HercepTest a Dako Autostainer készülékhez

HercepTest a Dako Autostainer készülékhez Kódszám: K5207 19. kiadás Immuncitokémiai festéshez. A készlet 50 teszthez elegendı (100 lemez). (128387-001) P04087HU_01_K520721-2/2015.05 old. 1/51

Tartalom Oldal Felhasználási terület 4 Összefoglaló és magyarázat emlı 5 Háttér 5 Jellemzık 5 Az eljárás elve emlı 5 Reagensek emlı 6 Mellékelt anyagok 6 Szükséges, de nem mellékelt anyagok 7 Tárolás emlı 8 A minta elıkészítése emlı 8 Paraffinba ágyazott metszetek 8 A szövetek kezelése festés elıtt 8 Óvintézkedések emlı 9 HASZNÁLATI UTASÍTÁS emlı 10 A. A reagens elıkészítése 10 A.1 Epitópkinyerı oldat 10 A.2 Mosópuffer 10 A.3 Szubsztrát kromogén oldat (DAB) 10 A.4 Kontrasztfestés 11 A.5 Rögzítıszer 11 B. Festési eljárás az Autostainer készüléken 11 B.1 Megjegyzések az eljárással kapcsolatban 11 B.2 Festési protokoll 13 Minıség-ellenırzés emlı 14 A festés értelmezése emlı 16 Korlátozások emlı 19 Általános korlátozások 19 Termékspecifikus korlátozások 19 Teljesítményjellemzık emlı 20 Háttér 20 Összehasonlító vizsgálatok 20 Összehasonlítás a klinikai vizsgálattal (CTA) 20 Pontosság 21 Megismételhetıség 21 Immunreaktivitás 22 Hibaelhárítás emlı 23 Összefoglaló és magyarázat gyomor 26 Háttér 26 Jellemzık 26 Az eljárás elve gyomor 26 Reagensek gyomor 27 Mellékelt anyagok 27 Szükséges, de nem mellékelt anyagok 28 Tárolás gyomor 28 A minta elıkészítése gyomor 29 Paraffinba ágyazott metszetek 29 A szövetek kezelése festés elıtt 29 Óvintézkedések gyomor 30 HASZNÁLATI UTASÍTÁS gyomor 31 A. A reagens elıkészítése 31 A.1 Epitópkinyerı oldat 31 A.2 Mosópuffer 31 A.3 Szubsztrát kromogén oldat (DAB) 32 A.4 Kontrasztfestés 32 A.5 Rögzítıszer 32 (128387-001) P04087HU_01_K520721-2/2015.05 old. 2/51

B. Festési eljárás az Autostainer készüléken 32 B.1 Megjegyzések az eljárással kapcsolatban 32 B.2 Festési protokoll 33 Minıség-ellenırzés gyomor 34 A festés értelmezése gyomor 37 Korlátozások gyomor 40 Általános korlátozások 40 Termékspecifikus korlátozások 41 Teljesítményjellemzık gyomor 41 Háttér 41 Megismételhetıség 43 Immunreaktivitás 43 Hibaelhárítás gyomor 46 Irodalomjegyzék 49 Jelmagyarázat 51 (128387-001) P04087HU_01_K520721-2/2015.05 old. 3/51

Felhasználási terület In vitro diagnosztikai alkalmazásra szolgál. A HercepTest szemikvantitatív immuncitokémiai assay, amely a HER2 fehérje túlzott mértékő expressziójának a kimutatására szolgál a szövettani értékeléshez rutinszerően feldolgozott emlırák-szövetekben, valamint gyomor adenokarcinómában beleértve a gyomor-nyelıcsı határon lévı adenokarcinómákat szenvedı páciensekbıl származó, formalinnal fixált, paraffinba ágyazott rákszövetben. A HercepTest javallott felhasználási területe olyan betegek vizsgálata, akiknél Herceptin (trastuzumab) kezelés jöhet szóba (lásd a Herceptin tájékoztatóját). MEGJEGYZÉS kizárólag az emlırák esetében: A Herceptin klinikai vizsgálatokban részt vevı alanyokat kísérleti immuncitokémiai klinikai vizsgálat (CTA) alapján választottuk ki. A vizsgálatokban részt vett alanyok egyikét sem a HercepTest alapján választottuk ki. A HercepTest és a CTA összehasonlítása független mintán történt, és elfogadhatóan egyezı eredményeket mutatott ki. A HercepTest és a Herceptin klinikai eredményének tényleges korrelációját nem állapítottuk meg. MEGJEGYZÉS kizárólag gyomorrák esetében: A Hoffmann-La Roche cég által szponzorált III. fázisú BO18255 (ToGA) tanulmányban részt vevı betegek mindegyikét a Dako HercepTest (IHC) és a Dako HER2 FISH pharmdx Kit (FISH) készletek használatával választották ki. Az inoperábilis, lokálisan elırehaladott, kiújuló és/vagy áttétes gyomoradenokarcinómában vagy gyomor-nyelıcsı határon lévı adenokarcinómában szenvedı betegek HER2-státuszának felmérésére szolgáló mindkét teszt klinikai használhatóságát kimutatta a vizsgálat. Jelen készletben a K5207-es kódszámú reagens mennyiségét kifejezetten az Autostainer készüléknek megfelelıen állítottuk be. Ebben a dokumentumban gyomorrákként szerepel a gyomor adenokarcinómája, beleértve a gyomor-nyelıcsı adenokarcinómáját is. Kérjük, az emlırák esetében történı alkalmazással kapcsolatban tájékozódjon az 5 25. oldalról. Kérjük, a gyomorrák esetében történı alkalmazással kapcsolatban tájékozódjon a 26 48. oldalról. Fontos: Kérjük, hogy különösen a megfestett szövetmetszetek értékelésekor vegye figyelembe az emlırák és a gyomorrák szövetei közti különbségeket. (128387-001) P04087HU_01_K520721-2/2015.05 old. 4/51

Összefoglaló és magyarázat emlı Háttér Emlırák A humán HER2 gén (más néven ERBB2 vagy NEU) kódolja a gyakran HER2 fehérjének vagy p185 HER2 -nek nevezett fehérjét. A HER2 fehérje egy membránreceptor tirozin-kináz, amely homológ az epidermális növekedésifaktor-receptorral (EGFR vagy HER1) (1 8). A HER2 fehérje normális komponens, amely többféle epiteliális sejttípusban is expresszálódik (8). Az emlırákos betegek egy kis hányadánál a HER2 fehérje expressziója emelkedett a malignus transzformáció és a tumorfejlıdési folyamat következtében (9). A HER2 fehérje emelkedett expressziója az emlırákos sejtek felszínén adta az ötletet, hogy terápiás antitest célpontja legyen. A Herceptin (trastuzumab) humanizált monoklonális antitest (10), amely nagy affinitással kötıdik a HER2 fehérjéhez, és kimutatottan gátolja a HER2 fehérjét emelkedetten expresszáló humán tumorsejtek proliferációját in vitro és in vivo (11 13). Jellemzık A HercepTest a Herceptin klinikai vizsgálataiban alkalmazott kísérleti immunocitokémiai klinikai vizsgálat alternatívájaként lett kifejlesztve. A HercepTest eredményességét a HER2 fehérje emelkedett expressziójának meghatározásában független vizsgálattal értékeltük, összehasonlítva a HercepTest és a CTA eredményeit 548 emlıtumor-minta esetében, amelyek egyike sem a Herceptin klinikai vizsgálataiban részt vett alanytól származott. Az eredmények e szövetmintákon 79%-os megfelelést mutattak a két vizsgálat esetében. A koncordanciadatok azt is jelzik, hogy a HercepTest egy 3+ eredménye nagy valószínőséggel megfelel a CTA egy pozitív eredményének, amely teljesítette volna a vizsgálatba történı felvétel követelményeit (2+ vagy 3+). A HercepTest egy 2+ eredménye már nem korrelál olyan jól a CTA eredményeivel. A HercepTest 2+ eredményeinek körülbelül 42%-a (53/126) negatív volt a CTA szerint (0 1+), ami nem tette volna lehetıvé a felvételt a Herceptin klinikai vizsgálatába. A HercepTest a HER2 fehérje emelkedett expressziójára nézve lehet negatív (0 és 1+ festési intenzitás), enyhén pozitív (2+ festési intenzitás), illetve erısen pozitív (3+ festési intenzitás). A HercepTest nem arra készült, hogy diagnosztikai információt adjon a páciens vagy az orvos számára, és ilyen célra nem is lett bevizsgálva. Az eljárás elve emlı A HercepTest a rutinszerően feldolgozott, paraffinba ágyazott minták teljes kétlépéses immuncitokémiai festési eljárásához szükséges reagenseket tartalmazza. A humán HER2 fehérjével szembeni primer, nyúl eredető antitestekkel végzett inkubálást követıen a készlet a dextrán technológiára alapuló, azonnal felhasználható megjelenítı-reagenst alkalmazza. A reagens közös dextrán polimer alapra kapcsolt másodlagos, kecske eredető, nyúlellenes immunglobulin-molekulákból és torma-peroxidáz molekulákból áll, így kiküszöbölhetı a kapcsolt ellenanyag és a peroxidáz-konjugált ellenanyag egymást követı alkalmazása. A Megjelenítı reagens humán immunglobulinokkal és magzati borjú szérummal való keresztreakcióját szilárdfázisú abszorpcióval távolítjuk el. Az ezután hozzáadott kromogén enzimatikus átalakulása látható reakcióterméket eredményez az antigén helyén. A minta ezután kontrasztfesthetı és fedılemezzel ellátható. Az eredmények fénymikroszkóppal értelmezhetık. A festési menetek validálásához három darab, formalinban fixált, paraffinba ágyazott humán emlırák-sejtvonalat tartalmazó, 0, 1+ és 3+ festési intenzitású kontrollmintát mellékelünk. E sejtvonalak festési intenzitása korrelál a receptorok sejtenkénti számával. A HercepTest, Kódszám: K5207, felhasználható az Autostainer berendezésekkel végzett automatikus festéshez. (128387-001) P04087HU_01_K520721-2/2015.05 old. 5/51

Reagensek emlı Mellékelt anyagok Emlırák Az alább felsorolt anyagok 50 teszt elvégzésére elegendı (50 minta a HER2 fehérje primer antitestével inkubálva, illetve 50 minta a megfelelı negatív kontroll reagenssel inkubálva). A tesztek számát a következı anyagokból szövetmetszetenként (22 mm x 22 mm) 200 µl felhasználásával számítottuk: 1, 2, 3 és 4 jelő ampullák és szubsztrát kromogén oldat (DAB). A észlet legfeljebb 15 különálló festési menethez elegendı anyagot tartalmaz. Ampulla száma Mennyiség 1 2 x 11 ml 2 1 x 12 ml 3 2 x 11 ml 4 1 x 12 ml 5 15 x 11 ml 6 3 x 3 ml 7 3 x 500 ml 8 2 x 1 L Leírás Peroxidáz-blokkoló reagens: 3% hidrogén-peroxidban 15 mmol/l nátrium-azid (NaN 3 ). Nyúl anti-humán HER2 fehérje: Használatra kész, affinitás alapján tisztított antitest. Kiszerelés: 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2; stabilizáló fehérjét tartalmaz. Immunogén: A HER2 fehérje szintetikus C-terminálszakasza (intracitoplazmás rész) KLH-hoz (keyhole limpet hemocianin) kapcsolva. Specificitás: HER2 fehérje. Tisztításai módszer: Az antitest affinitás alapján tisztított immobilizált HER2 fehérje peptid felhasználásával. Megjelenítı reagens: Torma-peroxidázzal és affinitás alapján tisztított kecske eredető nyúlellenes immunoglobulinnal konjugált dextrán polimer. Tris/HCl pufferben, stabilizáló fehérjével és mikrobaölı szerrel kiszerelve. Negatív kontrollreagens: Normál nyúl szérum immunglobulin frakciója a HER2 fehérje antitestének megfelelı fehérjekoncentrációban. Kiszerelés: 0,05 mol/l Tris/HCl, 0,1 mol/l NaCl, 15 mmol/l NaN 3, ph 7,2; stabilizáló fehérjét tartalmaz. DAB puffer-szubsztrát: Szubsztrát pufferoldat, ph 7,5; <0,1% hidrogén-peroxidot, stabilizátort, stimulálót és mikrobaölı szert tartalmaz. DAB kromogén: 5%-os 3,3 -diaminobenzidin tetrahidroklorid kromogén oldat. Epitópkinyerı oldat (Containing Detergent) (10x): 0,1 mol/l-es citrátpuffer detergenssel. Mosó puffer (10x): Tris/HCl puffer tisztítószerrel és mikrobaölı szerrel. (128387-001) P04087HU_01_K520721-2/2015.05 old. 6/51

3 x 5 lemez Emlırák Kontroll lemezek: Minden lemezen három formalinban fixált, paraffinba ágyazott metszet a HER2 fehérje expressziójának eltérı szintjeit mutató emlıkarcinóma sejtvonalakkal: MDA-231 (0), MDA-175 (1+) és SK-BR-3 (3+). A kontroll lemezek hıkezeltek, így a metszetek jobban tapadnak az üveghez. A metszetek jobb tapadását célzó további hıkezelés ronthatja a megfestıdést. MEGJEGYZÉS: Minden reagenst, epitópkinyerı oldatot és mosópuffert kifejezetten e teszt céljára készítettünk. A teszt megadott jellemzıinek elérése érdekében ne helyettesítse az anyagokat. Mosópuffernek azonban a Dako S3006-os kódszámú terméke is használható. Szükséges, de nem mellékelt anyagok Ammónium-hidroxid, 15 mol/l 37 mmol/l-re hígítva Kontrasztfestés: Hematoxilin, például vízalapú Mayer's Hematoxylin, Dako Kódszám: S3301 (lásd: HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ, A.4) Fedılemezek Desztillált vagy ionmentesített víz (mosóvíz) Szárító kemence, 60 C vagy alacsonyabb hımérséklet fenntartására alkalmas Etanol, abszolút és 95%-os Fénymikroszkóp (4 40x optikai nagyítás) Rögzítıszer, például a Dako Faramount, Kódszám: S3025, vagy Glycergel, Kódszám: C0563 Pozitív és negatív szövetek a folyamatok ellenırzéséhez (lásd a Minıség-ellenırzés címő részt) Tárgylemezek, SuperFrost Plus, poly-l-lysine bevonatú lemezek, vagy Dako Silanized Slides, Kódszám: S3003 (lásd A minta elıkészítése címő részt) Festıedények vagy fürdık Stopperóra (2 40 perces idıközök mérésére alkalmas) Vízfürdı fedéllel (az Epitópkinyerı oldatot 95 99 C-on képes tartani) Xilén, toluén vagy xilént helyettesítı anyag A K5207 az Autostainer Immunostaining System, Kódszám: S3400, rendszerrel való használathoz lett kialakítva. Az Autostainer szükséges komponenseit lásd az Autostainer felhasználói útmutatójában. (128387-001) P04087HU_01_K520721-2/2015.05 old. 7/51

Emlırák Tárolás emlı 2 8 C között tárolandó. A csomagoláson feltüntetett lejárati dátumon túl ne használja fel a készletet. Ha a reagenseket a jelen tájékoztatóban leírtaktól eltérı feltételek között tárolják, akkor a felhasználónak ellenıriznie kell a feltételeket (14a, 14b). Felhívjuk a figyelmét arra, hogy a kontroll-lemezeket is 2 8 C-on kell tárolni. A termék instabilitásának semmilyen nyilvánvaló jele nincs. Ezért a beteg mintáival párhuzamosan pozitív és negatív kontrollokat kell futtatni. Ha nem várt festés figyelhetı meg, mely a laboratóriumi eljárások módosulásával nem magyarázható, és a HercepTest termékkel kapcsolatba hozható probléma gyanúja merül fel, azonnal vegye fel a kapcsolatot a Dako mőszaki szolgálatával. A minta elıkészítése emlı A biopsziás mintákat úgy kezelni, hogy a szövet alkalmas maradjon immuncitokémiai festésre. A mintákon a szövetelıkészítés szabványos módszerét kell alkalmazni (15). Paraffinba ágyazott metszetek A rutinszerő feldolgozásra semleges pufferelt formalinban vagy Bouin fixálószerrel tartósított és paraffinba ágyazott szövetek megfelelnek a célnak. A biopsziás mintákat például 3 4 mmes kockákra vágva 18 24 órán keresztül fixálja semleges pufferelt formalinban. A szöveteket ezután dehidratálja alkoholokban és xilénben, majd olvasztott parafinnal 60 C-nál nem magasabb hımérsékleten infiltrálja. A megfelelıen fixált és beágyazott, HER2 fehérjét kifejezı szövetek hővös helyen korlátlan ideig tárolhatók a metszetkészítés és felhelyezés elıtt (15 25 C) (15, 16). Az Egyesült Államokban az klini kai laboratórium fejlesztésérıl szóló 1988-as törvény 42 CFR 493.1259(b) szakasza kimondja, hogy A megfestett lemezeket a vizsgálat napjától számított legalább tíz évig, a feldarabolt mintákat pedig a vizsgálat napjától számított legalább két évig a laboratóriumnak meg kell ıriznie (16). A szövetmintákat 4 5 µm vastagságúra kell metszeni és tárgylemezre kell helyezni, majd szobahımérséklető levegın legalább 12 órán át (vagy száradásig), vagy 37 C -on egy éjszakán át, vagy 60 C-on egy órán át kell száríta ni. FIGYELMEZTETÉS: Egy óránál hosszabb ideig tartó 60 C fokos vagy annál magasab b hıhatás a speciális membránasszociált HER2 immunreaktivitás jelentıs csökkenését vagy elvesztését okozhatja (17). Az antigenitás megırzése érdekében a tárgylemezre (SuperFrost Plus, Poly-L-lysine vagy szilanizált tárgylemez) vitt szövetmetszeteket 4 6 héten belül kell megfesteni, ha szobahımérsékleten (20 25 C) tárolják ıket (18). A HER2 fehérje kiértékeléséhez és a tumorban jelenlétének ellenırzéséhez szükséges lemezeket egyszerre készítse el. Legalább 5 lemez az ajánlott, 1 lemez a tumor jelenlétének megállapításához, 2 lemez a HER2 fehérje értékeléséhez (1 lemez a 2. számú ampullával, 1 pedig a 4. számú ampullával történı inkubáláshoz), és 2 lemez biztonsági tartaléknak. A HercepTest kalciummentesített szöveteken való használatának validálása nem történt meg, így az nem ajánlott. A mintakészítéssel kapcsolatos további tudnivalókért tanulmányozza a Dako Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods (19) címő kiadványát, illetve a szakirodalomjegyzékben 15. és 16. tétel alatt hivatkozott kiadványokat. A szövetek kezelése festés elıtt Az assay optimális mőködéséhez specifikus epitópkinyerı módszert, 10 mmol/l citrát puffert kell alkalmazni. Az Epitópkinyerı oldat a HercepTest készletben megtalálható. A módszerben a 10 mmol/l citrát pufferbe (20) merített lemezeken fixált metszeteket melegítjük olyan kalibrált vízfürdıbe merítve, amely képes fenntartani az Epitópkinyerı oldat szükséges hımérsékletét (95 99 C). A tengerszint felett magasabban elhelye zkedı laboratóriumok maguk találják meg a legjobb módszert a vízfürdı szükséges hımérsékletének fenntartásához. Az epitóp kinyerését vízfürdıben kell végezni. Más melegítési módokat is teszteltek, de azok nem adtak (128387-001) P04087HU_01_K520721-2/2015.05 old. 8/51

Emlırák reprodukálható eredményeket. Az epitóp kinyerése után azonnal megkezdjük a festési eljárást. A leírt eljárástól való eltérés befolyásolhatja az eredményeket. Óvintézkedések emlı 1. In vitro diagnosztikai alkalmazásra szolgál. 2. Csak foglalkozásszerő felhasználók részére! 3. ampulla, Peroxidáz-blokkoló reagens, 3%-os hidrogén-peroxid oldatot tartalmaz. Szakembereknek kérésre anyagbiztonsági adatlapot adunk. 4. ampulla, DAB kromogén, tartalma 5-<10% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride, felirata: H350 H341 P201 P280 Veszély P308 + P313 P405 P501 Rákot okozhat. Feltehetıen genetikai károsodást okoz. Használat elıtt ismerje meg az anyagra vonatkozó különleges utasításokat. Védıkesztyő/védıruha/szemvédı/arcvédı használata kötelezı. Expozíció vagy annak gyanúja esetén: orvosi ellátást kell kérni. Elzárva tárolandó. A tartalom/edény hulladékként történı elhelyezését a helyi, regionális, országos és nemzetközi szabályozásokkal összhangban kell elvégezni. Általános szabály, hogy 18 év alatti személyek nem dolgozhatnak ezzel a termékkel. A felhasználó legyen alaposan tájékozott a helyes munkavégzési eljárást, a termék veszélyes tulajdonságait és a szükséges biztonsági intézkedéseket illetıen. További információért olvassa el az anyagbiztonsági adatlapot. 5. A 8. ampullában lévı mosópuffer 5-<10% 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol hydrochloride, and 0.1-<0.2% 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxane tartalmaz. Allergiás reakciót okozhat. A Wash Buffer (10x) a következı címkézéssel van ellátva: Figyelem H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Súlyos szemirritációt okoz. Szemvédı/arcvédı használata kötelezı. A használatot követıen a kezet alaposan meg kell mosni. SZEMBE KERÜLÉS esetén: Több percig tartó óvatos öblítés vízzel. Adott esetben a kontaktlencsék eltávolítása, ha könnyen megoldható. Az öblítés folytatása. 6. A termék nátrium-azidot (NaN 3 ) tartalmaz, mely tiszta formában nagyon mérgezı vegyület. Bár a termékben található koncentráció besorolása alapján nem veszélyes, a nátrium-azid reakcióba léphet az ólom és réz vízvezetékekkel, mely során rendkívül robbanékony fém-azid lerakódások alakulhatnak ki. Megsemmisítéskor, megelızendı a fém-azidok vízvezetékekben történı lerakódását, nagy mennyiségő vízzel kell leöblíteni (21, 22). 7. A 2., 3.és 4. ampulla állati eredető anyagot tartalmaz. Mint bármely biológiai eredető termék esetén, a megfelelı kezelési eljárásokat kell alkalmazni. 8. A kontroll lemezeket és mintákat fixálás elıtt és után, valamint minden velük érintkezı anyagot fertızésre alkalmasként kezeljen, és a megfelelı óvintézkedésekkel mentesítse (23). (128387-001) P04087HU_01_K520721-2/2015.05 old. 9/51

Emlırák A reagenseket soha ne szívja fel szájjal a pipettába, és ügyeljen arra, hogy a reagensek és a minták ne érintkezzenek a bırrel és a nyálkahártyákkal. Ha a reagensek érzékeny területtel érintkeznek, mossa le bı vízzel. 9. Óvja a reagenseket a mikrobaszennyezıdéstıl, hogy elkerülje a nem specifikus megfestıdést. 10. A megadottól eltérı inkubálási idık, hımérsékletek vagy módszerek hibás eredményeket adhatnak. Egy óránál hosszabb ideig tartó 60 C fokon vagy annál magasabb hımérsékleten történı szárítás a speciális membrán-asszociált HER2 immunreaktivitás jelentıs csökkenését vagy elvesztését okozhatja (17). 11. A reagensek az optimális mértékben vannak hígítva. További hígítás az antigén gyengébb festıdését okozhatja. 12. Minden reagenst, epitópkinyerı oldatot és mosópuffert kifejezetten e teszt céljára készítettünk. A teszt megadott jellemzıinek elérése érdekében ne helyettesítse az anyagokat. Mosópuffernek azonban az S3006-os kódszámú termék is használható. 13. A Megjelenítı reagens és a DAB kromogén károsodhat, ha túlzottan erıs fény éri. Ne tárolja a rendszer komponenseit, és ne végezze a festést erıs fényben, például közvetlen napsütésben. 14. Viseljen megfelelı személyi védıeszközöket a bırrel és szemmel történı érintkezés elkerülése érdekében. További információért olvassa el az anyagbiztonsági adatlapot. 15. A paraffinmaradványok hamis negatív eredményeket okozhatnak. 16. Az ajánlottól eltérı reagensmennyiség használata esetén elıfordulhat, hogy a HER2 immunreaktivitás nem lesz látható. A 22 mm x 22 mm méretőnél nagyobb szövetmetszetek esetében 2-3-szor 200 µl reagensre van szükség, 2-3 automata alkalmazási területen alkalmazva. HASZNÁLATI UTASÍTÁS emlı A. A reagens elıkészítése Érdemes a következı reagenseket a festés elıtt elkészíteni: A.1 Epitópkinyerı oldat Desztillált vagy ionmentesített vízzel 1:10 arányban hígítson a 7. ampulla tartalmából (Epitópkinyerı oldat x 10) a tervezett festési eljáráshoz elegendı mennyiséget. A fel nem használt hígított oldat 2 8 C-on egy hónapig tárol ható. A hígított oldatot kezelje hulladékként, ha kicsapódás látható benne. A.2 Mosópuffer Desztillált vagy ionmentesített vízzel 1:10 arányban hígítson a 8. ampulla tartalmából (Mosópuffer x 10) a mosáshoz szükséges mennyiséget. A fel nem használt hígított puffer 2 8 C-on egy hónapig tárolható. A puffert öntse ki, ha kicsapódás látható benne. Az Autostainer programja szerint leöblíti a szövetmetszeteket a peroxidáz-blokkoló reagens és a szubsztrát kromogén oldat után. Felhívjuk a figyelmét arra, hogy ezekben az öblítési lépésekben desztillált (vagy ionmentesített) víz vagy mosópuffer egyaránt használható. Minden más öblítési lépésben mosópuffert kell használni. A.3 Szubsztrát kromogén oldat (DAB) Készítsen szubsztrát kromogén oldatot a 6-os ampullából 11 csepp (cseppenként 25 30 µl) DAB kromogén egy 5-ös ampulla DAB pufferelt szubsztráthoz (11 ml) adásával és összekeveréséve. Az elkészített szubsztrát kromogén oldat (DAB) 2 8 C-on tárolva körülbelül 5 napig stabil. Ezt az oldatot felhasználás elıtt alaposan keverje fel. Az oldatban esetleg létrejövı csapadék nem befolyásolja a festés minıségét. MEGJEGYZÉS: Az 6. ampullában lévı DAB kromogén színe átlátszótól világos levendulaszínig változhat. Ez nem befolyásolja a termék viselkedését. A hígítást a jelen (128387-001) P04087HU_01_K520721-2/2015.05 old. 10/51

Emlırák tájékoztatóban foglaltak szerint végezze. Túl nagy mennyiségő DAB kromogén hozzáadása a DAB puffer-szubsztráthoz a pozitív jel romlását eredményezi. A.4 Kontrasztfestés A DAB festési reakció színes végterméke alkoholban és vízben oldhatatlan. Alkalmazzon hematoxilines kontrasztfestést, és a hematoxilin festési intenzitását állítsa be a Dako HercepTest értelmezési kézikönyv Emlırák címő dokumentumban bemutatott szinthez hasonlóan. Alkoholvagy vízalapú hematoxilin, például az S3301-es kódszámú Dako Mayer's Hematoxylin használható. A hematoxilines kontrasztfestés után végezzen alapos öblítést desztillált vagy ionmentesített vízzel, majd merítse a szöveteket 37 mmol/l-es szalmiákszesz fürdıjébe (lásd a B.2 szakasz 3. lépését). A szalmiákszesz (37 mmol/l) 2,5 ml 15 mol/l-es (koncentrált) ammonium-hidroxid és1 liter desztillált vagy ionmentesített víz keverésével készül. A fel nem használt 37 mmol/l-es szalmiákszesz szobahımérsékleten (20 25 C) szorosan lezárt palackban le gfeljebb 12 hónapig tárolható. A.5 Rögzítıszer Nem vizes, tartós rögzítıszer használata ajánlott. Azonban vízalapú rögzítı is elfogadható. Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-to-Use, Kódszám: S3025, vagy Glycergel Mounting Medium, Kódszám: C0563 ajánlott vizes rögzítéshez. A felhasználás elıtt körülbelül 40 (± 5) C-ra melegítve folyósítsa me g a Glycergel -t. B. Festési eljárás az Autostainer készüléken B.1 Megjegyzések az eljárással kapcsolatban A felhasználó használat elıtt alaposan tanulmányozza ezeket az utasításokat, és ismerkedjen meg minden komponenssel és mőszerrel (lásd Óvintézkedések). Az immunfestés elıtt a reagenseket hozza szobahımérsékletre (20 25 C). Ugyanígy minden inkubálást szobahımérsékleten végezzen. Ne hagyja, hogy a szövetmetszetek megszáradjanak a lemezek Autostainer készülékbe töltése és festési eljárás közben. A megszáradt szövetmetszeteken erısebb nem specifikus festıdés jelentkezhet. Ha a festési eljárást meg kell szakítani, a primer antitest inkubálása után a lemezek szobahımérsékleten (20 25 C) legfeljebb egy óráig a puffe rben tarthatók anélkül, hogy a festés eredményességét ez befolyásolná. Paraffinmentesítés és rehidratálás: Festés elıtt a szövetmetszeteket a beágyazó anyag eltávolításához paraffinmentesíteni, majd rehidratálni kell. Ügyeljen a paraffin teljes eltávolítására. A visszamaradó beágyazó anyag nagyobb nem specifikus megfestıdést eredményezhet. Ezt a lépést szobahımérsékleten (20 25 C) végezze. 1. Helyezze a lemezeket xilénfürdıbe, és inkubálja 5 (±1) percig. Cseréljen fürdıt és ismételje meg egyszer. 2. Ütögetéssel távolítsa el a fölös folyadékot, és 3 (±1) percre helyezze a lemezeket abszolút etanolba. Cseréljen fürdıt és ismételje meg egyszer. 3. Ütögetéssel távolítsa el a fölös folyadékot, és 3 (±1) percre helyezze a lemezeket 95%-os etanolba. Cseréljen fürdıt és ismételje meg egyszer. 4. Ütögetéssel távolítsa el a felesleges folyadékot, majd legalább 30 másodpercre helyezze a lemezeket desztillált vagy ionmentesített vízbe. A B.2 szakasz 1. lépésében foglaltak szerint kezdje meg az epitóp kinyerését. A xilénes és alkoholos oldatokat 40 lemez után cserélni kell. Xilén helyett használható toluén vagy xilént helyettesítı anyag, például Histoclear. MEGJEGYZÉS: A készletben található reagensek és utasítások az optimális teljesítmény eléréséhez lettek összeállítva. A reagensek további hígítása, az inkubálási hımérséklet megváltoztatása hibás vagy ellentmondó eredményeket adhat. A felhasználó laboratóriumában (128387-001) P04087HU_01_K520721-2/2015.05 old. 11/51

a szövetek feldolgozásának és a technikai eljárásoknak az eltérései érvényteleníthetik az assay eredményeit a betegek Herceptin terápiába való beválasztását illetıen. Emlırák (128387-001) P04087HU_01_K520721-2/2015.05 old. 12/51

B.2 Festési protokoll Szobahımérsékleten, 20 25 C között. Emlırák 1. lépés: Epitóp kinyerése Töltse meg a festıedényeket, pl. Coplin-csészéket hígított Epitópkinyerı oldattal (lásd HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ, A.1 szakasz). Helyezze az Epitópkinyerı oldatot tartalmazó festıedényeket vízfürdıbe. Melegítse fel a vízfürdıt és az Epitópkinyerı oldatot 95 99 C-ra. Felmelegítéskor az Epitópkinyerı oldat zavarossá válik. A hımérséklet stabilizálása és a párolgás megakadályozása érdekében fedje le a csészéket. Merítse a szobahımérséklető, paraffinmentesített lemezeket a festıedényekben lévı elıre felmelegített Epitópkinyerı oldatba. MELEGÍTSE FEL A VÍZFÜRDİT ÉS AZ EPITÓPKINYERİ OLDATOT ISMÉT 95 99 C-RA. Inkubálja 40 (±1) percig 95 99 C-on. A lemezekkel együtt vegye ki a teljes edényt a vízfürdıbıl. Hagyja a lemezeket az epitópkinyerı oldatban 20 (±1) percig szobahımérsékleten hőlni. Öntse le az Epitópkinyerı oldatot, majd öblítse le a metszeteket a mosópufferben (lásd HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ, A.2 szakasz). Az optimális eredmény elérése érdekében az epitóp kinyerése után és a festés megkezdése elıtt 5 20 percig áztassa a metszeteket a mosópufferben. MEGJEGYZÉS: Az Epitópkinyerı oldat egyszeri felhasználásra készült. Ne használja fel ismét. 2. lépés: Autostainer eljárás 1. Az Autostainer által a HercepTest programban létrehozott leírásból tájékozódjon a szükséges programidıkrıl és reagensmennyiségekrıl (a konkrét mennyiségeket lásd az alábbi 4. pontban). 2. Helyezze az Autostainer reagensampulláit az Autostainer kosarába a számítógép által létrehozott reagenselrendezés szerint. 3. Töltse be a lemezeket az Autostainer készülékbe a számítógép által létrehozott lemezelrendezés szerint. 4. Állítsa be és indítsa el a HercepTest programot. A következıkben a program futásának áttekintése olvasható: Öblítés 200 µl peroxidáz blokkoló reagens 5 perc Öblítés 200 µl priemr Anti-HER2 fehérje (vagy negatív kontrollreagens) 30 perc Öblítés 200 µl Megjelenítı reagens 30 perc Öblítés Öblítés Váltás 200 µl szubsztrát kromogén oldat (DAB) 10 perc A szubsztrát kromogén lépés után öblítse le a lemezeket ionmentesített vízzel MEGJEGYZÉS: Az Autostainer 01-es hardververziója a lemezeket pufferben öblíti. Ezért a lemezeket az Autostainer készülékbıl való kivételük után ionmentesített vízzel le kell öblíteni. 3. lépés: Kontrasztfestés (az utasítások hematoxilinre vonatkoznak) (128387-001) P04087HU_01_K520721-2/2015.05 old. 13/51

Emlırák Vegye ki a lemezeket az Autostainer készülékbıl és az alább leírt módon végezze el a hematoxilines kontrasztfestést. Merítse a lemezeket hematoxilin fürdıjébe. A használt hematoxilin erısségétıl függıen 2 5 percig inkubálja. Desztillált vagy ionmentesített víz fürdıjében óvatosan öblítse le a lemezeket. Ügyeljen arra, hogy ne maradjon rajtuk hematoxilin. Opcionális: Mártsa a lemezeket 10-szer 37 mmol/l-es szalmiákszesz fürdıjébe (lásd az A.4 szakaszt). Desztillált vagy ionmentesített víz fürdıjében óvatosan öblítse a lemezeket 2 5 percig. MEGJEGYZÉS: Az inkubálás hosszától és a felhasznált hematoxilin erısségétıl függıen a kontrasztfestés a sejtmagok halvány vagy sötétkék elszínezıdését eredményezi. A túlzott vagy elégtelen kontrasztfestés akadályozhatja az eredmények helyes értelmezését. 4. lépés: Felhelyezés Nem vizes, tartós rögzítıszer használata ajánlott. Azonban vízalapú rögzítıszer is elfogadható. A minták vizes rögzítıszerrel, pl. az S3025-ös kódszámú Dako Faramount, vagy a C0563-as kódszámú Glycergel rögzíthetık és lefedhetık. MEGJEGYZÉS: A lemezek alkalmas idıben bármikor kiértékelhetık. Azonban némi fakulás következhet be, ha a vizes rögzítıszerrel lefedett lemezeket egy hétnél hosszabb ideig erıs fény éri. A fakulás minimálisra csökkentése érdekében a lemezeket sötét helyen, szobahımérsékleten (20 25 C között) tárolja. Minıség-ellenırzés emlı A szövetek fixálásának és a felhasználó laboratóriumában történı feldolgozásának és beágyazásának eltérései az eredmények jelentıs szórását okozhatják, ezért a Dako által biztosított ellenırzı minták mellett szükséges a rendszeres belsı ellenırzés. Az Egyesült Államokban további tudnivalókért lásd a College of American Pathologists (CAP) Immunhisztokémiai minısítı programjának minıség-ellenırzési követelményeit, a CLSI (korábban NCCLS) Immuncitokémiai Minıségbiztosítás Elfogadott Iirányelveit (24), valamint az irodalomjegyzék 25. számú munkáját. 1. táblázat. A napi minıség-ellenırzés célja. Szövet: A páciens mintájával azonos módon fixált és feldolgozott Pozitív kontroll: A kimutatni kívánt célantigént tartalmazó szövet vagy sejtek (a páciens szövetében található). Az ideális kontroll a gyengén pozitívan festıdı szövet, mivel ez a legérzékenyebb az antitesttel, illetve az antigénlebomlással szemben Specifikus antitest és szekunder antitest Az elemzés minden lépését ellenırzi. Validálja a reagenseket és eljárásokat a HER2 fehérje festése során. Nem specifikus antitest* vagy puffer és a specifikus antitesttel használttal azonos szekunder antitest Nem specifikus háttérfestés kimutatása. Negatív kontroll: Várhatóan negatív szövetek vagy sejtek (megtalálható lehet a páciens szövetmintájában vagy a pozitív kontroll mintában) Antitest sejtekkel/sejtkomponensekkel szembeni, nem kívánt keresztreaktivitásának kimutatása. Nem specifikus háttérfestés kimutatása. Páciens szövetmintája Specifikus festés kimutatása Nem specifikus háttérfestés kimutatása. Dako által mellékelt kontroll lemez Csak a festési eljárást ellenırzi * A specifikus antitestével azonos fajtól származó szérum, de nem ugyanazon antigén ellen. Nem specifikus antitestkötés kimutatása, pl. az antitest Fc részének kötıdése a szövethez. Kontroll lemez (mellékelve): A mellékelt kontrollminták mindegyike a készlet reagálásának ellenırzésére három formalinnal fixált, paraffinba ágyazott humán emlırák-sejtvonalat tartalmaz, amelyek festési értékei 0, 1+ és 3+. Festési eljárásonként egy lemezt fessen meg. A Dako által biztosított kontrollminták sejtvonalainak kiértékelése jelzi a festési menet érvényességét. (128387-001) P04087HU_01_K520721-2/2015.05 old. 14/51

Emlırák Pozitív kontrollszövet: A kontroll legyen friss autopsziás/biopsziás/sebészeti minta, a páciens mintájával azonos módon fixálva, feldolgozva és beágyazva. A pozitív kontrollszövetek a megfelelıen elıkészített szövetekre és a helyes festési technikákra utalnak. Minden egyes festési menetben, minden egyes vizsgálati körülményhez mellékelni kell egy pozitív kontrollszövetet. A pozitív kontrollszövetek gyenge pozitív festést adjanak, hogy a primer antitest érzékenységének finom változásait is ki tudják mutatni. A készletben mellékelt kontrollminták vagy a páciens mintáitól eltérı módon feldolgozott minták csak a reagens mőködését igazolják, a szövet elıkészítésérıl nem adnak visszajelzést. Pozitív kontrollszövetként egy korábban HER2 fehérjét 2+ értékkel emelkedetten expresszáló invaszív (infiltráló) emlırák-szövet használata ideális. MEGJEGYZÉS: Az ismert pozitív kontrollszöveteket a feldolgozott szövetek és tesztreagensek megfelelıségének ellenırzésére használja, NE a páciensek mintáinak diagnosztizálásához. Ha a pozitív kontrollszövet nem mutat megfelelı pozitív festést, a páciens mintáinak eredményeit érvénytelennek kell tekinteni. Negatív kontrollszövet: A minden festési menetben a páciens mintáival azonos módon fixált, feldolgozott és beágyazott negatív (HER2 fehérjére ismerten negatív) kontrollszövettel ellenırizze a primer ellenanyag specificitását és a háttérfestést. Negatív kontrollszövetnek megfelel a vastagbél, a máj vagy a pajzsmirigy szövete. A legtöbb szövetmetszetben elıforduló több különféle sejttípus belsı negatív kontrollhelyeket kínál (ezt a felhasználónak ellenıriznie kell). A normál emlıvezeték belsı negatív kontrollként szolgálhat. Ha specifikus festés történik a negatív kontrollszövetben vagy a belsı negatív kontrollszövetben, akkor a páciens mintáinak eredményét érvénytelennek kell tekinteni, és a tesztet újra kell futtatni. Nem specifikus negatív kontrollreagens: A nem specifikus festés értékelésére és az antigén helyén a specifikus festés jobb értelmezéséhez a primer antitest helyett használja a mellékelt negatív kontrollreagenst a páciens mintáinak egy metszetén. A negatív kontrollreagens inkubálási idejének a primer antitestének kell megfelelnie. Assay ellenırzése: Az ellenanyag vagy festırendszer diagnosztikai eljárásban történı elsı felhasználása elıtt a felhasználónak ellenıriznie kell az ellenanyag specificitását. Ehhez tesztelni kell azt több, ismert pozitív és negatív szövetet jelzı, ismert immuncitokémiai tulajdonsággal rendelkezı mintán. Lásd a tájékoztató jelen szakaszában fentebb vázolt minıség-ellenırzési eljárásokat és a CAP Immunhisztokémiai Minısítı Programjának minıség-ellenırzési követelményeit, és/vagy a CLSI (korábban NCCLS) Immuncitokémiai Minıségbiztosítás Elfogadott Irányelveit (24). Ezeket a minıség-ellenırzési eljárásokat minden új antitest-tételnél, illetve az assay paramétereinek megváltozásakor meg kell ismételni. A HER2 fehérjére ismert, 0 3+ erısségő festést adó, valamint negatív szövetek, pl. a vastagbél, a máj vagy a pajzsmirigy szövetei megfelenek az assay ellenırzéséhez. (128387-001) P04087HU_01_K520721-2/2015.05 old. 15/51

A festés értelmezése emlı Emlırák A HER2 fehérje emelkedett expressziójának meghatározásához kizárólag a membrán festési intenzitását és mintáját szabad értékelni a 2. táblázatban bemutatott skála alapján. A lemez értékelését patológus szakembenek kell végeznie fénymikroszkóp segítségével. Az immuncitokémiai festés értelmezésére és értékelésére 10x-es nagyítású objektív a megfelelı. 20 40x-es nagyítású objektív az értékelés megerısítéséhez hasznos. A citoplazma festıdését nem specifikus festıdésnek kell tekinteni, és nem szabad belefoglalni a membrán festési intenzitásának értékelésébe (8). A 0, 1+, 2+ és 3+ erısségő festés megkülönböztetéséhez lásd a Dako HercepTest értelmezési kéziköny Emlırák c. dokumentum festéserısségeket szemléltetı képeit. Csak invazív emlıkarcinómás betegek mintáit értékelje. Ha egyazon mintában megtalálható in situ és invazív karcinóma, akkor csak az invazív komponenst értékelje. 2. táblázat. Sejtmembrán festıdési erısségének kritériumai. Festıdési minta észlelhetı festıdés, vagy a membrán festıdése a tumorsejtek kevesebb mint 10%-ában észlelhetı Halvány/alig kivehetı membránfestıdés észlelhetı a tumorsejtek több mint 10%-ában. A sejtek membránja részlegesen festıdött Gyenge/közepes erısségő membránfestıdés észlelhetı a tumorsejtek több mint 10%-ában. Erıs membránfestıdés észlelhetı a tumorsejtek több mint 10%-ában. Érték (Jelentés a kezelıorvosnak) 0 1+ 2+ 3+ HER2 fehérje emelkedett expressziójának értékelése (Jelentés a kezelıorvosnak) Negatív Negatív Gyengén pozitív Erısen pozitív A HercepTest a HER2 fehérje emelkedett expressziójára nézve lehet negatív (0 és 1+ festési intenzitás), enyhén pozitív (2+ festési intenzitás), illetve erısen pozitív (3+ festési intenzitás). A HercepTest nem arra készült, hogy diagnosztikai információt adjon a páciens vagy az orvos számára, és ilyen célra nem is lett bevizsgálva. A lemezeket minden festési menetben a 3. táblázatban megadott sorrendben meg kell vizsgálni meghatározandó a festési menet érvényességét, és lehetıvé téve a szövetminta festési intenzitásának félkvantitatív kiértékelését. (128387-001) P04087HU_01_K520721-2/2015.05 old. 16/51

Emlırák 3. táblázat. A lemezek kiértékelésének sorrendje. Lemezek kiolvasási sorrendje Magyarázat 1. A három sejtvonalat tartalmazó kontroll lemez A sejtmembrán 3+ erısségő barna festıdése (győrőszerő) a SK-BR-3 jelő 3+ kontroll sejtvonalban, részleges barna győrő az MDA-175 jelő 1+ kontroll sejtvonalban, és a festıdés elmaradása az MDA-231 jelő 0 kontroll sejtvonalban érvényes assay-t jelez. Pontonkénti vagy szaggatott membránfestıdés a pozitív 1+ MDA-175 sejtvonal kevés vagy közepes mennyiségő sejtjében. Ebben a sejtvonalban a citoplazma Golgi-régiójának pontszerő festıdése is megfigyelhetı. Az MDA-231 jelő 0 kontroll sejtvonalban (HER2 fehérje festésére negatív) megjelenı barna festıdés azt jelenti, hogy az assay-ben nem specifikus festıdés történt. Az assay eredményei érvénytelenek lehetnek túlfestıdés miatt. 2. Pozitív kontrollszövet Barna membránfestıdést kell észlelni. A citoplazma és a negatív szövetek festıdése nem lehet erısebb mint 1+. 3. Negatív kontrollszövet A negatív kontrollszövet specifikus festıdésének HIÁNYA megerısíti a készlet sejtekkel/sejtkomponensekkel szembeni keresztreaktivitásának hiányát. Ha specifikus membránfestés történik a negatív kontrollszövetben, akkor a páciens szövetmintájának eredményét érvénytelennek kell tekinteni. 4. Negatív kontrollreagens használatával festett, betegbıl származó szövetminta 5. A primer antitest használatával festett, betegbıl származó szövet A specifikus membránfestıdés hiánya igazolja, hogy a primer antitest megjelöli a cél antigént. A negatív kontrollreagenssel kezelt minta citoplazmájában végbemenı egyéb sárgás vagy barna festıdés, például kötıszövetben, leukocitában, eritrocitában vagy nekrotikus szövetben nem specifikus háttérfestésnek tekintendı, és az adatlap megjegyzések rovatában jelentendı. A HER2 fehérje emelkedett expressziója barna győrőként észlelhetı a primer antitesttel kezelt tumorsejtek sejtmembránján. 1. Kontroll lemez (mellékelve): A HercepTest assay-vel megfestett kontroll-lemezt kell elsıként értékelni, hogy meggyızıdhessen arról, hogy az összes reagens megfelelıen mőködik-e. A sejtmembránnál található barna (3,3 -diaminobenzidin, DAB) reakciótermék a pozitív reaktivitás jele. A sejtmembrán kerületi (győrőszerő) barna festıdése az SK-BR-3 jelő, 3+ kontroll sejtvonalban, részleges barna győrő az MDA-175 jelő, 1+ kontroll sejtvonalban, valamint a festıdés elmaradása az MDA-231 jelő, 0 kontroll sejtvonalban érvényes assay-t jelez Ha a kontroll sejtvonalak bármelyike esetében az ezen kritériumoktól való eltérés figyelhetı meg, a páciens mintáinak minden eredményét érvénytelennek kell tekinteni. 2. Pozitív kontrollszövet: Ezután a pozitív kontrollszövetet kell megvizsgálni. Ez a lemez ellenırzi, hogy a fixálás és az epitóp kinyerése sikeres-e. A festés értelmezéséhez használjon ép sejteket, mivel a nekrotikus vagy degenerált sejtek gyakran nem specifikusan festıdnek (26). A festıdés a tumorszövetben a sejtmembrán barna elszínezıdéseként jelentkezik. A citoplazma és a negatív szövetek barna festıdése nem lehet erısebb, mint ami az 1+ festési intenzitásnak megfelel. 3. Negatív kontrollszövet: A pozitív kontrollszövet után meg kell vizsgálni a negatív kontrollszövetet ellenırizendı a cél antigén primer antitest általi megjelölésének specifikusságát. A negatív kontrollszövet specifikus festıdésének hiánya megerısíti a készlet sejtekkel/ sejtkomponensekkel szembeni keresztreaktivitásának hiányát. Ha specifikus festés történik a negatív kontrollszövetben, akkor a páciens szövetmintájának eredményét érvénytelennek kell tekinteni. Ezen felül a pozitív kontrollszövet negatív részei negatív kontrollszövetként is szolgálhatnak, de ezt a felhasználónak ellenıriznie kell. Felhívjuk a figyelmét arra, hogy gyenge reakció (0 1+ festési intenzitás) észlelhetı a legtöbb normál epithelialis szövetben. Alkalmazható negatív kontrollszövetek például: vastagbél, máj és pajzsmirigy. (128387-001) P04087HU_01_K520721-2/2015.05 old. 17/51

Emlırák A nem specifikus festıdés, amennyiben van, megjelenésében diffúz. A formalinban túlzottan fixált szövetekben a kötıszövet helyenkénti festıdése figyelhetı meg. 4 + 5. Páciens szövetmintája: A páciens mintáit utoljára vizsgálja meg a HercepTest segítségével. A pozitív festıdés intenzitását a negatív kontrollreagens nem specifikus háttérfestésének kontextusában értékelje. Mint minden immuncitokémiai teszt esetében, a negatív eredmény azt jelenti, hogy az antigén nem volt észlelhetı, nem pedig azt, hogy az antigén nincs jelen a vizsgált sejtekben vagy szövetben. A HercepTest immunreaktivitásával kapcsolatos tudnivalókat lásd az Összefoglalás és magyarázat és a Korlátozások és teljesítményjellemzık címő részekben. További ajánlások a HercepTest festésének értelmezéséhez A HER2 fehérje emelkedett expressziója szempontjából vizsgált legtöbb metasztázisos emlıkarcinóma 0 vagy 3+ értéket kap. Míg az esetek legtöbbje egyértelmő, a fennmaradó 1+ és 2+ értékő minták egy részének értelmezése nehezebb lehet. A HercepTest festésének értelmezésekor kövesse az alábbi útmutatásokat. Értékelje ki a kontroll sejtvonalakat az assay mőködésének validálására. Értékelje ki a pozitív és negatív kontroll lemezeket. Az elsı értékeléskor ajánlott a szövetminta hematoxilines és eozines festése (H&E). (A tumor esetleg nem szembetőnı a HercepTest -tel festett mintán. A H&E módszerrel festett lemezre szüksége van a patológusnak a tumor jelenlétének igazolásához.) A HercepTest -tet a minta azonos paraffinkockájából származó párosított metszeten (metszetsorozaton) végezze el. A HER2 fehérje emelkedett expressziójának vizsgálatára megfestett metszeteket elıször kis nagyításon értékelje. A pozitív esetek túlnyomó többsége kis nagyításon egyértelmően megállapítható. A minta jól tartósított és megfestett területeit használja a pozitív tumorsejtek százalékának meghatározásához. Általában az esethez rendelhetı érték kis nagyításon is nyilvánvaló. Ha az 1+ és 2+ határesetén kis nagyításon nehéz dönteni, akkor az érték általában 1+. A membrán festıdésének ellenırzéséhez használjon 20 40x-es optikai nagyítást. Ha a tumorsejtek többsége teljes membránfestıdést mutat, akkor a festıdés erıssége 2+ vagy 3+. Növelje az optikai nagyítást 20 40x-ra az érték megerısítéséhez. A 3+ esetek többségében a tumorsejtek legalább 80%-a festıdik, és a membrán festése erıs. Ha a mintában a 10%-os határérték körül van a pozitív tumorsejtek száma, akkor ajánlott legalább 100 tumorsejtet megszámolni a megfestett sejtek arányának meghatározásához. Ha a tumorsejtek több mint 10%-ában gyenge vagy közepes erısségő teljes membránfestıdés tapasztalható, akkor a minta értéke 2+. Ehhez általában a fennmaradó tumorsejtek többségének nem teljes membránfestıdése társul. Ha a tumorsejtek kevesebb mint 10%-ánál festıdött a membrán teljesen körkörösen, és a többi tumorsejtnél esetleg nem teljes a festıdés, akkor az érték 1+. Ha a tumorsejtek kevesebb mint 10%-ánál festıdött a membrán teljesen körkörösen vagy részlegesen, akkor az érték 0. (128387-001) P04087HU_01_K520721-2/2015.05 old. 18/51

Korlátozások emlı Általános korlátozások Emlırák 1. Az immunocitokémia egy többlépcsıs diagnosztikai folyamat, amely speciális képzést igényel a megfelelı reagensek és a szövetek kiválasztása, fixálása és feldolgozása, valamint az immuncitokémiai lemez elıkészítése és a festési eredmények értelmezése területén. 2. A szövetfestés sikere a szöveteknek a festést megelızı kezelésétıl és feldolgozásától függ. A helytelen fixálás, fagyasztás, kiolvasztás, mosás, szárítás, melegítés, metszetkészítés, illetve más szövetekkel vagy folyadékokkal való szennyezıdés hamis eredményt, az antitest befogódását vagy hamis negatív eredményt adhat. Az inkonzisztens eredményeket okozhatják a fixálási és beágyazási módszer eltérései vagy a szövetelıkészítés inherens szabálytalanságai. 3. A túlzott vagy elégtelen kontrasztfestés akadályozhatja az eredmények helyes értelmezését. 4. A pozitív festés vagy annak hiányának klinikai értelmezését a klinikai megjelenés, morfológia és egyéb hisztopatológiai kritériumok kontextusában kell végezni. A festés vagy annak hiányának klinikai értelmezését morfológiai vizsgálatoknak és megfelelı kontrolloknak, valamint egyéb diagnosztikai vizsgálatoknak kell kiegészíteniük. A festett preparátum értelmezése olyan képesített patológus feladata, aki ismeri az antitesteket, reagenseket és az alkalmazott módszereket. A festést tanúsítvánnyal ellátott laboratóriumban kell végezni, olyan patológus felügyelete alatt, aki a festett lemezeket megtekinti, és biztosítja a pozitív és negatív kontrollok megfelelıségét. 5. A hepatitisz B vírussal fertızött személyektıl származó, hepatitisz B felületi antigént (HBsAg) tartalmazó szövetek torma-peroxidázra nem specifikus festıdést mutathatnak (27). 6. A reagensek váratlan reakciót adhatnak az elızıleg nem tesztelt szövettípusokon. Az antigén neoplazmában és más patológiás szövetekben való expressziójának biológiai változékonysága következtében a váratlan reakciókat még a tesztelt szövetekben sem lehet teljesen kizárni (28). A dokumentált váratlan reakcióval kapcsolatban forduljon a Dako mőszaki szolgálatához. 7. Hamis pozitív eredmény lehet látható a fehérjék nem immunológiai kötése vagy a szubsztrát reakciótermékei miatt. Ezt okozhatja még pszeudoperoxidáz aktivitás (eritrociták) vagy endogén peroxidáz aktivitás (citokróm C) (28). 8. A festési eljárást szobahımérsékleten (20 25 C) végezze. Termékspecifikus korlátozások 1. Az MDA-175 jelő 1+ kontroll sejtvonalban jelen lévı antigén idıvel lebomlik. A kontroll lemez által adott eredményeket a kontroll lemez felhasználhatósági idejéhez viszonyítva értékelje. Az MDA-175 sejtek negatív festıdése jelentheti mindössze azt, hogy a kontroll lemez már nem használható. A kontroll-lemezeket 2 8 C-on kell tárolni. 2. A hamis negatív eredményeket okozhatja az, hogy az antigén idıvel lebomlik a szövetekben. A mintákat a lemezen rögzítéstıl számított 4 6 héten belül meg kell festeni, ha azokat szobahımérsékleten (20 25 C) tárolják (29). 3. Az optimális és megismételhetı eredmények eléréséhez a HER2 fehérje olyan hıindukált epitópkinyerést igényel, amelyben a szövetek fixálása (semleges pufferelt formalin vagy Bouin fixálószer) és paraffinba ágyazása rutinszerően zajlik. Ezt az elıkezelést a teljes festési eljárást megelızıen kell elvégezni. Lásd a Minta elıkészítése részben a A szövetek kezelése festés elıtt szakasz utasításait. 4. A HER2 fehérje hıindukált epitópkinyerését csak kalibrált vízfürdıvel végezze. Más melegítési módokat is teszteltek, de azok nem adtak reprodukálható eredményeket. 5. Ne helyettesítse a készlet reagenseit más sorozatszámú reagensekkel vagy más gyártótól származó reagensekkel. Az egyetlen kivétel a mosópuffer, amely az S3006 kódszámú Dako Wash Buffer termékkel helyettesíthetı. (128387-001) P04087HU_01_K520721-2/2015.05 old. 19/51

6. A citoplazma festıdésének értékelése hamis eredményeket adhat. Az eredmények értékelésekor csak a sejtmembrán festési intenzitását tekintse. Emlırák 7. A megfestett kontroll lemezeket csak a festési menet validálására használja, ne pontozza vele a szövetmetszetek festési reakcióját. 8. Idınként erıs helyi festıdés (3+), azaz forró pontok láthatók. Ez az egyenetlen fixálás és/vagy szövetfeldolgozás eredménye lehet. Ajánlott ugyanabból a mintából egy második szövetkocka immunfestése. 9. A HercepTest használatát nem semleges pufferelt formalinban vagy Bouin fixálószerben fixált minták esetében nem validálták. 10. Az emlıszövetben lévı normál epithelium festıdésének 0 és 1+ között kell lennie. Ha a normál epithelium 1+ feletti erısségő festıdését észleli, akkor a tesztet meg kell ismételni. Felhívjuk a figyelmét arra, hogy a normál mandula és a nyelıcsövi epithelium akár 2+ erısséggel is festıdhet. Teljesítményjellemzık emlı Háttér A Herceptin vizsgálatába beválasztható betegeket azonosító klinikai vizsgálat (CTA) kísérleti jellegő volt és nincs folytatása. A HercepTest a CTA összehasonlítható alternatívájaként lett kifejlesztve. A Herceptin biztonságosságát és hatékonyságát véletlen kiválasztásos, ellenırzött klinikai vizsgálatban és egy nagy, nyílt vizsgálatban értékelték (Lásd a Herceptin tájékoztatóját). A központi laboratóriumban CTA-val végzett immuncitokémiai vizsgálat a Herceptin klinikai vizsgálataiba beválasztott betegek mindegyikénél kimutatta a HER2 fehérje emelkedett expresszióját. A betegek akkor voltak beválaszthatók a Herceptin kezelésbe, ha a tumor 2+ vagy 3+ szinten mutatta a HER2 fehérje emelkedett expresszióját (a 0 3+ skálán, ahol 3+ a legmagasabb szint). E vizsgálatok alcsoport-elemzésének eredménye azt mutatta, hogy azok a betegek, akiknek a szövetei erısen pozitívak (3+) voltak a HER2 fehérje emelkedett expressziója szempontjából, nagyobb mértékben részesültek a Herceptin elınyeibıl, mint azok, akiknek a szövetei gyengén pozitívak (2+) voltak. A HER2 fehérje emelkedett expressziójának mértéke potenciálisan fontos elırejelzıje a Herceptin kezelés hatékonyságának. Mivel a Herceptin vizsgálataiban részt vett egyik beteg sem a HercepTest alapján lett beválasztva, a pozitivitás mértékének és a Herceptin kezelés klinikai elınyeinek korrelációja nem ismert. Összehasonlító vizsgálatok A HercepTest jellemzésére két vizsgálatot végeztünk. 1) Összehasonlítás a klinikai vizsgálattal (CTA) 2) A pontosság öt további vizsgálattal összehasonlítva. Összehasonlítás a klinikai vizsgálattal (CTA) A HercepTest -et összehasonlítottuk a CTA-val a Herceptin terápiába beválasztható betegek azonosítása szempontjából 274 darab HER2 fehérje pozitív (2+ vagy 3+) és azonos számú HER2 fehérje negatív emlırák-szövet mintán. A 4. táblázat mutatja az eredményeket 2 x 2 -es diagramban, ahol 0 és 1+ negatívnak, 2+ és 3+ pozitívnak tekintett eredmény. 4. táblátzat. A HercepTest és a CTA 2 x 2 -es konkordanicamátrixa (minták száma). Klinikai vizsgálat Pozitív Negatív Összesen HercepTest Pozitív 216 59 275 Negatív 58 215 273 Összesen 274 274 548 (128387-001) P04087HU_01_K520721-2/2015.05 old. 20/51