutatnak fenotípusbeli eltérést. Ha azonban keresztezzük őket egy olyan transzgénes egértörzzsel, melyben a Cre rekombináz expresszióját egy szövetspecifikus promoter irányítja, a mindkét genetikai változást hordozó utódok megfelelő szöveteiben a felismerési helyek között elhelyezkedő létfontosságú szakaszok kivágódnak. Ezzel a gént csupán az adott szövetféleségben inaktiváltuk, és ennek következményei a gén más hatásaitól izoláltan vizsgálhatók (5A. ábra). Az utóbbi években lehetővé vált a génexpresszió időbeli szabályozása is külső ágensekkel (pl. doxiciklin, tamoxifen) indukálható Cre rekombinázok segítségével (45, 46). 1.5.3.2 Transzgének kondicionális expressziója A helyspecifikus rekombinázok segítségével lehetséges a klasszikus transzgének expressziójának térben vagy időben szabályozott bekapcsolása. Ehhez a transzgén és annak ubiquitaer promotere közé egy felismerési helyekkel közrefogott poliadenilációs (pa) jelet kell elhelyezni (5B. ábra). Alapállapotban a transzgénről nem termelődik fehérje, mert az mrns szintézisét a pa szignál megszakítja. Ha azonban az utóbbit a rekombináz szövetspecifikus expressziója eltávolítja, a szóban forgó szövet(ek)ben lehetővé válik a transzgén kifejeződése. Hasonló módon lehetséges molekuláris 20
5. ábra: Kondicionális genetikai változások létrehozása egérben A. Kondicionális knock-out Az ábra részletes magyarázatát l. a szövegben. A szelekciós marker exciziójára in vitro kerül sor Cre-expressziós vektor transzfekciójával, amiben Cre gén kifejeződését az erős CMV promoter irányítja. A csillaggal jelölt, a gén működéséhez nélkülözhetetlen exon deléciója szövetspecifikusan történik in vivo. A nestin promoter az idegszövet progenitor sejtjeiben fejeződik ki, ezért ebben az esetben a gén az idegszövetben inaktiválódik. Más szövetspecifikus promotereket tartalmazó Cre egértörzsekkel a legkülönfélébb szövetekben érhető el a gén működésének kiesése. A háromszög loxp (vagy FRT) felismerési helyet jelöl. Az egyéb rövidítések értelmezését l. a 2. ábrán. Genom DNS * Target vektor * neo tk Megváltoztatott gén * neo Kondicionális allél CMV Cre * Null allél Nestin Cre 21
B. Transzgén szövetspecifikus overexpressziója Az erős és konstitutív CMV promoter jelenléte ellenére alapállapotban a gén által kódolt fehérje nem termelődik, mivel a három példányban jelenlevő poliadenilációs jel (3xpA) leállítja az mrns szintézisét. A nestin gént expresszáló sejtekben Cre rekombináz termelődik, ez eltávolítja a loxp helyekkel közrefogott poliadenilációs jeleket. A géntermék képződése e sejtekben és utódsejtjeikben (a nestin esetében az idegszövetben) megindul. CMV 3xpA Gén pa Szövetspecifikus excizió Nestin Cre CMV Gén pa kapcsoló beépítése is az egér genomjába, mely a rekombináz hatására egyik gén kifejeződésről a másikéra kapcsol át (47). A jelenleg használt kondicionális rendszerek két fő problémáját a nemkívánatos rekombináz-expresszió és a genomiális integrációval kapcsolatos nehézségek jelentik. Ezeket elemezzük az alábbiakban. 1.5.4 A kondicionális transzgénes rendszerek korlátai 22