For Use With the High Pure System

COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 For Use With the High Pure System IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 HCV HPS V2 48 teszt P/N: 04861817 190 High Pure System Viral Nucleic Acid Kit 48 teszt P/N: 03502295 001 FELHASZNÁLÁS MÓDJA A COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 For Use With The High Pure System (HPS) egy in vitro nukleinsav-amplifikációs vizsgálat a hepatitis C vírus (HCV) RNS 1 6 genotípusainak mennyiségi meghatározására humán szérumban vagy plazmában. A vizsgálat a manuális minta előkészítésre High Pure System Viral Nucleic Acid Kit-et, az automatizált amplifikálásra és detektálásra COBAS TaqMan 48 Analizátort használ. A vizsgálat a szérum vagy plazma HCV RNS-szintek változásának mérése által a klinikai megjelenéssel és egyéb laboratóriumi markerekkel együtt az antivirális kezelést követő virológiai válasz megállapításában nyújthat segítséget. Újabb adatok szerint a szérum/plazma HCV RNS-szintek korai változásai előre jelezhetik az interferonkezelésre adott hosszútávú választ 1. A COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 nem való vér vagy vérkészítmények HCVfertőzöttségének szűrésére, vagy diagnosztikus vizsgálatként HCV-fertőzés jelenlétének megerősítésére. A VIZSGÁLAT ÖSSZEGZÉSE ÉS MAGYARÁZATA A hepatitis C vírus a poszttranszfúziós non-a, non-b hepatitis esetek 90 95%-áért felelőssé tehető elsőrendű kóroki ágens 2-4. A HCV egyszálú, pozitív RNS-t tartalmazó vírus, amelynek genomja mintegy 3000 aminosavat kódoló megközelítően 10 000 nukleotidot tartalmaz. Mint vérrel terjedő vírus, a HCV vérrel és vérkészítményekkel átvihető. A vér HCV-szűrővizsgálatainak széles körű elfogadása jelentősen csökkentette a transzfúzióval kapcsolatos hepatitis kockázatát. A HCVfertőzés gyakorisága az intravénás kábítószer-használattal kapcsolatosan a legnagyobb, és kisebb mértékben egyéb percutan expozíciókkal kapcsolatosan 4. Immunszerológiai felmérések alapján a HCV-fertőzés globális elterjedtsége Európában 1,0%, Afrikában 5,3% 5. A HCV-fertőzött betegekben az anti-hcv antitestek megjelenése ezekre az ellenanyagokra specifikus immunszerológiai vizsgálatok kifejlesztéséhez vezetett. Ugyanakkor bár az anti-hcv antitestek jelenléte jelzi a korábbi HCV-fertőzést, jelen fertőzés markereként nem használható. Ráadásul a direkt kimutatás vírustenyésztéses módszerekkel szintén nem lehetséges. Az alanin-aminotranszferáz-szintek (ALT) mérése a HCV-fertőzés helyettes indikátorának tekinthető, de az nem a virémia közvetlen mérése. Az ALT-emelkedés mértéke nem korrelál közvetlenül a HCV-fertőzés szintjével. Tény, hogy ALT-emelkedést számos májgyulladás, egyebek között, de nem kizárólagosan, vírusos hepatitis okozhat. Ezzel szemben a HCV RNS polimeráz-láncreakcióval [Polymerase Chain Reaction (PCR)] történő nukleinsav-amplifikációs kimutatása és mennyiségi meghatározása lehetővé teszi az aktív virémia mérését 6-8. PCR használatával lehetővé válik a HCV-virémia kimutatása az immunológiai szerokonverziót megelőzően 9-10, továbbá az interferonterápiában részesülő antitest-pozitív krónikus HCV-fertőzött betegek vírusmennyiség-változásainak kimutatása 1. AZ ELJÁRÁS ALAPELVEI A COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 három fő lépésből épül fel: (1) manuális minta-előkészítés a HCV RNS extrahálására; (2) a target RNS automatizált reverz transzkripciója, azaz komplementer DNS (cdns) szintézise; (3) target cdns PCR-amplifikálás specifikus komplementer primerek segítségével, és a hasított kettős fluoreszcens festékkel jelölt oligonukleotid próbák szimultán kimutatása, amely lehetővé teszi a HCV target amplifikált termék (amplikon) mennyiségi meghatározását. 1

A master mix reagens a HCV RNS-re és a HCV mennyiségi standard RNS-re egyaránt specifikus primer párokat és próbákat tartalmaz. Az amplifikált DNS kimutatása targetspecifikus és mennyiségi standard-specifikus kettős-jelölt oligonukleotid próbák segítségével történik, amelyek lehetővé teszik a HCV amplikon és a HCV mennyiségi standard amplikon független azonosítását. A HCV RNS mennyiségi meghatározása során HCV mennyiségi standardot kell használni. A HCV mennyiségi standard egy nem fertőző Armored RNA konstrukció, amely a HCV RNS targethez és egy a HCV mennyiségi standard amplikon és a HCV-targetamplikon megkülönböztetését lehetővé tevő egyedi próbához kötődő régióval identikus primer kötő helyekkel bíró HCV-szekvenciákat tartalmaz. A HCV mennyiségi standard minden egyes mintához és kontrollhoz ismert kópiaszámban hozzáadásra kerül, majd a HCV targettel együtt a minta előkészítési, reverz transzkripciós, PCR-amplifikációs és kimutatási lépéseken keresztül megy. A COBAS TaqMan 48 Analizátor a vizsgálati mintákban levő HCV RNS-titert a HCV-szignálnak a HCV mennyiségi standard szignállal való összehasonlításával számolja ki minden egyes minta és kontroll esetén. A HCV mennyiségi standard kompenzálja a gátló hatásokat, és az előkészítési és amplifikációs folyamatok szabályozásával lehetővé teszi a HCV RNS pontos mennyiségi meghatározását valamennyi mintában. A targetszekvencia kiválasztása A target RNS-szekvencia kiválasztása a különböző HCV-genotípusok között a genomban maximálisan konzervált régiók azonosításán múlik 11,12. Az ismert HCV-genotípusok között a HCVgenom 5'-nem átírt szakasza a legnagyobb fokban konzervált RNS-szekvencia 13. A COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 a HCV-genom nagyfokban konzervált 5'-nem átírt szakaszán lévő szekvenciáknak megfelelő reverz transzkripciós és PCR-amplifikációs primereket használ. Minta előkészítése A COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 EDTA-s plazma- és szérummintákat dolgoz fel, és HCV RNS-t izolál egy üvegszálakhoz való nukleinsav kötődésen alapuló generikus manuális mintaelőkészítés révén. A HCV-víruspartikulumokat magas hőmérsékleten való inkubálás során roncsolják egy proteáz és egy olyan chaotrop roncsoló/kötő puffer segítségével, amely szabaddá teszi a nukleinsavakat, és megvédi a szabaddá tett HCV RNS-t a plazmában és a szérumban lévő RNázoktól. A HCV mennyiségi standard RNS molekulák ismert száma kerül a roncsolóreagenssel együtt hozzáadásra valamennyi mintához. Ezt követően izopropanol lesz a roncsoló keverékhez adva, majd egy üvegszálas szűrőbetétes oszlopon az egész lecentrifugálásra kerül. A centrifugálás során a HCV RNS és HCV mennyiségi standard RNS az üvegszálas szűrő felületéhez kötődik. A nem kötődött anyagok, mint sók, fehérjék és egyéb sejt eredetű szennyezések a centrifugálás révén eltávolításra kerülnek. Az adszorbeált nukleinsavak vizes oldattal kerülnek mosásra és eluálásra. Az egyszer használatos eszközök 12 minta, illetve ismétlés párhuzamos feldolgozását teszik lehetővé. A HCV RNS-t és HCV mennyiségi standard RNS-t tartalmazó feldolgozott minták az amplifikálási/detektálási keverékhez kerülnek hozzáadásra. A HCV target RNS és a HCV mennyiségi standard RNS amplifikálását és detektálását azután a COBAS TaqMan 48 Analizátor végzi el a teszt készletben biztosított amplifikálási és kimutatási reagensek segítségével. Reverz transzkripció és PCR-amplifikálás Reverz transzkripció A reverz transzkripciót, a PCR-amplifikálási és a kimutatási reakciókat a hőstabil rekombináns enzim, Thermus species Z05 DNS-polimeráz (Z05) segítségével végzik. Mangán (Mn 2+ ) jelenlétében, valamint megfelelő pufferviszonyok között a Z05 mind reverz transzkriptáz-, mind DNS-polimerázaktivitást mutat 14,15. Ez lehetővé teszi a reverz transzkripció, a PCR-amplifikálás és a kimutatás megtörténését ugyanazon reakcióelegyben. A feldolgozott mintákat amplifikációs csövekben (K-csövek) lévő amplifikáló keverékhez adják, ahol tehát mind a reverz transzkripció, mind a PCR-amplifikálás megtörténik. A reakcióelegyet fel kell hevíteni, hogy lehetővé váljon egy downstream primernek a HCV target RNS-hez és a HCV mennyiségi standard RNS-hez való specifikus kapcsolódása. Mn 2+ és dezoxinukleozidtrifoszfátok (dntps), azaz dezoxiadenozin-, dezoxiguanozin-, dezoxicitidin- és dezoxiuridintrifoszfátok feleslegének jelenlétében a Z05 polimeráz a kapcsolódott primerhez a target RNS-sel komplementer DNS szálat (cdns) szintetizál. 2

Targetamplifikáció A HCV target RNS és a HCV mennyiségi standard RNS reverz transzkripcióját követően a reakcióelegyet az RNS:cDNS hibrid denaturálása és a primer targetszekvenciák szabaddá tétele végett fel kell hevíteni. Ahogy az elegy kihűl az upstream primerek specifikusan kötődnek a cdnsszálhoz, a Z05 pedig a primerre egy második DNS-szálat szintetizál. Ezzel a PCR első ciklusa véget ért, a HCV RNS és a HCV mennyiségi standard RNS targetrégiójának egy kettős szálú DNS-másolatát létrehozva. A kettős szálú DNS szeparálása és a primer targetszekvenciák szabaddá tétele végett a reakcióelegyet újra fel kell melegíteni. Az elegy kihűlésével a primerek a target DNS-hez kapcsolódnak. A Z05 Mn 2+ és feleslegben lévő dntps jelenlétében a primerekre a targettemplátoknak megfelelően egy kettős szálú DNS molekulát szintetizál, amelyet amplikonnak hívnak. A COBAS TaqMan 48 Analizátor automatikusan a folyamatot adott számú cikluson keresztül ismétli, hogy az amplikon DNS-mennyisége ciklusonként megduplázódjon. A szükséges számú ciklus a COBAS TaqMan 48 Analizátorba előre be van programozva. Az amplifikálás a HCV-genomnak csak a primerek közötti régiójában zajlik; a teljes HCV-genom nem amplifikálódik. Szelektív amplifikálás A COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 a target-nukleinsav szelektív amplifikálását a mintából az AmpErase (uracil-n-glikoziláz) enzim és dezoxiuridin-trifoszfát (dutp) használatával éri el. Az AmpErase enzim felismeri és katalizálja az olyan DNS-szálak megsemmisítését, amelyek dezoxiuridint tartalmaznak 16, a dezoxitimidint tartalmazókét viszont nem. A dezoxiuridin a természetes DNS-ben nincs jelen, ugyanakkor az amplikonban mindig megtalálható, miután a master mix reagens a dntp-ok egyikeként dezoxiuridin-trifoszfátot használ; tehát csak az amplikon tartalmaz dezoxiuridint. A dezoxiuridinnak köszönhetően a szennyező amplikont az AmpErase enzim még a target RNS amplifikálását megelőzően lebontja. Továbbá bármilyen nem specifikus terméket, amely a master mix kezdeti mangán okozta aktiválódása után képződik, az AmpErase enzim lebont, javítva ezáltal a specificitást és az érzékenységet. A master mix reagensben lévő AmpErase enzim katalizálja a dezoxiuridint tartalmazó DNS hasítását a dezoxiuridin-csoportoknál úgy, hogy a dezoxiribóz lánc felnyílását okozza a C1 helyen. Az első hevítési lépésben az amplikon DNS-lánc eltörik a dezoxiuridin helyén, tehát a DNS nem lesz amplifikálható. Az AmpErase enzim 55 C felett, azaz a hevítési lépések során inaktív, azaz nem bontja le az amplifikálás során képződött targetamplikont. A PCR-termékek kimutatása COBAS TaqMan vizsgálat során A COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 valós idejű 17,18 PCR-technológiát alkalmaz. A kettős-jelölt fluoreszcens próbák használata biztosítja a PCR-termék halmozódásának valós idejű detektálását az amplifikálási folyamat során felszabaduló fluoreszcens jelzőfestékek emissziós intenzitásának monitorozása révén. A HCV-re és a HCV mennyiségi standardra specifikus oligonukleotidokból álló próbák egy jelző (reporter) és egy blokkoló (quencher) festékkel jelöltek. A COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 során a HCV és HCV mennyiségi standard próbák különböző fluoreszcens jelző festékkel vannak jelölve. Amikor a kettős fluoreszcens festékkel jelölt próbák érintetlenek, a jelzőfesték fluoreszcenciája Föster típusú energiatranszfer-effektus révén gátolt a blokkoló festék közelsége miatt. PCR során a próba hibridizál egy targetszekvenciával, és az 5' 3' nukleáz aktivitású hőstabil Z05 DNS polimeráz hasítja. Ha egyszer a jelző és blokkoló festékek felszabadulnak és különválnak, megszűnik a blokkolás, és a jelzőfesték fluoreszcens aktivitása megnő. A HCV RNS és a HCV mennyiségi standard RNS amplifikációja egymástól függetlenül, különböző hullámhosszokon van mérve. Ez a folyamat adott számú cikluson keresztül ismétlődik, minden egyes ciklusban jelentősen növekedve az adott jelzőfestékek emissziós intenzitása, ezáltal lehetővé téve a HCV RNS és HCV mennyiségi standard RNS független azonosítását. A szignálok intenzitása a PCR kezdetekor jelenlévő kiindulási anyag mennyiségével mutat összefüggést. A COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 mennyiségi meghatározás alapjai A COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 pontos kvantitatív eredményeket nyújt egy nagyon széles dinamikus tartományon, mivel az amplikon monitorozása az amplifikáció exponenciális fázisa során történik. Minél magasabb a minta HCV-titere, annál korábban emelkedik a HCV próba jelző festékének fluoreszcenciája az alap fluoreszcenciaszint fölé (lásd 1. ábra). Mivel a HCV mennyiségi standard (QS) RNS mennyisége állandó valamennyi mintában, a HCV QS próba 3

jelzőfestékének fluoreszcenciája valamennyi minta esetén ugyanazon ciklus során kell megjelenjen (lásd 2. ábra). Azokban az esetekben, ahol a QS amplifikálását és kimutatását gátlás vagy rossz mintavisszanyerés befolyásolja, a fluoreszcencia később jelenik meg, ezáltal lehetővé válik a HCV target RNS számított titerének megfelelő módosítása. A specifikus fluoreszcens szignál megjelenését kritikus küszöbértéknek nevezik. A kritikus küszöbérték definíció szerint az a tört alakú ciklus szám, amelynél a jelző festék fluoreszcenciája meghalad egy előre meghatározott küszöbértéket (a kijelölt fluoreszcencia szintet), és megkezdődik ezen szignál exponenciális növekedési fázisa (lásd 3. ábra). Egy magasabb kritikus küszöbérték a kiindulási HCV target RNS egy alacsonyabb titerét jelzi. Egy 2-szeres titeremelkedés a target HCV RNS kritikus küszöbértékének 1-gyel való csökkenésével korrelál, míg egy 10-szeres titeremelkedés a kritikus küszöbérték 3,3-del való csökkenésével korrelál. Az 1. ábra egy vírus hígítási sor target növekedési görbéit ábrázolja az 5-log 10 tartományon. Ahogy a víruskoncentráció nő, a növekedési görbék korábbi ciklusokra tolódnak. Emiatt a legbaloldalibb növekedési görbe a legmagasabb vírustiterszinthez tartozik, a legjobboldalibb növekedési görbe pedig a legalacsonyabb vírustiterszinthez tartozik. 1. ábra 45,00 Normalizált fluoreszcencia 40,00 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 Legmagasabb titer Legalacsonyabb titer 0 10 20 30 40 50 60 Ciklusszám A 2. ábra egy vírus hígítási sorból származó minták mennyiségi standard növekedési görbéit mutatja az 5-log 10 tartományon. A mintákhoz adott mennyiségi standard mennyisége állandó minden egyes reakcióban. A mennyiségi standard kritikus küszöbértéke a vírustitertől függetlenül hasonló. 2. ábra 12,00 Normalizált fluoreszcencia 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 A HCV titertől függetlenül hasonló HCV QS kritikus küszöbértékek Legalacsonyabb titer Legmagasabb titer 0,00 0 10 20 30 40 50 60 Ciklusszám A 3. ábra egy példát mutat be arra, hogyan történik az egyes növekedési görbék az összes ciklusban mért fluoreszcens értékeinek a normalizálása. A tört alakú ciklusszámot (kritikus küszöb) úgy határozzák meg, hogy hol keresztezi a fluoreszcens szignál a kijelölt fluoreszcenciaszintet. 4

3. ábra A HCV RNS MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁSA A COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 a HCV vírus RNS-t mennyiségileg meghatározza egy második targetszekvencia (HCV mennyiségi standard) felhasználásával, amely minden egyes mintához ismert koncentrációban hozzá van adva. A HCV mennyiségi standard egy nem fertőző olyan HCVszekvenciadarabokat tartalmazó Armored RNA konstrukció, amelyek a HCV-targetszekvencia kötő régióival identikus primer kötő régiókat tartalmaznak. A HCV mennyiségi standard ugyancsak egy ugyanolyan hosszúságú és bázisösszetételű amplifikációs terméket szintetizál, mint a HCV target RNS. A HCV mennyiségi standard amplikon kimutatási próbakötő régióját úgy módosították, hogy a HCV mennyiségi standard amplikon különbözzön a HCV-targetamplikontól. A COBAS TaqMan 48 Analizátorban a PCR annealing fázisa során, a mintákat szűrt fénnyel világítják meg és gerjesztik, és minden egyes minta szűrt emissziójú fluoreszcens adatait gyűjtik. A készülék ingadozásai miatt azután minden egyes minta leolvasási értékét korrigálják. Ezeket a fluoreszcens leolvasási adatokat küldi el a készülék az AMPLILINK szoftverhez, és tárolja egy adatbázisban. Előellenőrzések történnek annak meghatározására, hogy a HCV RNS és HCV mennyiségi standard RNS adatok érvényes sorokat mutatnak-e, és az előre beállított határokon kívül fekvő adatok jelzőket kapnak. Valamennyi előellenőrzés befejezése után a készülék a fluoreszcens leolvasásokat feldolgozza, és kritikus küszöbértékeket hoz létre a HCV RNS és a HCV mennyiségi standard RNS számára. A COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 mellé biztosított tételspecifikus kalibrációs állandókat használja a készülék a minták és kontrollok titerértékeinek kiszámításához a HCV RNS és HCV mennyiségi standard RNS kritikus küszöbértékek alapján. A COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 standardizálása HCV RNS NAT vizsgálatokra szolgáló második WHO Nemzetközi standarddal (NIBSC 96/798) 19 történt, és a titereredmények nemzetközi egység [International Unit (IU)]/ml-ben vannak kifejezve. REAGENSEK High Pure System Viral Nucleic Acid Kit 48 teszt (P/N: 03502295 001) LYS 2 x 25 ml (roncsoló/kötő puffer) trisz 52% guanidin HCl < 1% karbamid 20% Triton X-100 Xn 52% (w/w) guanidin HCl + Ártalmas CAR (RNS, liofilizált) Normalizált fluoreszcencia 2,80 2,60 2,40 2,20 2,00 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 Rögzített fluoreszcenciaszint Ct-érték = 17,4 0,80 8 10 12 14 16 18 20 22 Ciklusszám 2 x 2 mg 5

PK (proteináz K, liofilizált) 99% proteináz K, liofilizált Xn 99% proteináz K, liofilizált + Ártalmas IRB (gátlóanyag-eltávolító puffer) trisz 65% guanidin HCl Xn 65% (w/w) guanidin HCl + Ártalmas WASH (mosópuffer) trisz NaCl (adjon hozzá 50 ml etanolt és 30 ml ioncserélt vizet) ELB (eluáló puffer) RS (High Pure System Viral Nucleic Acid állvány készlet) roncsoló állvány szűrőcsőállvány rögzített hulladék állvánnyal eluáló állvány állványfedél fogók WR (High Pure System Viral Nucleic Acid hulladék állvány) COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 HCV HPS V2 (P/N: 04861817 190) Minta-előkészítő és kontroll reagensek HCV QS (COBAS TaqMan HCV mennyiségi standard) nátrium-foszfát puffer EDTA < 0,005% poli ra RNS (szintetikus) < 0,001% Armored RNA konstrukció, amely egy inzertet tartalmaz HCV primer kötő szekvenciákkal és egy egyedi próbához kötődő régióval (nem-fertőző RNS MS2 bakteriofágban) amarántvörös festék 0,1% Proclin 300 konzerváló Xi A proclin az 5-klór-2-metil-2H-izotiazol-3-on és a 2-metil- 2H-izotiazol-3-on (3:1) arányú keveréke Irritatív R43: Bőrrel érintkezve túlérzékenységet okozhat (szenzibilizáló hatású lehet). + 2 x 100 mg 1 x 33 ml 1 x 20 ml 1 x 30 ml 4 darab 8 darab 48 teszt 2 x 1,0 ml 6

HCV H(+)C, v2.0 [HCV magas (+) kontroll, 2.0-s verzió] < 0,001% HCV szekvenciákat tartalmazó Armored RNA konstrukció (nem fertőző RNS MS2 bakteriofágban) Negatív humán plazma, tesztekkel nem reaktív HCV antitestre, HIV-1/2 antitestre, HIV p24 antigénre és HBsAg-re; HIV-1 RNS, HCV RNS és HBV DNS PCRtechnikával nem kimutatható 0,1% Proclin 300 konzerváló Xi A proclin az 5-klór-2-metil-2H-izotiazol-3-on és a 2-metil- 2H-izotiazol-3-on (3:1) arányú keveréke + Irritatív R43: Bőrrel érintkezve túlérzékenységet okozhat (szenzibilizáló hatású lehet). 2 x 1,0 ml HCV L(+)C, v2.0 [HCV alacsony (+) kontroll, 2.0-s verzió] < 0,001% HCV szekvenciákat tartalmazó Armored RNA konstrukció (nem fertőző RNS MS2 bakteriofágban) Negatív humán plazma, tesztekkel nem reaktív HCV antitestre, HIV-1/2 antitestre, HIV p24 antigénre és HBsAg-re; HIV-1 RNS, HCV RNS és HBV DNS PCRtechnikával nem kimutatható 0,1% Proclin 300 konzerváló Xi A proclin az 5-klór-2-metil-2H-izotiazol-3-on és a 2-metil- 2H-izotiazol-3-on (3:1) arányú keveréke + Irritatív R43: Bőrrel érintkezve túlérzékenységet okozhat (szenzibilizáló hatású lehet). CTM ( ) C [COBAS TaqMan negatív kontroll (humán plazma)] Negatív humán plazma, tesztekkel nem reaktív HCV antitestre, HIV-1/2 antitestre, HIV p24 antigénre és HBsAg-re; HIV-1 RNS, HCV RNS és HBV DNS PCRtechnikával nem kimutatható 0,1% Proclin 300 konzerváló Xi A proclin az 5-klór-2-metil-2H-izotiazol-3-on és a 2-metil- 2H-izotiazol-3-on (3:1) arányú keveréke + Irritatív R43: Bőrrel érintkezve túlérzékenységet okozhat (szenzibilizáló hatású lehet). 2 x 1,0 ml 4 x 1,0 ml Amplifikációs és kimutatási reagensek HCV MMX (COBAS TaqMan HCV master mix) tricin puffer kálium-hidroxid kálium-acetát < 20% dimetil-szulfoxid glicerin < 0,001% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,001% upstream és downstream primerek a HCV 5'-nem átírt régióhoz < 0,001% fluoreszcens-jelzett oligonukleotid próba specifikus HCV-re és a HCV mennyiségi standardra < 0,05% Z05 DNS-polimeráz (mikrobiális) < 0,1% AmpErase (uracil-n-glikoziláz) enzim (mikrobiális) 0,09% nátrium-azid 2 x 24 teszt 2 x 1,4 ml 7

CTM Mn 2+ (COBAS TaqMan mangánoldat) < 1,2% mangán-acetát jégecet 0,09% nátrium-azid 2 x 24 teszt 2 x 1,0 ml FIGYELMEZTETÉSEK ÉS ÓVINTÉZKEDÉSEK A. IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. B. Ez a teszt nem való vér és vérkészítmények HCV-fertőzöttségének szűrésére, vagy diagnosztikus vizsgálatként HCV-fertőzés jelenlétének megerősítésére. C. A kalibrációs együtthatók értékei tételspecifikusak, valamint specifikusak a COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 For Use With The High Pure System vizsgálatra. Ezek az értékek esetleg nem érvényesek más minta-előkészítési módszerek alkalmazása esetén. D. Csak humán EDTA-s plazmamintákhoz és humán szérumhoz alkalmazható. E. Ne pipettázzon szájjal. F. Ne egyen, igyon vagy dohányozzon a laboratórium területén. Viseljen egyszer használatos védőkesztyűt, védőruhát és szemvédőt a minták és a készlet reagensei kezelése közben. A minták és a tesztreagensek kezelését követően gondosan mosson kezet. G. A reagensflakonokból való anyagkivétel során kerülje el a reagensek mikrobiális és ribonukleáz-szennyezését. H. Steril, egyszer használatos pipetták és RNáz-mentes pipettahegyek használata javasolt. I. Ne öntsön össze különböző tételekből, vagy azonos tételből, de különböző flakonokból származó reagenseket. J. Ne keverje a különböző készletekből származó reagenseket. K. A fel nem használt reagensek, hulladék és minták kezelésének összhangban kell lennie amegfelelő országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásokkal. L. Ne használja a készletet a lejárati idő után. M. Az anyagok biztonsági adatlapjai (MSDS) igény esetén hozzáférhetők a helyi Rocheirodában. N. A mintákat és kontrollokat fertőzőként kell kezelni a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 20 és az CLSI Dokumentum M29-A3 21 előírásoknak megfelelő biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva. Gondosan tisztítson meg, és ioncserélt vagy desztillált vízzel frissen készített 0,5% nátrium-hipoklorit oldattal fertőtlenítsen minden munkaterületet. Megjegyzés: A kereskedelemben kapható háztartási fehérítő rendszerint 5,25%-ban tartalmaz nátrium-hipokloritot. 1:10 arányban hígított háztartási fehérítő megfelel 0,5% nátrium-hipoklorit oldatnak. O. FIGYELMEZTETÉS: A CTM ( ) C, HCV L(+)C, v2.0 és HCV H(+)C, v2.0 emberi vérből származó humán plazmát tartalmaz. A forrás anyag tesztekkel vizsgálva nem bizonyult reaktívnak Hepatitis B felületi antigénre (HBsAg), HIV-1/2 és HCV antitestekre, valamint HIV p24 antigénre. A negatív humán plazma PCR-technikával történő vizsgálata során HIV-1 RNS, HCV RNS vagy HBV DNS nem volt kimutatható. Egyetlen vizsgálati módszer sem nyújthat teljes garanciát arra, hogy a humán vérkészítményekben nincs jelen fertőző anyag. Emiatt minden humán eredetű anyagot potenciálisan fertőzőnek kell tekinteni. A CTM ( ) C; HCV L(+)C, v2.0 és HCV H(+)C, v2.0 fertőzőként kezelendő a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 20 és a CLSI Dokumentum M29-A3 21 előírásoknak megfelelő biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva. Gondosan tisztítson meg, és ioncserélt vagy desztillált vízzel frissen készített 0,5% nátrium-hipoklorit oldattal fertőtlenítsen minden munkaterületet. P. A HCV MMX and CTM Mn 2+ nátrium-azidot tartalmaz. A nátrium-azid ólom- és rézcsövekkel erősen robbanékony fém-azidokat képezve reakcióba léphet. Amikor nátrium-azid tartalmú oldatokat önt ki a laboratóriumi mosogatóba, az azidlerakódás megakadályozására nagy mennyiségű vízzel öblítse ki a lefolyót. 8

Q. Viseljen szemvédőt, védőruhát és egyszer használatos védőkesztyűt bármely reagens kezelése közben. Ezen anyagok bőrrel, szemmel és nyálkahártyákkal való érintkezése kerülendő. Ha mégis előfordul érintkezés, azonnal mossa le nagy mennyiségű vízzel. Ellenkező esetben égő érzés előfordulhat. Ezen reagensek kiömlése esetén szárazra törlés előtt vízzel hígítsa. TÁROLÁSI ÉS KEZELÉSI KÖVETELMÉNYEK Minta-előkészítő reagensek A. Tárolja a High Pure System Viral Nucleic Acid reagenseket 15 25 C-on a megérkezést követően. B. Tárolja az eluáló puffert (ELB) és a roncsoló/kötő puffert (LYS) 15 25 C-on. Felbontást követően tartsa az ELB és LYS puffereket 15 25 C-on. A felnyitott ELB és LYS puffereket 28 napon belül vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik, fel kell használni. C. Miután a hordozó RNS-hez és a proteináz K-hoz hozzáadta az eluáló puffert (ELB), a fel nem használt feloldott hordozó RNS-t (CAR) és a fel nem használt feloldott proteináz K-t (PK) tárolja -15 C és -25 C között. Feloldást követően a hordozó RNS-t és a proteináz K-t 28 napon belül vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik, fel kell használni. D. Miután etanolt adott a gátlóanyag-eltávolító pufferhez, illetve etanolt és vizet adott a mosópufferhez, tárolja a gátlóanyag-eltávolító puffert (IRB) és a mosópuffert (WASH) 15 25 C-on. Ezek a munkaoldatok 28 napig vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik, stabilak. E. A roncsoló/kötő munkaoldatot [roncsoló/kötő puffer plusz hordozó RNS, proteináz K és HCV QS] elkészítést követően azonnal fel kell használni. A maradékot ki kell dobni. Amplifikációs és kimutatási reagensek A. A reagenseket és kontrollokat tilos lefagyasztani. B. A HCV MMX; CTM ( ) C; HCV L(+)C, v2.0; HCV H(+)C, v2.0; HCV QS és CTM Mn 2+ 2 8 C-on tárolandók. Felbontás nélkül ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. Egy 12 mintát tartalmazó tételhez való mennyiség eltávolítása miatt felnyitott alábbi oldatok maradéka 2 8 C-on tárolandó: HCV MMX; HCV L(+)C, v2.0; HCV H(+)C, v2.0; HCV QS és CTM Mn 2+. Felbontást követően a HCV MMX; HCV L(+)C, v2.0; HCV H(+)C, v2.0; HCV QS és CTM Mn 2+ 2 8 C-on 28 napig vagy a lejárati dátumig stabil, amelyik előbb következik. Felbontást követően a fel nem használt CTM ( ) C kontrollt ki kell dobni. C. A master mix munkareagenst CTM Mn 2+ -t HCV MMX-hez hozzáadva készül) 2 8 C-on sötétben kell tárolni. Az előkészített mintákat és kontrollokat a master mix munkareagenshez annak elkészítésétől számított 1 órán belül hozzá kell adni. D. A feldolgozott minták és kontrollok 20 30 C-on legfeljebb 3 óráig, 2 8 C-on legfeljebb 24 óráig, illetve -20 C-ra fagyasztva legfeljebb 1 hétig stabilak. E. Az amplifikálást a mintáknak és kontrolloknak a master mix munkareagenshez adásától számított 2 órán belül meg kell kezdeni. A KÉSZLET TARTALMA Minta-előkészítő reagensek A. High Pure System Viral Nucleic Acid Kit (P/N: 03502295 001) LYS (roncsoló/kötő puffer) CAR (hordozó RNS) PK (proteináz K) IRB (gátlóanyag-eltávolító puffer) WASH (mosópuffer) 9

ELB (eluáló puffer) RS (High Pure System Viral Nucleic Acid állvány készlet) WR (High Pure System Viral Nucleic Acid hulladék állvány) Amplifikációs és kimutatási reagensek B. COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 HCV HPS V2 (P/N: 04861817 190) HCV QS (COBAS TaqMan HCV mennyiségi standard) HCV H(+)C, v2.0 [HCV magas (+) kontroll, v2.0] HCV L(+)C, v2.0 [HCV alacsony (+) kontroll, v2.0] CTM ( ) C [COBAS TaqMan negatív kontroll (humán plazma)] HCV MMX (COBAS TaqMan HCV master mix) CTM Mn 2+ (COBAS TaqMan mangánoldat) SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK Műszerezettség és szoftver COBAS TaqMan 48 Analizátor AMPLILINK szoftver Az AMPLILINK szoftverhez készült adatállomás COBAS TaqMan 48 készülék Felhasználói kézikönyve az AMPLILINK szoftver 3.1.0-s verziójú sorozatával való használathoz vagy COBAS TaqMan 48 készülék Felhasználói kézikönyve az AMPLILINK szoftver 3.2-es verziójú sorozatának Alkalmazási kézikönyvével való használathoz. AMPLILINK szoftver 3.1-es verziójú sorozat Alkalmazási kézikönyve COBAS AmpliPrep készülék, COBAS TaqMan készülék és COBAS TaqMan 48 készülék használatához vagy AMPLILINK szoftver 3.2-es verziójú sorozat Alkalmazási kézikönyve COBAS AmpliPrep készülék, COBAS TaqMan készülék, COBAS TaqMan 48 készülék és COBAS AMPLICOR készülék használatához. K-cső kupakrögzítő Egyszer használatos anyagok K-cső-doboz 12 x 96 Centrifuga követelmények Sigma 4 15 C asztali centrifuga vagy ezzel ekvivalens mikro-titer lemezcentrifuga, amely képes 4600 x g centrifugális erő biztosítására Sigma centrifuga kilendülő fejes rotor P/N: 11118 (tartalmaz 2 kosarat P/N: 13218 (és 2 lemeztartót P/N: 17978) vagy ennek megfelelő. EGYÉB SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK Izopropanol (> 99%) az ACS feltételeknek megfelelő vagy jobb Etanol (96 100%) az ACS feltételeknek megfelelő vagy jobb Ioncserélt víz Állítható pipetták*: (250 µl és 1000 µl) aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos RNázmentes hegyek Pipetta segédeszköz: Drummond (P/N: 4-000-100) vagy ennek megfelelő 10

Vízfürdő 50 C (± 2 C)-os Szárazfűtőblokk 70 C (± 2 C)-os Steril eldobható szerológiai pipetták: 5, 10 és 25 ml Steril polipropilén kúpos csövek; 15 ml és 50 ml: Corning (P/N: 430052 és P/N: 430290) vagy ennek megfelelő Steril 2,0 ml mikrocentrifuga csövek: Sarstedt (P/N: 72.693.005) vagy ennek megfelelő Vortex keverő Cső állványok Egyszer használatos kesztyűk, púdermentes Kalibrált hőmérők vízfürdőhöz és száraz fűtőblokkhoz * A pipetták pontossága a névleges térfogat 3%-án belül legyen. Aeroszolbarrieres vagy pozitív kiszorításos RNáz-mentes pipettahegyeket kell használni ott, ahol alapvető megelőzni a minta és az amplikon keresztszennyeződését. A MINTA LEVÉTELE, TRANSZPORTJA ÉS TÁROLÁSA Megjegyzés: Valamennyi mintát fertőzések átvitelére alkalmasként kell kezelni. A. A minta levétele A COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 kizárólag szérum- vagy plazmamintákhoz való használatra alkalmas. A BD SST szérumvételező csövekbe vagy EDTA (levendulakék kupak) véralvadásgátlót tartalmazó steril csövekbe kell levenni. A vért ne hagyja 2 25 C-on 6 óránál tovább. A gyártó utasításait követve a szérumot vagy a plazmát a levételtől számított 6 órán belül szeparálja el a teljes vérből. Vigye át a szérumot vagy a plazmát egy steril polipropilén csőben. A 4. és 5. ábra ilyen minta levételi vizsgálatokból származó adatokat mutat. A vizsgálatokat a COBAS AMPLICOR HCV MONITOR Test, version 2.0 (v2.0) segítségével végezték. 4. ábra HCV stabilitása teljes vérben; SST csövek (szérum) Átlagos HCV RNS eredmények Log 10 HCV RNS (IU/ml) Mintaszám < 1 óra 2 8C 6 óra 2 8C 24 óra 2 8C 48 óra 2 8C 72 óra 2 8C < 1 óra 20 25C 6 óra 20 25C 24 óra 20 25C 48 óra 20 25C 72 óra 20 25C 11

5. ábra HCV stabilitása teljes vérben; EDTA-s csövek (EDTA-s plazma) Átlagos HCV RNS eredmények Log 10 HCV RNS (IU/ml) Mintaszám < 1 óra 2 8C 6 óra 2 8C 24 óra 2 8C 48 óra 2 8C 72 óra 2 8C < 1 óra 20 25C 6 óra 20 25C 24 óra 20 25C 48 óra 20 25C 72 óra 20 25C B. A minta transzportja A teljes vér, szérum vagy plazma transzportja meg kell feleljen a kóroki ágensek transzportjára vonatkozó országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásoknak 22. A teljes vér 2 25 C-on transzportálandó, és a levételtől számított 6 órán belül fel kell dolgozni. A plazma, illetve szérum 2 8 C-on vagy -20-80 C-ra fagyasztva transzportálandó. C. A minta tárolása A szérum és az EDTA-s plazma 2 8 C között 3 napig, vagy fagyasztva -70 C alatt tárolható. A minták tárolása 800 900 µl részletekben 2,0 ml-es polipropilén csavarókupakos csövekben javasolt (pl. Sarstedt P/N: 72.694.006). A 6. és 7. ábra ilyen minta tárolási vizsgálatokból származó adatokat mutat. A vizsgálatokat a COBAS AMPLICOR HCV MONITOR Test, v2.0 segítségével végezték. 6. ábra HCV stabilitása szérumban Átlagos HCV RNS eredmények Log 10 HCV RNS (IU/ml) Mintaszám < 1 óra 2 8C 72 óra 2 8C 120 óra 2 8C 168 óra 2 8C 240 óra 2 8C < 1 óra 20 25C 72 óra 20 25C 120 óra 20 25C 168 óra 20 25C 240 óra 20 25C 12

7. ábra HCV stabilitása EDTA-s plazmában Átlagos HCV RNS eredmények Log 10 HCV RNS (IU/ml) Mintaszám < 1 óra 2 8C 72 óra 2 8C 120 óra 2 8C 168 óra 2 8C 240 óra 2 8C < 1 óra 20 25C 72 óra 20 25C 120 óra 20 25C 168 óra 20 25C 240 óra 20 25C A szérum- és plazmaminták legfeljebb három alkalommal olvaszthatók és fagyaszthatók HCV RNS-veszteség nélkül. Az 1. táblázat ilyen fagyasztás-olvasztás vizsgálatok adatait mutatja, a vizsgálatokat a COBAS AMPLICOR HCV MONITOR Test, v2.0 segítségével végezték. 1. táblázat Log 10 különbségek HCV koncentrációban a 0. ciklustól szérum és EDTA-s plazma esetén 5 fagyasztás és olvasztás ciklus során Mátrix Stabilitás minta # Fagyasztás/olvasztás ciklus 0. ciklus 1. ciklus 2. ciklus 3. ciklus 4. ciklus 5. ciklus 1 0,00-0,052 0,238 0,179-0,670-0,277 2 0,00 0,293 0,228-0,206-0,338 0,175 Szérum 3 0,00-0,270-0,023-0,430 0,008-0,229 4 0,00 0,071-0,516-0,295-0,564-0,670 5 0,00 0,342-0,031-0,344-0,436-0,277 Szérum átlag 0,00 0,077-0,021-0,239-0,400-0,246 11 0,00-0,006 0,043-0,143-0,159-0,140 12 0,00-0,329-0,375-0,234-0,642-0,265 EDTA-s plazma 13 0,00-0,056-0,248-0,371-0,395-0,142 14 0,00 0,186-0,066-0,034-0,241-0,084 15 0,00-0,120-0,111-0,055 0,250-0,217 EDTA-s plazma átlag 0,00-0,065-0,151-0,167-0,237-0,170 HASZNÁLATI UTASÍTÁS Megjegyzés: A részletes üzemeltetési utasításokért, az eredmények kinyomtatásáért és ajelzők, megjegyzések és hibaüzenetek értelmezéséért forduljon a következő kézikönyvekhez: (1) a COBAS TaqMan 48 készülék Felhasználói kézikönyve az AMPLILINK szoftver 3.1.0-s verziójú sorozatával való használathoz és az AMPLILINK szoftver 3.1 verziójú sorozatának Alkalmazási kézikönyve a COBAS AmpliPrep készülék, COBAS TaqMan készülék és COBAS TaqMan 48 készülék használatához vagy (2) a COBAS TaqMan 48 készülék Felhasználói kézikönyve az AMPLILINK szoftver 3.1.0-s verziójú sorozatának Alkalmazási kézikönyvével való használathoz és az AMPLILINK szoftver 3.2-es verziójú sorozatának Alkalmazási kézikönyve acobas AmpliPrep készülék, COBAS TaqMan készülék, COBAS TaqMan 48 készülék és COBAS AMPLICOR készülék használatához. 13

Megjegyzés: Valamennyi amplifikációs és kimutatási reagensnek használat előtt szobahőmérsékleten kell állnia; legalább 30 perccel használat előtt vegye ki azokat a 2 8 C-on történő tárolásból. Megjegyzés: A szérum és plazma mintákat 15 30 percig hagyni kell, hogy felhasználás előtt felvegyék a szobahőmérsékletet. Megjegyzés: Használjon aeroszolbarrieres pipettákat vagy pozitív kiszorításos hegyeket, ahol indokolt. A szennyeződés elkerülésének érdekében rendkívüli gondossággal járjon el. Futtatási mennyiség: Valamennyi készlet elegendő reagenst tartalmaz négy darab 12 mintás futtatáshoz, amelyek kivitelezhetőek külön-külön vagy párhuzamosan. Valamennyi legfeljebb 24 mintát és kontrollt tartalmazó futtatásnak a CTM ( ) C, HCV L(+)C, v2.0 kontrollokat és a HCV H(+)C, v2.0 kontrollt tartalmaznia kell (lásd Minőség-ellenőrzés ). Az amplifikációs és kimutatási reagensek 24 tesztre elegendő kétszer használatos palackokban vannak. A reagensek leghatékonyabb felhasználása céljából a mintákat és a kontrollokat a 12 többszörösének megfelelő tételekben kell feldolgozni. Minta és kontroll előkészítése Megjegyzés: Fagyasztott szérum vagy plazma minták használatakor tegye a mintákat szobahőmérsékletre, amíg azok teljesen fel nem olvadnak, majd felhasználás előtt vortexelje őket 5 10 másodpercig. Megjegyzés: Felhasználás előtt hagyja a reagenseket, hogy elérjék a szobahőmérsékletet. A tisztítási reakciók megkezdése előtt fűtse fel a fűtőblokko(ka)t 70 C (± 2 C)-ra, és a vízfürdőt 50 C (± 2 C)-ra. A. Reagens előkészítése Megjegyzés: A roncsoló/kötő munkaoldatot csak azután készítse el, mikor valamennyi mintát és kontrollt 15 30 percig állni hagyta, hogy felvegyék a szobahőmérsékletet. 1. Készítse el a gátlóanyag-eltávolító puffert 20 ml 96 100% etanolnak a gátlóanyag-eltávolító pufferhez (IRB) való pipettázásával. A cső 5 10-szeri fordítgatásával keverje össze az oldatokat. Ez elegendő feloldott gátlóanyag-eltávolító puffer 48 teszthez. 2. Készítse el a mosópuffert 50 ml 96 100%-os etanolnak és 30 ml ioncserélt víznek a mosópufferhez (WASH) való pipettázásával. A cső 5 10-szeri fordítgatásával keverje össze az oldatokat. Ez elegendő feloldott mosópuffer 48 teszthez. 3. Melegítse elő az eluáló puffert (ELB) 70 C (± 2 C)-on egy 2,0 ml-es csavarókupakos centrifugacsőben. Több csövet is használhat. A mintánkénti eluáló térfogat 75 µl. Melegítse elő a vizsgálatok számának az alábbi táblázatban felsorolt megfelelő térfogatot. Ismétlések száma Reagens 12 24 Eluáló puffer (ml) 2,0 4,0 4. Pipettázza a vizsgálatok számának az alábbi táblázatban felsorolt megfelelő térfogatú izopropanolt egy tiszta steril csőbe. Ismétlések száma Reagens 12 24 Izopropanol (ml) 5,0 10,0 5. Pipettázzon 0,5 ml eluáló puffert (ELB) a hordozó RNS-hez (CAR). Helyezze vissza a lezárót; fordítsa meg a csövet, majd vortexelje addig, amíg valamennyi hordozó RNS fel nem oldódik. A feloldott hordozó RNS 24 teszthez elegendő. A feloldott hordozó RNS fel nem használt térfogata -15 és -25 C között legfeljebb 28 napig tárolható, vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik. 6. Pipettázzon 5,0 ml eluáló puffert (ELB) a proteináz K-hoz (PK). Helyezze vissza a lezárót; fordítsa meg a csövet, majd vortexelje addig, amíg valamennyi proteináz K fel nem oldódik. 14

A feloldott proteináz K 24 teszthez elegendő. A feloldott proteináz K fel nem használt térfogata -15 és -25 C között legfeljebb 28 napig tárolható, vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik. 7. Készítse el a roncsoló/kötő munkaoldatot az alábbiak szerint úgy, hogy a feldolgozandó minták és kontrollok számának megfelelően a következő táblázatban felsorolt térfogatokat pipettázza: Ismétlések száma Reagensek 12 24 Roncsoló/kötő puffer (ml) 7,0 14,0 Hordozó RNS (µl) 140 280 HCV QS (µl) 56 112 Proteináz K (ml) 1,4 2,8 Megjegyzés: A HCV QS térfogata meghatározott a COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 vizsgálatra. Megjegyzés: Fagyasztott feloldott hordozó RNS vagy proteináz K használata esetén olvassza fel szobahőmérsékleten, és többször fordítgassa meg használat előtt. Mérje a roncsoló/kötő puffer jelzett térfogatát egy tiszta steril 50 ml-es csőbe. Adja a feloldott hordozó RNS jelzett térfogatát a roncsoló/kötő puffert tartalmazó csőhöz. Vortexelje a HCV QS-t 3 5 másodpercig, és adja a HCV QS jelzett térfogatát a roncsoló/kötő puffert és feloldott hordozó RNS-t tartalmazó csőhöz. Csavarja rá a kupakot a csőre, majd 10 15-szöri fordítgatással keverje össze. Vortexelni TILOS a vortexelés buborékképződést okoz az oldatban. Adja a feloldott proteináz K jelzett térfogatát a roncsoló/kötő puffert tartalmazó csőhöz. Csavarja rá a kupakot a csőre, majd 10 15-szöri fordítgatással keverje össze. Vortexelni TILOS a vortexelés buborékképződést okoz az oldatban. A proteináz K-nak a roncsoló/kötő pufferhez való hozzáadását és elkeverését követően azonnal kezdje meg a roncsoló/kötő munkaoldat adagolását. A fel nem használt roncsoló/kötő puffer (LYS) 15 25 C-on legfeljebb 28 napig tárolható, vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik. A fel nem használt roncsoló/kötő munkaoldatot ki kell dobni. B. Minta és kontroll előkészítése Megjegyzés: Aeroszol-rezisztens hegyekkel ellátott állítható pipetták használata javasolt ehhez a művelethez. Megjegyzés: A 19. és 22. lépésekhez megfelelő méretű steril kombi-hegyekkel ellátott ismétlő pipetta használható. Mindamellett különös gondot kell fordítani a reagensek kiloccsanásának és a keresztszennyeződésnek az elkerülésére. 1. Pipettázzon 625 µl roncsoló/kötő munkaoldatot a roncsoló állvány minden egyes üregébe (I, átlátszó). Nyomja vissza a fedeleket fedő állásba. 2. Egy alkalommal egy üreget felnyitva pipettázzon 500 µl mintát vagy kontrollt a megfelelő üregbe. Minden egyes minta vagy kontroll bemérését követően nyomja le a fedelet addig, amíg a patentes mechanizmus nem biztosítja az üreg szoros záródását. 3. Valamennyi minta és kontroll bemérését követően mintegy 10 másodpercig történő vortexeléssel keverje meg a feltöltött roncsoló állványt. Vizuálisan ellenőrizze, hogy valamennyi üreg vortexelésre került, és jól meg lett keverve. 4. Inkubálja a roncsoló állványt 50 C (± 2 C)-on 10 percig egy előfűtött vízfürdőben. Úsztassa a roncsoló állványt egy megközelítőleg 5 7 cm vízzel töltött vízfürdőben. A vízfürdőből való eltávolítását követően szárítsa meg a roncsoló állványt. 5. Centrifugálja a roncsoló állványt a mikro-titer lemezcentrifugában 10 20 másodpercig 4600 x g-re beállított. A centrifuga esetleg nem éri el a beállított sebességet. 15

6. Egy alkalommal egy üreget felnyitva pipettázzon 250 µl izopropanolt minden egyes üregbe. Minden egyes bemérést követően nyomja le a fedelet addig, amíg a patentes mechanizmus nem biztosítja az üreg szoros záródását. Megjegyzés: Az izopropanol térfogata meghatározott a COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 vizsgálatra. 7. Keverje össze a mintákat az állvány háromszori fordítgatásával, majd vortexelje az állványt mintegy 10 másodpercig. Vizuálisan ellenőrizze, hogy valamennyi üreg vortexelésre került, és jól meg lett keverve. 8. Centrifugálja a roncsoló állványt a mikro-titer lemezcentrifugában 10 20 másodpercig 4600 x g-re beállított. A centrifuga esetleg nem éri el a beállított sebességet. 9. Egy alkalommal egy üreget felnyitva vigyen át 750 µl minta vagy kontroll elegyet a rögzített hulladék állvánnyal (fehér) ellátott szűrőcsőállvány (II, sárga) megfelelő üregeibe. Az egyes minta vagy kontroll elegy bemérését követően nyomja le a fedelet addig, amíg a patentes mechanizmus nem biztosítja az üreg szoros záródását. 10. Valamennyi minta és kontroll bemérését követően centrifugálja a szűrőcsőállványszerelvényt 2 percig 4600 x g-n a mikro-titer lemezcentrifugában. 11. Egy alkalommal egy üreget felnyitva vigye át a maradék minta vagy kontroll elegyet a szűrőcsőállvány megfelelő üregeibe. Minden egyes minta vagy kontroll elegy bemérését követően szorosan zárja le az üreg fedelét. Dobja ki megfelelő módon a roncsoló állványt. 12. Centrifugálja a szűrőcsőállvány-szerelvényt 2 percig 4600 x g-n a mikro-titer lemezcentrifugában. 13. A szűrőcsőállvány felső oldalán lévő mindkét patentkapocs lenyomása révén távolítsa el a szűrőcsőállványt a hulladék állványról. Dobja ki a hulladék állványt. Cserélje ki egy új hulladék állvánnyal, és pattintsa a szűrőcsőállványt a hulladék állványra. 14. Nyissa fel a szűrőcsőállvány valamennyi fedelét a fogók segítségével, és pipettázzon be 400 µl gátlóanyag-eltávolító puffert (IRB) minden egyes üreg oldala mentén. Ne érintse meg az üregek oldalát. Miután hozzáadta a gátlóanyag-eltávolító puffert valamennyi üreghez, szorosan zárja le a fedeleket. 15. Centrifugálja a szűrőcsőállvány-szerelvényt 2 percig 4600 x g-n a mikro-titer lemezcentrifugában. 16. Nyissa fel valamennyi fedelet a fogók segítségével, és pipettázzon be 700 µl mosópuffert (WASH) minden egyes üreg oldala mentén. Ne érintse meg az üregek oldalát. Miután hozzáadta a mosópuffert valamennyi üreghez, szorosan zárja le a fedeleket. 17. Centrifugálja a szűrőcsőállvány-szerelvényt 2 percig 4600 x g-n a mikro-titer lemezcentrifugában. 18. A szűrőcsőállvány felső oldalán lévő mindkét patentkapocs lenyomása révén távolítsa el a szűrőcsőállványt a hulladék állványról. Dobja ki a hulladék állványt. Cserélje ki egy új hulladék állvánnyal, és pattintsa a szűrőcsőállványt a hulladék állványra. 19. Nyissa fel valamennyi fedelet a fogók segítségével, és pipettázzon be 700 µl mosópuffert minden egyes üreg oldala mentén. Ne érintse meg az üregek oldalát. Miután hozzáadta a mosópuffert valamennyi üreghez, szorosan zárja le a fedeleket. 20. Centrifugálja a szűrőcsőállvány-szerelvényt 3 percig 4600 x g-n a mikro-titer lemezcentrifugában. 21. A szűrőcsőállvány felső oldalán lévő mindkét patentkapocs lenyomása révén távolítsa el aszűrőcsőállványt a hulladék állványról. Helyezze a szűrőcsőállványt az eluáló állványra (IIIA, kék), és pattintsa a szűrőcsőállványt az eluáló állványra. Dobja ki megfelelő módon a hulladék állványt. 22. Nyissa fel valamennyi fedelet a fogók segítségével, és pipettázzon 75 µl előmelegített eluáló puffert (ELB) minden egyes szűrő közepére anélkül, hogy a szűrőhöz érne. Megjegyzés: Ne az üreg oldala mentén adagolja az eluáló puffert. Miután hozzáadta az eluáló puffert valamennyi üreghez, szorosan zárja le a fedeleket. Inkubálja az eluáló állványt szobahőmérsékleten az eluáló puffernek az utolsó üreghez való hozzáadását követően legalább 3 percig. 23. Centrifugálja a szűrőcsőállvány-szerelvényt 3 percig 4600 x g-n a mikro-titer lemezcentrifugában. 24. A szűrőcsőállvány felső oldalán lévő mindkét patentkapocs lenyomása révén távolítsa el a szűrőcsőállványt az eluáló állványról. Dobja ki megfelelő módon a szűrőcsőállványt. 16

25. Helyezze az állvány fedelet (IIIB, kék) az eluáló állványra (IIIA, kék). Nyomja le határozottan, és pattintsa a kapcsokat az eluáló állványra. Zárja le valamennyi fedelet. 26. A feldolgozott minták és kontrollok közvetlenül PCR-re kerülnek felhasználásra. A feldolgozott minták és kontrollok 50 µl-ét használja amplifikálásra. A minta és kontroll előkészítést követő 3 órán belül adja a feldolgozott mintákat és kontrollokat a master mix munkaoldathoz. Ha a feldolgozott minták és kontrollok nem kerülhetnek felhasználásra az előkészítésüktől számított 3 órán belül, akkor tárolhatja a feldolgozott mintákat és kontrollokat 2 8 C-on legfeljebb 24 óra hosszat a lefedett eluáló állványban vagy -20 C-ra fagyasztva legfeljebb 1 hétig steril 2,0 ml-es csavarókupakos csövekben (pl. Sarstedt P/N: 72.694.006). A minták és kontrollok master mix munkaoldathoz adását követő 2 órán belül amplifikálja a mintákat és kontrollokat. Reverz transzkripció, amplifikálás és kimutatás Megjegyzés: A K-hordozókat és a K-hordozó tartót 70%-os izopropanol oldattal nedvesített, szálmentes ruhával kell megtörölni. C. Reagens előkészítése Megjegyzés: A COBAS TaqMan HCV master mix (HCV MMX), a Master Mix munkareagens (MMX munkareagens) és az MMX munkareagens plusz feldolgozott minták és kontrollok fényérzékenyek. Ezek a reagensek fénytől védve tartandók. Megjegyzés: A COBAS TaqMan HCV master mix (HCV MMX) és a COBAS TaqMan mangánoldat (CTM Mn 2+ ) oldatokat legalább 30 percig hagyni kell, hogy felvegyék a szobahőmérsékletet a master mix munkareagens elkészítése előtt. Megjegyzés: Az MMX munkareagenst a minta és kontroll előkészítés befejeztével készítse el. Megjegyzés: A master mix munkareagenst az elkészítést követő 1 órán belül fel kell használni. Megjegyzés: Ha egyszer a feldolgozott mintákat és kontrollokat az MMX munkareagenshez mérte, akkor az amplifikálást 2 órán belül meg kell kezdeni. 1. Hagyjon egy fiola HCV MMX és egy fiola CTM Mn 2+ oldatokat legalább 30 percig, hogy felvegyék a szobahőmérsékletet. 2. Helyezzen egy K-hordozót a K-hordozó-tartóba. 3. Helyezzen új K-csöveket a K-hordozóba anélkül, hogy a K-csövek oldalához érne. Megjegyzés: Ha 24 csőnél kevesebb mintát futtat, akkor ahhoz, hogy a PCR-készülékben a K-hordozó ki legyen egyensúlyozva, az 1, 2, 5, 20, 23 és 24 pozíciókban csőnek kell lennie. 4. A K-cső kupakrögzítő segítségével távolítsa el a K-csövek kupakját. Helyezze a kupakokat a K-cső tárolóhelyén a tartóba. 5. Készítse el az MMX munkareagenst a következők szerint: 24 teszt esetén mérjen 170 µl CTM Mn 2+ oldatot egy fiola HCV MMX reagenshez. Csavarja rá a kupakot az üvegre, majd 10-szeri fordítgatással keverje jól össze. Az MMX munkareagenst ne vortexelje. Az MMX munkareagens fénytől védve tartandó, és 1 órán belül fel kell használni. 12 teszt esetén vegyen ki 669 µl HCV MMX reagenst és tegye egy 2 ml-es csőbe. Mérjen 81 µl CTM Mn 2+ oldatot a HCV MMX reagenst tartalmazó 2 ml-es csőbe, csavarja rá a kupakot a csőre, majd 10-szeri fordítgatással keverje jól össze. Az MMX munkareagens fénytől védve tartandó, és 1 órán belül fel kell használni. A HCV MMX és CTM Mn 2+ oldatok maradéka az eredeti fiolákban 2 8 C-on tárolható. Felbontást követően a HCV MMX és CTM Mn 2+ 2 8 C-on 28 napig vagy a lejárati dátumig stabil, amelyik előbb következik. Megjegyzés: A CTM Mn 2+ térfogata meghatározott a COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 vizsgálatra. 6. Pipettázzon 50 µl MMX munkareagenst mindegyik K-csőbe. 17

Megjegyzés: Fagyasztva tárolt minták és kontrollok használatakor az amplifikálást megelőzően olvassza fel a mintákat szobahőmérsékleten, majd keverje meg őket jól mielőtt a 7. lépéssel folytatná. 7. Mérjen aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos heggyel ellátott mikropipettával minden egyes mintából és kontrollból 50 µl-t a megfelelő, MMX munkareagenst tartalmazó K-csőbe. Minden mintát és kontrollt mikropipetta segítségével háromszori fel-le pipettázással óvatosan keverjen össze anélkül, hogy buborékokat csinálna. 8. Ismételje meg a 7. lépést minden egyes feldolgozott mintára és feldolgozott kontrollra, amíg az összeset át nem vitte a K-csövekbe. Használjon új hegyet minden egyes mintához és kontrollhoz. Szemmel ellenőrizze, hogy nincsenek-e buborékok, és szükség esetén távolítsa el azokat. A K-cső kupakrögzítő segítségével tegye fel a K-csövek kupakját. Szemmel ellenőrizze, hogy valóban a megfelelő térfogatok lettek összemérve. 9. Az amplifikálást a mintáknak és kontrolloknak az MMX munkareagenst tartalmazó K-csövekbe való bemérésétől számított 2 órán belül meg kell kezdeni. D. A COBAS TaqMan 48 Analizátor betöltése és működtetése 1. Kapcsolja be a számítógépes munkaállomást, majd jelentkezzen be a Windows XP-be a megfelelő felhasználónévvel és jelszóval. 2. Kapcsolja be a COBAS TaqMan 48 Analizátort. Ellenőrizze, hogy a készülék inicializálódik-e és használatra kész-e. Ha az előző futtatás(ok)ból K-hordozók maradtak bármelyik PCR-készülékben, távolítsa el azokat a K-hordozó transzporter segítségével. 3. Indítsa el az AMPLILINK szoftvert a számítógépen. A megfelelő felhasználóazonosítóval és jelszóval jelentkezzen be. 4. A vizsgálandó minták számára K-hordozó megrendelések létrehozásához kattintson az Orders ikonra. Válassza ki a Sample fület, majd kattintson az New gombra és a billentyűzet vagy vonalkód-leolvasó segítségével vigye be minden mintának a rendelésszámát. Válassza a COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 vizsgálatdefinícióját. Ismételje meg ezt mindegyik minta esetén. Kattintson a Save gombra. Megjegyzés: Ha 24 csőnél kevesebb mintát futtat, akkor ahhoz, hogy a PCR-készülékben a K-hordozó ki legyen egyensúlyozva, az 1, 2, 5, 20, 23 és 24 pozíciókban csőnek kell lennie. 5. A minőség-ellenőrzési adatok beviteléhez kattintson az Orders ablakban a Quality Control fülre. Kattintson a New gombra, és a billentyűzet vagy vonalkód-leolvasó segítségével vigye be a készlet mellé biztosított COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 kontroll értékkártyáról a vonatkozó adatokat. Adja meg a megfelelő mezőkbe a COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 tételszámát, lejárati dátumát, az alacsony (+) és magas (+) kontroll tartományokat, valamint a tétel specifikus kalibrációs együtthatókat. Kattintson az OK gombra. 6. Az Orders ablakban a K-Carrier fülre kattintva rendeljen a futtatáshoz egy K-hordozó számot. A K-Carrier ablakban kattintson a New gombra. A K-Carrier ID jobb oldalán lévő cellába a billentyűzet vagy vonalkód-leolvasó segítségével adja meg a K-hordozón lévő vonalkódból a K-hordozó számot. Ne feledje, hogy az ugyanezen K-hordozó azonosítóhoz rendelt korábbi futtatás eredményeit el kell fogadni. Válassza ki a COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 vizsgálatdefinícióját az ablak alsó részén lévő vizsgálati panelből. 7. A Worklist listában jelölje ki a Típus (T) oszlop első sorát. Jelölje ki ezt a mezőt, majd a megjelenő legördülő-listából válassza ki a kívánt kontrolltípust. Majd a következő sorhoz kattintson kétszer a mintaazonosító mezőre. A LookUp Control ablak megjelenik valamennyi lehetséges kontrollt feltüntetve. Amikor a kontrollt kiválasztja, a megfelelő kalibrációs és kontroll értékek megjelennek a jobb alsó információs mezőben. Ismételje meg ezt a folyamatot valamennyi szükséges kontroll esetén. 8. Ha mintákat akar megadni a Worklist listára, kattintson kétszer az első pozícióra (sorra) a minta bevitelhez. Meg fog jelenni a hozzárendelt minta megrendeléseket tartalmazó Lookup Sample ablak. Egynél több rendelésszám kijelölését a Shift + Arrow gombokkal végezheti el. Ellenőrizze, hogy minden megrendeléshez a COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 vizsgálatdefiníciója van-e hozzárendelve. 9. A K-hordozó megrendelés kijelölés mentéséhez kattintson a Save gombra. 18