A VÉR ÉLETTANA A vér, mint speciális kötıszövet, sejtekbıl és sejtközötti állományból áll. Ez utóbbi a vérplazma, míg a sejtek a vér alakos elemeit alkotják. A vérplazma 90%-a víz. Valódi és kolloidális oldott állapotban tartalmaz gázokat, elektrolitokat, bomlástermékeket, tápanyagokat, hormonokat. Fontosabb ionjai: Na +, K +, Cl -, Ca 2+, Mg 2+, HCO - 3. Nagy molekulájú anyagai a plazmaproteinek, immunglobulinok, glükoproteidek, szteroidok. A vérplazma fehérjéit három csoportba soroljuk a fibrinogén (kb.5%), albuminok (kb. 60%) és a globulinok (35%). A vérplazmában különbözı fehérje bomlástermékek, zsírok, lipoidok (koleszterin), monoszacharidok, tejsav, különbözı hormonok, alkohol, oxigén és széndioxid is található. A fibrinogén a véralvadásban játszik fontos szerepet. Az albumin viszonylag kis molekulasúlyú fehérje, a vér ozmotikus koncentrációjának fenntartásában, illetve tartalék fehérjeként jelentıs. A globulinok (α, β és γ) különbözı anyagok transzportfolyamataiban, illetve a szervezet védekezésében fontosak. Termelıdésük fokozódásával a szervezet védekezı képessége megnı a fertızı betegségekkel szemben. A vér alakos elemei a vértérfogat 45%-át adják. A sejtes elemek és a vérplazma aránya a hematokrit érték, ami férfiakban 42-47%, nıkben 38-45 %. A vörösvértestek (erythrocyta) emlısökben magvatlan sejtek, innen van a vörösvértest elnevezés. A vörösvérsejtképzés a vöröcsontvelıben történik, melynek intenzitását egy, a vesében termelıdı hormon az erythropoetin szabályozza. A hormon oxigényhiány (hypoxia) hatására termelıdik és a véráram útján jut el a vöröscsontvelıbe. A vörösvértestek mérete kb. 7 µm. Számuk férfiakban 5,0-5,5 millió/mm 3, nıkben 4,5-4,8 millió/mm 3. A normál értéknél alacsonyabb vörösvértest szám esetén vérszegénységrıl beszélünk. A fehérvérsejtek (leukocyták) festékanyagot nem tartalmazó, magvas sejtek. Számuk 1 mm 3 vérben 6000-8000. Felosztásuk történhet annak alapján, hogy a sejtek plazmájában található-e szemcse (granulum) vagy sem. Ennek alapján a fehérvérsejtek lehetnek szemcsézetlen plazmájú agranulocyták és szemcséket tartalmazó granulocyták. A 86
szemcsézetten belül - festıdésük alapján - neutrofil, bazofil, illetve eozinofil granulocytákat lehet elkülöníteni. Az agranulocyták további két alcsoportra, a lymphocytákra és a monocytákra oszthatók. A vérlemezkék (thrombocyták) magvatlan 2-4 µm nagyságú tojásdad formájú plazmatörmelékek. Számuk 150000-300000/mm 3, élettartamuk 9-11 nap. Szerepük a véralvadásban jelentıs. A kísérletekhez szükséges vért a különbözı fajokból az alábbi módszerekkel nyerhetünk. 1. Vérvétel nyúlból Nyúlból a fül széli vénájából nyerhetünk vért. A véna fölött a bırt xilolba vagy toluolba mártott vattával bedörzsöljük, ezáltal az ér kitágul, jól kidomborodik. A tőt a fül hegye irányában a vénába vezetjük, óvatos szívással néhány ml vért nyerhetünk. Kisebb mennyiségő vért vehetünk olyan módon, hogy a vízszintesen tartott fül vénáját megszúrjuk, és a kifolyó vért Hagedorn pipettába szívjuk. 2. Vérvétel emberbıl (ld. etikai szabályok emberre vonatkozó része) Kis mennyiségő vért legegyszerőbben ujjbegybıl vehetünk. A bal kéz középsı ujját zsíroldó, fertıtlenítı oldattal bedörzsöljük, majd annak elpárolgása után steril tővel 3-4 mm mélységig megszúrjuk. Az elsı vércseppet letöröljük, a továbbiakat használhatjuk kenetkészítéshez, vérsejtszámláláshoz, stb. Nagyobb mennyiségő vért a vena cubitibıl nyerhetünk. Ezt a mőveletet azonban csak megfelelı egészségügyi szakképesítéssel rendelkezı személy végezheti. A vér alvadását megakadályozhatjuk, ha a levett vért alvadásgátlóval (pl. 3,8 % Na-citráttal) 1 : 4 arányban keverjük. A vörösvérsejtek süllyedési sebességének mérése Anyagok és eszközök: Westergreen csı, vér A vizsgálatot alvadásgátolt vérrel végezzük. Fecskendı segítségével az 1 : 4 arányú citrátos vért (1 rész 3,8% Na-citrát és 4 rész vér) Westergreen pipettába (1. ábra) fecskendezzük a 0 jelig. (a pipetta 300 mm hosszú, a 0 jel a pipetta aljától 200 mm-re van.) A vért tartalmazó pipettát gumi alátét segítségével Westergreen 87
állványba helyezzük. A vörösvérsejtek nagyobb fajsúlyuk miatt süllyedni kezdenek, így a véroszlop a fölötte lévı plazmától jól elkülöníthetı. A vörösvérsejtoszlop magasságát 1 és 2 óra múlva leolvassuk, és a két érték átlaga adja a vérsüllyedést. 1. ábra: Westergreen állvány, Westergreen csövekkel A süllyedés normál értéke férfiakban 2-6 mm, nıkben 3-10 mm/óra. A plazmaglobulinok mennyiségének szaporodásával járó állapotok növelik a vérsejtsüllyedést (terhesség, akut és krónikus fertızés, daganatos megbetegedések), mert a globulinok a vörösvérsejtek felszínén adszorbeálódnak, és azok agglutinációját segítik elı. A süllyedési sebesség fokozódása az albumin/globulin arány megváltozását jelzi. A normális albumin% / globulin% fehérje kvóciens értéke 1,5. A vér fajsúlyának mérése Anyagok és eszközök: rézszulfát (CuSO4 Ms: 159,6g), desztillált víz, kémcsövek, szemcseppentı Az emberi vér, a plazma ill. a vérsejtek átlagos fajsúlya 1,0595, 1,0269 ill.1,0964 (SI: 1059, 1026 ill. 1096 kg/m 3 ). A plazma fajsúlya a plazma fehérjetartalmától függ, a vér és a plazma fajsúlyviszonyából pedig a vér 88
hemoglobin tartalmára lehet következtetni (ld. a 2. ábra nomogrammját). Ezért a Phillips és munkatársai által kidolgozott, egyszerően végrehajtható fajsúlymeghatározási eljárásnak nagy gyakorlati jelentısége van. A módszer azon a jelenségen alapul, hogy ha fehérjetartalmú oldatot rézszulfát oldatba cseppentünk. A csepp felszínén réz-proteinát-réteg képzıdik, amely 10-20 másodpercre megakadályozza a folyadékcserét a csepp belseje és az oldat között, melynek hatására a vércsepp szilárd testként viselkedik. Ha a csepp fajsúlya az oldatéval megegyezik, 10-20 másodpercig lebeg. Ha könnyebb felszáll, ha nehezebb lesüllyed. Az eljárás kivitelezéséhez réz-szulfát-oldatsorozatot készítünk, és megkeressük azt az ismert fajsúlyú oldatot, amelyben a vér ill. plazmacsepp lebeg. A rézszulfát oldatsorzatot 1,1 fajsúlyú törzsoldat hígításával készítjük. A törzsoldathoz 170g kristályos rézszulfátot 1002 ml vízben oldunk fel. Az így kapott oldat fajsúlya 1,1. Adott fajsúlyú oldatok készítésének módját az 1. táblázat tartalmazza. Pl. 1.040-es fajsúlyú oldathoz 3,9 ml CuSO 4 oldatot mérünk ki, majd ezt desztillált vízzel 10 ml-re feltöltjük. fajsúly 1,030 1,040 1,050 1,060 1,070 CuSO 4 (ml) 2,9 3,9 4,9 5,9 6,9 H 2 O (ml) 7,1 6,1 5,1 4,1 3,1 1. táblázat: A különbızı fajsúlyú oldatok elkészítésének táblázatos mennyisége Az alvadásgátolt vért fecskendıbıl vagy szemcseppentıbıl kb. 1 cm magasságból az 1,060 fajsúlyú oldatba cseppentjük. Ha a csepp felszáll alacsonyabb, ha lesüllyed magasabb fajsúlyú oldattal folytatjuk a vizsgálódást, amíg meg nem találjuk azt az oldatot, amelyben a csepp lebeg. Ennek a fajsúlya megegyezik a vér fajsúlyával. Centrifugálás után ugyanezt az eljárást megismételjük a plazmával. Itt az 1,020 ill. az 1,030 fajsúlyú oldatokkal kezdjük az eljárást. A szérum fehérjetartalmának meghatározása Plazmafehérje meghatározás fajsúly alapján A fajsúly és fehérjetartalom közti összefüggést a 2. ábrán látható nomogrammból lehet leolvasni. 89
2. ábra: Nomogramm a vér fajsúlyának Phillips Van Slyke-féle meghatározásához A plazma fehérjetartalma és a fajsúly összefüggését a következı egyenlet adja meg: g % fehérje = (fajsúly 1,007) x k A k faktor értéke: 360. A szérumfehérjék elválasztása elektroforézissel Az emberi plazmafehérjék mennyisége 60-84 g/l. Ebbıl 35-50 g/l az albuminok mennyisége. Régebben kisózással tudták az albumint a többi plazmafehérjétıl, a globulin frakciótól elkülöníteni. Ma az egyszerőbb és gyorsabb elektroforézis módszerét használják, amellyel a plazmafehérjék albumin, és számos globulin frakcióra különíthetık. A módszer lényege, hogy a fehérjék elektromos térben töltésüknek megfelelıen elmozdulnak. A vándorlási sebességet az oldat ph-ja, valamint a fehérjék izoelektromos pontja határozza meg (3. ábra). Mennél nagyobb a kettı közti eltérés, annál gyorsabb a vándorlás. 90
COOH NH 3 + kation anion 0 ph 14 COO- NH 2 3. ábra: A fehérjék amfoter karaktere A gyakorlatban az elválasztást ph 8,0 feletti pufferban végzik. Ilyenkor az alacsony izoelektromos pontú albumin vándorol a leggyorsabban az anód felé. A közel azonos izoelektromos pontú fehérjék közel azonos sebességgel vándorolnak és közel azonos helyen sőrősödnek. Igy a globulinoknak négy frakciója különíthetı el, amelyeket görög betővel jelölünk. α1, α2, β és γ globulinok (4. ábra). 4. ábra: Szérumfehérjék elektroforetikus elválasztása Az elektroforézis történhet szabadon ill. oldatban, vagy sokkal gyakrabban, speciális hordozó segítségével. Ilyenkor a fehérjeoldatot hordozóra viszik, és elektromos térben futtatják. Hordozóként használhatnak papírt, cellulóz-acetát membránt, poliakrilamid, agar- vagy keményítı gélt. A futtatás befejeztével Coomassie-festékbe áztatjuk a gélt, amelyben rövid idın belül láthatóvá válnak a fehérje frakciók. A festési eljárások denzitometriás ill. fotometriás méréssel kombinálva mennyiségi vizsgálatokra is felhasználhatók. A különbözı csíkok által 91
kötött festék mennyisége arányos a zónákban található fehérjemennyiséggel. Az egyes fehérjefrakciók relatív koncentrációja az emberi szérumban az alábbi táblázat szemlélteti. frakció régi egység SI egység albumin 52-65 % 35-50 g/l α1 globulin 2,5-5 % 1,4-3,2 g/l α 2 globulin 7-13 % 4,2-7,7 g/l β globulin 8-14 % 5,6-8,8 g/l γ globulin 12-22 % 9,1-14,7 g/l 2. táblázat: Plazmafehérjék százalékos eloszlása A vörösvérsejtek ozmotikus viszonyainak vizsgálata Anyagok és eszközök: NaCl Ms: 58,44g, desztillált víz, dietiléter, kémcsövek, fızıpoharak, fénymikroszkóp A vörösvérsejtek membránja féligáteresztı hártya, a víz és a benne oldott sók ionjai számára szabadon átjárható. A vérplazmánál nagyobb ozmotikus koncentrációjú (hiperozmotikus) oldatba helyezve vizet veszítenek, ezért zsugorodnak. A plazmánál hígabb, (hipozmotikus) oldatban a vízfelvétel miatt megduzzadnak, majd memránjuk felreped, és tartalmuk kifolyik. Ez a jelenség a vörösvérsejtek hemolízise. Hemolízis bekövetkezhet a membránt károsító anyagok pl. szerves oldószerek hatására is. Tegyünk egy csepp vért az alábbi oldatokba: 1. humán fiziológiás (0,9 %-os) NaCl oldat 2. 0,4 %-os NaCl oldat 3. desztillált víz 4. 3 %-os NaCl oldat 5. néhány csepp étert vagy benzint tartalmazó fiziológiás sóoldat Vizsgáljuk meg az oldatok színét, majd mikroszkóp segítségével a vérsejtek alakját. Megfigyelés: A fiziológiás sóoldatban változást nem tapasztalunk. A 0,4 %- os sóoldat színe a vérsejtek duzzadása miatt valamivel sötétebb lesz, a vérsejtek 92
alakja gömbölyőre duzzad. A 3 %-os sóoldat a vérsejtek zsugorodása miatt valamelyest világosabb lesz, a vérsejtek alakja buzogányfejre emlékeztet. A desztillált víz és az étert vagy benzint tartalmazó oldat a vérsejtek hemolízise miatt átlátszó, lakkfesték jellegő vörös színt mutat. A vörösvérsejtek ozmotikus rezisztenciájának meghatározása Anyagok és eszközök: NaCl, desztillált víz, kémcsövek A vérplazma ozmotikus koncentrációjánál hígabb oldatban a vörösvérsejtek megduzzadnak, majd hemolizálnak. Minél hígabb oldatban következik be a hemolízis, annál nagyobb a vérsejtek ozmotikus rezisztenciája. Az ozmotikus rezisztenciát azzal a legkisebb NaCl koncentrációval jelöljük, amelynél a vörösvérsejtek még éppen nem hemolizálnak. Ez az érték a minimális rezisztencia. Az az oldatkoncentráció amelynél a hemolízis teljessé válik, a maximális rezisztencia értéke. Az elıbbi értéke egészséges embernél 0,46-0,42 %-os, az utóbbi 0,34-0,30 % NaCl oldatnak felel meg. Tíz kémcsıbe mérjünk 4-4 ml 0,70, 0,65, 0,60, 0,55, 0,50, 0,45, 0,40, 0,35, 0,30, 0,25 % NaCl oldatot! Az oldatokat 1 % NaCl törzsoldat hígításával készítjük a 3. táblázatban leírt módon. Ezután minden kémcsıbe 1-1 csepp vért cseppentünk. Összerázzuk a kémcsövek tartalmát, majd két óra hosszat állni hagyjuk. % 0,70 0,65 0,60 0,55 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 1% NaCl 2,8 2.6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 H 2 O 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3. táblázat: A különbözı ozmotikus koncentrációjú oldatok elkészítésének táblázatos mennyisége Míg azokban a kémcsövekben amelyekben bekövetkezett a hemolízis, a folyadék pirosra festıdik. Kezdıdı hemolízis esetén a felülúszó sárgás színő. Ennek az oldatnak a koncentrációja adja meg a minimális rezisztencia értékét. Annak a kémcsınek a NaCl koncentrációja, amelyben üledék nem látható, és az oldat színe vörös, a maximális rezisztencia értékét adja meg. A 93
vörösvérsejtmembrán anyagcserezavarok vagy genetikai okok miatt bekövetkezı károsodása mindkét ozmotikus értéket magasabb NaCl koncentráció felé tolja el. A vér hemoglobin tartalmának meghatározása Anyagok és eszközök: Drabkin reagens (1000 ml: 0,2g kálium ferricianid (K 3 Fe(CN 6 ), 0,05g kálium-cianid (KCN), 0,14g kálium-hidrogén-karbonát (KHCO 3 ), desztillált víz), spektrofotométer A hemoglobin koncentráció változásai összefüggenek a hematokrit, illetve vörösvérsejtszám változásaival. A hemoglobin koncentráció fokozódik a vörösvérsejtszám bármilyen okból történı növekedése, vagy a plazmavíz mennyiségének csökkenése esetén. Az anémiák bármelyik formája, illetve a plazmavíz térfogatának növekedése a hemoglobintartalom csökkenését vonja maga után. A vér hemoglobin tartalmának normál értékei: férfiban: 140-180 g/l, nıben: 120-160 g/l. A vér teljes hemoglobin koncentrációja meghatározható, ha a vér teljes hemoglobin tartalmát kálium-ferricianid hozzáadásával methemoglobinná (hemiglobin) alakítjuk, majd káliumcianid hozzáadásával cián-hemoglobinná alakítjuk át, amelynek fényelnyelési maximuma 540 nm-en mérhetı. Az oldatot ph 7 körüli értéken kell tartani. Savas közegben ugyanis HCN (ciánhidrogén) gáz szabadul fel, ami az egyik legerısebb méreg. A Drabkin oldat fényérzékeny, ezért sötét üvegben kell tárolni. Mivel a kálium-cianid erısen mérgezı, ügyeljünk arra, ne hogy fölszívjuk, vagy a bırünkre kerüljön. Pipettázni csak ballonnal szabad! Kémcsövekbe 5 ml Drabkin reagenst mérünk, majd 20 µl vért pipettázunk ismételt bemosással a reagenshez (a pipettára kívülrıl rátapadt vért letöröljük). Vakpróbaként az oldatot használjuk, vér nélkül. A vért tartalmazó mintát jól összerázzuk, majd 15 perc állás után 540 nm-en fotometráljuk. A hemoglobin koncentráció megállapítása pontosan ismert hemoglobin tartalmú, hasonlóan kezelt vér (standard vér) extinkciójával való összehasonlítás alapján történik. A standard vér hemoglobin tartalmának meghatározása történhet a vastartalom mérése, vagy az oxigénkapacitás meghatározása alapján. 94
Kevésbé pontos, de tájékozódó vizsgálat céljára elfogadható, ha a standard oldat extinkcióját 0,4-nek vesszük,amely 149 g/l hemoglobintartalomnak felel meg. Ennek alapján a meghatározni kívánt vér hemoglobin tartalma a következı képlet segítségével számítható ki: E minta Hb. konc. g/l = x 149 ( g/l ) Estandard Hemoglobin koncentráció emelkedés csontvelıi erytropoesis hormon fokozódása (hypoxia, vörösvérsejt daganatos burjánzás), illetve plazmavíz csökkenés (exsiccosis) esetén történhet. Csökkenés különbözı anémiákban, illetve plazmavíz térfogat emelkedés során alakulhat ki. A vér kémhatásának meghatározása Anyagok és eszközök: ph-mérı, ph-papír, desztillált víz A gyakorlat kombinált üvegelektróddal vagy erre a célra használatos ph papírral történik (5. ábra). A ph-mérı készülék üvegelektródját desztillált vízzel alaposan lemossuk, a nedvességet szőrıpapírral leitatjuk. Az üvegelektródot ph 4- es oldatba merítjük, majd a készülék mutatóját ph 4 értékre állítjuk. Az oldatból kivéve desztillált vízzel alaposan lemossuk, majd a mőveletet ph 9-es oldattal is elvégezzük. A készülék kalibrálása után az elektródot a vizsgálni kívánt oldatba merítjük, majd a mért értéket leolvassuk. (a humán vér fiziológiás normál értéke: ph=7,35-7,45). Használat befejeztével az üvegelektródot híg sósavba merítve tartjuk. 95
5. ábra: Kémhatás mérésére alkalmas digitális készülék, illetve hagyományos indikátor papír Vérzési idő meghatározása emberen Anyagok és eszközök: steril injekcióstő, stopper óra, 96%-os etanol Az ujjbegyet fertıtlenítjük és kb. 2 mm mélységig megszúrjuk. A vérzési idıt stopper órával mérjük úgy, hogy a megjelenı vércseppeket 20 másodpercenként leitatjuk mindaddig, amíg a sebbıl vér szivárog. A normális vérzési idı 2-3 perc, 5 percen túl kórosnak tekintjük. A vérzési idı függ az érreakcióktól, a trombociták számától és mőködésétıl, valamint a szöveti tromboplasztin aktivitás mértékétıl. A vérzési idıt egyebek közt a hı, egyes kigyómérgek (vipera mérge), hipertóniás só gyorsítja. A vérzési idı jóval rövidebb, mint az alvadási idı, mert a vérzés megállításában az alvadáson kívül egyéb tényezık (pl. érszőkület) is szerepet játszanak. Az alvadási idő meghatározása Anyagok és eszközök: steril injekcióstő, parafinozott óraüveg, üvegpálca, üvegkapilláris, stopper óra, 96%-os etanol 96
Ujjbegybıl vett vért (3-4 csepp) parafinozott óraüvegre cseppentünk. Húsz másodpercenként vékony üvegpálcát húzunk a vércseppen keresztül. A vérvételtıl az elsı fibrinszál megjelenéséig eltelt idıt mérjük. Mérjük meg a vér alvadását szobahımérsékleten és 37 C-on. Az alvadási idı meghatározását elvégezhetjük úgy is, hogy 10 cm hosszú üvegkapillárisba ujjbegybıl vett vért szívunk, majd 1/2 percenként 5 mm hosszú darabokat törünk belıle. Az alvadási idıt az az idıpont adja meg, amikor a letörés helyén fibrinszálakat észlelünk. Egészséges ember vérének alvadási ideje 5-10 perc, mely a hımérséklet emelkedésével rövidül. Az alvadási idı elsısorban a véralvadás belsı útjáról (intrinsic út) ad felvilágosítást. A vörösvérsejtek vizsgálata A vörösvérsejtszám meghatározása Anyagok és eszközök: tárgylemezek, steril injekciós tő, Melangeur-pipetta (nagy, piros keverıvel), Bürker-kamra, Hayem-olda t (0,5 % NaCl, 2,5 % Na2SO4, 0,025 % HgCl 2 ), 96%-os etanol Ujjbegybıl vett vért 100-200 szoros hígítás után számlálókamrába cseppentünk, és a vérsejteket mikroszkóp alatt megszámoljuk. A vörösvérsejtszám az 1 mm 3 (1 µl) vérben lévı vörösvérsejtek száma. A hígítást kétféle módon végezhetjük: A klasszikus módszer szerint, keverı (Melangeur) pipetta segítségével szívjuk fel a vért, a piros gyöngyöt tartalmazó pipetta 0,5 (200 x-os hígítás ) vagy 1-es jeléig (100 x-os hígítás). A meniszkuszt pontosan beállítjuk, majd a 101-es jelig Hayem oldat szívunk fel. A Hayem oldat hipertóniás, a vörösvérsejtek zsugorodását okozza, így megakadályozza összetapadásukat. A gumicsövet a pipettáról levesszük, és a pipetta két végét ujjainkkal befogva a tartalmát jól összerázzuk, majd néhány cseppet kifújunk belıle. Hegedős módszere szerint egy kis üvegedénybe a kívánt hígítás mértékétıl függıen 9,9 ml (100 x-os), vagy 9,95 ml (200 x-os) Hayem oldatot készítünk elı, majd Hagedorn pipettával 0,1 ml vagy 0,05 ml vért szívunk fel és többszöri 97
átöblítéssel a hígítófolyadékba mossuk. A bemosás elıtt kívülrıl töröljük le a vért a pipettáról. Alapos összerázással egyenletes vérsejtszuszpenziót hozunk létre, amelybıl Pasteur pipettával juttatunk 1-1 cseppet a számlálókamrába. A vérsejtszámlálást Bürker kamrában végezzük (6. ábra). Ez egy különlegesen kialakított vastag tárgylemez, amelynek a középsı harmadán három üvegcsík fut keresztül, amelyek közül a középsı 0,1 mm-el alacsonyabb, mint a két szélsı. Az utóbbiakra speciális fedılemezt helyezünk, ami így egy 1/10 mm mély rést zár el. A középsı üvegcsík felsı és alsó részén meghatározott mérető négyzethálós beosztás van, amelyben a számlálás történik. 6. ábra. Bürker kamra A háló 1/5 mm élhosszúságú nagy és 1/20 mm élhosszúságú kis négyzetekbıl, valamint 1/5 x 1/20 mm élhosszúságú téglalapokbál áll. Miután a beosztást tartalmazó rés mélysége 1/10 mm, a háló vonalai meghatározott térfogatú mértani idomokat (kockákat és hasábot) határolnak, amelyeknek a térfogata kiszámítható. A kis kocka 1/20 x 1/20 x 1/10 = 1/4000 mm 3 a nagy kocka 1/5 x 1/5 x 1/10 = 1/250 mm 3, a hasáb 1/20 x 1/5 x 1/10 = 1/1000 mm 3 térfogatú. 98
7. ábra: Bürker kamra beosztása A hígított vérbıl 1-1 cseppet a megfelelıen elıkészített Bürker kamra fedılemezének széléhez cseppentünk. A vér a kapilláraktivitás következtében a fedılmez alá szívódik és egyenletesen kitölti a rendelkezésére álló teret. A fedılemezre és a két beosztott részt elválasztó vályúba került vért vattával itassuk ki. Mindkét rész 40-40 kis négyzetében megszámoljuk a vörösvérsejteket és kiszámítjuk az egy négyzetre esı átlagot. A vonalra esı sejtek közül csak a felsı és a baloldali vonalra esıket számoljuk. Ha 100X hígítást használtunk, az átlagértéket 400 000-el megszorozva megkapjuk az 1 µl vérben lévı vörösvérsejtek számát. (1/4000 mm 3 a kis kocka térfogata, a hígítás mértéke 100X. A 200X hígításnál a szorzószám értelemszerően 4000 200). Figyeljünk arra, hogy az alsó és jobb oldali vonalakat érintı sejteket (az ábrán fekete) ne számoljuk (8. ábra). 8. ábra. A vörösvérsejtek számolásának sémás rajza 99
Valamivel gyorsabb az a módszer, amelyiknél 10 hasábban számoljuk meg vörösvérsejteket, melyeknek összegét 100X hígításnál 10000-el, 200X hígításnál 20000-el szorozzuk meg. A vörösvértest-térfogat (MCV) meghatározása A vörösvérsejtek átlagos térfogata (mean corpuscular volume, MCV) megadható a vér hematokrit, illetve a vörösvérsejtszám ismeretében. MCV= hematokrit \ vörösvérsejtek száma egységnyi térfogatban Az MCV mértékegysége a vörösvérsejtszám vonatkoztatott egységétıl függ. Példa: ha a mért vörösvérsejtszám 5 millió /µl= 5*10 12 /l; a vér hematokrit értéke= 0,42, azaz 1 liter vérben a vörösvérsejtek térfogata 0,42 / l MCV= 0,42 / 5*10 12 /l = 84*10-15 l = 84 fl Az érték normál tartománya: újszülöttnél 95-193 fl, csecsemınél 100-120 fl, felnıtteknél 82-92 fl. Felnıtteknél 94 fl-t meghaladó érték macrocytosisra (pl. B 12 vitaminhiány), 80 fl alatti érték microcytosisra (pl. vasszintézis zavara) utal. A vörösvértestek átlagos hemoglobin-tartalma (MCH) A vörösvértestek átlagos hemoglobin-tartalma (mean corpusular haemoglobin, MCH) a vér hemoglobin koncentrációjának és a vörösvértestszámnak a hányadosa fejezi ki: MCH = hemoglobin koncentráció (g/l) / vörösvértestszám (sejt /l) Példa: ha a vörösvértestszám = 5 millió /µl= 5*10 12 /l; a vér hemoglobintartalma = 150 g/l vér MCH = 150 g/l / 5*10 12 /l = 32*10-12 g = 32 pg Az érték normál tartománya: 28-36 pg. Az MCH növekedése mindig macrocytosist jelent. A vörösvértestek átlagos hemoglobin-koncentrációja (MCHC) Az vörösvértestek átlagos hemoglobin-koncentrációja (mean corpuscular haemoglobin concentration, MCHC) a vér hemoglobin koncentrációjából, illetve a hematokrit értékbıl számítható. MCHC = hemoglobin koncentráció (g/l) / hematokrit 100
Az eredmény dimenziója g hemoglobin /l vörösvértest. Példa: ha a hemoglobinkoncentráció = 144 g/l; a vér hematokrit értéke = 0,45 MCHC = 144g/l / 0,45 = 320 g/l vörösvértest Az érték normál tartománya: 310-360g hemoglobin /liter vörösvértest. Az MCHC értéke gyakorlatilag nem emelkedik a normál érték fölé, mert a a vörösvértest hemoglobinnal telített. Fehérvérsejt számolás Anyagok és eszközök: tárgylemezek, steril injekciós tő, Melangeur-pipetta (kicsi, fehér keverıvel), Bürker-kamra, Türk-oldat (0,5 % ecetsav oldat metilénkékkel színezve), 96%-os etanol A fehérvérsejt számolás a vörösvérsejt számoláshoz hasonló módon történik. Az ujjbegybıl vett vért a kisebb, fehér gyöngyöt tartalmazó Melangeur pipetta 1-es jeléig szívjuk fel, majd Türk oldattal hígítunk, amelyet a 11-es jelig szívunk fel. A Türk oldatban (hipotóniás oldat) a vörösvérsejtek hemolizálnak, a fehérvérsejtek magvai pedig megfestıdnek, így könnyen láthatóvá válnak. Hegedős eljárása szerint 0,05 ml vért 0,95 ml, vagy 0,1 ml vért 0,9 ml Türk oldatba pipettázunk. A hígítás mértéke az elıbbi esetben 20X, az utóbbiban 10X. A hígított vérbıl a vörösvérsejt számolásnál leírt módon a Bürker kamrába cseppentünk 1-1 cseppet, és mindkét beosztott részen 20-20 nagy négyzetben megszámoljuk a fehérvérsejteket. A számolt mennyiség átlagát 2500-al, vagy 5000- el megszorozva (1/250 mm 3 a nagy kocka térfogata, 10X, ill. 20X a hígítás mértéke) megkapjuk a fehérvérsejt számot 1 µl vérben. A gyors módszer szerint kis nagyítással beállítunk egy hármas vonalakkal határolt "nagy" négyzetet, melynek alapterülete 1 mm 2. A "nagy" négyzet területén leszámoljuk a fehérvérsejteket, ezt még kétszer megismételjük, átlagolunk, majd a kapott eredményt 10 ill. 20X hígítás esetén 100-al ill. 200-al szorozva megkapjuk a fehérvérsejt számot 1 µl vérben. A fehérvérsejt szám meghatározásának hibája 10-15 % ( +_ 1000). 101
A trombocitaszám meghatározása Reer-Ecker eljárással Anyagok és eszközök: tárgylemezek, steril injekciós tő, Hagedorn-pipetta, Wasserman-csı, Reer-Ecker oldat (3,8 % Na-citrát oldatot Löffler-féle metilénkék oldattal megfestve), Bürker-kamra, 96%-os etanol Wassermann-csıbe kimérünk 0,9 ml Reer-Ecker oldat és Hagedorn-pipetta segítségével 0,1 ml kapilláris vért pipettázunk bele. A keveréket szobahımérsékleten 1-2 óra hosszat állni hagyjuk, hogy a vörös- és fehérvérsejtek leülepedjenek. A folyadék felszínén kialakuló fehér plazmarétegben a trombociták feldúsulnak. Az ebbıl rétegbıl vett mintát cseppentjük az elıkészített Bürker kamrába. A számolást 10 téglalap felett végezzük, amelynek alapterülete egyenként 1/100 mm 2. A kapott sejtszám összegét 1000-el megszorozva kapjuk meg az 1 µl vérben lévı trombocitaszámot. A trombocitaszám normál értéke: 150 000-400 000/µl vér. A trombocitszám csökkenése (thrompocytopenia) létrejöhet a vérlemezkék fokozott pusztulása, felhasználása, illetve megnövekedett lép miatt, míg az emelkedés (thrombocytosis) számos betegség következményeként alakulhat ki. Festett vérkenet vizsgálata Anyagok és eszközök: tárgylemezek, steril injekciós tő, May-Grünwald oldat (1% eosinsavas metilénkék, metilalkohol, glicerin), Giemsa oldat (61% glicerin, 0,16% azur II, 0,6% azur II eosin 60 C-on oldva, 38,3% metilalkohol), immerziós lencse A vér alakos elemeinek morfológiáját, elıfordulási arányát festett vérkenetben vizsgáljuk. Cseppentsünk egy csepp vért alkohol-éter keverékben zsírtalanított tágylemezre. Egy másik tárgylemez rövidebb élét kb. 45 -os szögben helyezzük a vércsepp mögé úgy, hogy az a tárgylemez alatt szétterüljön, majd húzzuk végig a vízszintesen tartott lemezen. 102
a kikenés iránya vércsepp 9. ábra. A vérkenet készítése A kenet akkor jó, ha a vér vékony rétegben, egyenletesen vonja be a tárgylemezt. A kenetet száradni hagyjuk, majd közvetlenül, vagy festés után vizsgáljuk. A vérkenet festése Pappenheim szerint: egy nagy Petri csészébe tegyünk egy kisebbet és erre helyezzük a festendı lemezeket. Elıször May- Grünwald oldatot cseppentünk a kenetekre. Az oldat metilalkohol tartalma fixálja a készítményt, de festés csak vizes közegben jön létre, ezért 2-3 perc múlva a kenetre öntött festékhez kb. ugyanolyan mennyiségő vizet adunk, majd a hígított festéket 1-2 perc múlva leöntjük. Ezután frissen hígított Giemsa oldatot (3 csepp törzsoldat 1 ml vízhez) rétegzünk a lemezre és ezt kb. 10 percig rajta tartjuk. A festékoldatot desztillált vízzel, majd csapvízzel alaposan lemossuk. Immerziós olajat cseppentünk a kenetre és 100X objektív alatt vizsgáljuk a megfestıdött sejteket. 103
10. ábra: Festett vérkenetben megfigyelhetı fehérvérsejt típusok. A és D neutrofil granulocita (9-12 µm); B és E eosinofil granulocta (12-14 µm); C basofil granulocita (8-11 µm); F plazmasejt; G, H, I kis limfocita (6-8 µm); J, K, L monocita (12-20 µm) Karakterizáljuk a fehérvérsejteket a 9. ábra alapján és számoljuk meg az egyes típusokat. Mivel a sejtek eloszlása nem egyenletes, a kenet széli részein több nagy sejt (granulocita, monocita), a középsı részén pedig több limfocita van, a számolást kezdjük szélrıl és meander vonalban haladjunk közép felé (11. ábra). Összesen 100 sejtet számoljunk meg, így %-os megoszlásuk könnyen meghatározható. A normál értékeket a 4. táblázat foglalja össze. 104
. 10. ábra. A kvalitatív vérkép számolási technikája (meander vonalak) neutrofil granulocita 65-70 % eozinofil granulocita 2-4 % bazofil granulocita 0,5 % Monocita 4-8 % Limfocita 25-30 % 4. táblázat: Az emberi vér fehérvérsejtjeinek százalékos megoszlása Vércsoport meghatározás A vörösvérsejtek membránja számos agglutinogénnek nevezett antigént tartalmaz. Ezek közül legnagyobb gyakorlati jelentıséggel az AB0 vércsoportrendszer antigénjei, az A és B agglutinogén, valamint az Rh rendszer D agglutinogénje bírnak. Az ABO vércsoport meghatározása Anyagok és eszközök: tárgylemezek, steril injekciós tő, AB0 serotyp, 96%-os etanol Az A és B agglutinogének glikoprotein molekulák, amelyek jelenléte vagy hiánya alapján különböztetjük meg az A, B, AB és 0 vércsoportokat. A plazmában az A és B agglutinogénekre specifikus antitestek, agglutininek találhatók. Az A vércsoportú egyén plazmája anti B (α), a B vércsoportúé anti A (β) agglutinint, a 0 vércsoportúé mindkettıt, az AB egyiket sem tartalmazza. Az agglutininek a nekik megfelelı antigénekhez kapcsolódva a vörösvérsejtek összetapadását (agglutinációját) idézik elı, amit hemolízis követ. Ez következik be, ha véradásnál nem megfelelı, azaz inkompatibilis vért adnak. 105
A vércsoportmeghatározást ismert vércsoportú szérumokkal végezzük. Gondosan letisztított tárgylemez hátoldalát A, 0, B jelzésekkel látjuk el, és a színére cseppentjük a megfelelı savókat, amelyek antitesteket tartalmaznak. A savócseppekbe ujjbegybıl vett vért keverünk olyan módon, hogy egy tárgylemez három sarkát a vércseppbe mártva külön-külön elkeverjük a savócseppekkel, vigyázva arra, hogy egyik savót a másikba ne vigyük át. A vérsejtek azokon a helyeken csomósodnak össze, ahol a felszínükön lévı antigén a neki megfelelı antitesttel találkozik. A reakció szobahımérsékleten végezhetı és néhány perc múlva kiértékelhetı. tesztsavók: (A) (0) (B) anti B anti A anti B anti A AB A B 0 12. ábra. Vércsoportmeghatározás az AB0 rendszerben Rh vércsoport meghatározás Anyagok és eszközök: tárgylemezek, steril injekciós tő, anti-d savó, termosztát, 96%- os etanol Az Rh vércsoportrendszert 6 antigén alkotja, amelyek közül legerısebb a D agglutinogén. Ennek jelenléte vagy hiánya alapján sorolhatók az emberek Rh + vagy Rh - vércsoportba. A D agglutinogén ellen anti D agglutinin termelıdik, ha Rh - ember vérébe Rh + vérsejtek kerülnek. Az így termelıdött agglutininek a D + vérsejtek ismételt bejutásakor okoznak agglutinációt. Ez olyan terhességnél szokott elıfordulni, amikor Rh - anya másodszor, illetve többedszer is Rh + magzatot hordoz. Tisztított tárgylemezre három csepp anti D savót cseppentünk. Az egyik szélsı cseppbe biztosan Rh +, a másikba biztosan Rh - vért keverünk, míg a középsıhöz a vizsgálandó vér egy cseppjét tesszük. 106