A plazma endothelin-1 szerepe diabetes mellitusban Dr. Sármán Beatrix PhD értekezés 2002, Budapest A munka A hepatológia immunológiai és szabad gyökös vonatkozásai címû doktori program A szénhidrátok és a lipidanyagcsere kapcsolata a szabadgyökös reakciókkal és szerepük az atherosclerosis kialakulásában címû alprogramjának részeként. Programvezető: Dr. Fehér János, egyetemi tanár, Semmelweis Egyetem, ÁOK, II.sz. Belgyógyászati Klinika Témavezető: Dr. Somogyi Anikó, egyetemi docens, Semmelweis Egyetem, ÁOK, II.sz. Belgyógyászati Klinika
Bevezetés Az endothelium sejtjei, amelyek egy rétegben bélelik a vérereket, fontos szerepet játszanak a szervezet homeosztázisának fenntartásában. Sejtjei részt vesznek a véralvadásban, a fibrinolysis folyamatában, interakcióba lépnek a thrombocyta és leukocyta sejtekkel, a lipoproteinekkel, szabályozzák az értónust, a vérnyomást és a simaizomsejtek proliferációját. Az endothel sejtekben számos faktor képződik - prostacyclin, thromboxane, nitrogén monoxid, angiotensin, EDHF, szabadgyökök, bradikinin -, amelyek részben lokális autokrin-parakin módon, részben mint hormonok, képződési helyüktől távolabb fejtik ki hatásukat. A rendszer - összetettsége miatt - azonban sérülékeny, egyensúlyát számos endogén és exogén tényező befolyásolja. Cukorbetegségben a morbiditás és mortalitás vezető oka az érszövődmények kialakulása. Korai felismerésük és kezelésük a betegek túlélése szempontjából létfontosságú. Az érszövődmények szűrésében rendkívüli szerepe lenne egy olyan faktornak, amely viszonylag egyszerűen mérhető és koncentrációjából már korai stádiumban következtethetnénk az endothelium dysfunctiojára. Az endothel sejtek által elválasztott ET-1 a jelenleg ismert leghatékonyabb vazokonstriktor faktor. Vazokonstriktor hatása mellett serkenti a simaizom sejtek migrációját és proliferációját. Endothelialis dysfunctioban igazolták, hogy az ET-1 elválasztása fokozódik, így szerepet játszhat az érelmeszesedés kialakulásában. Célkitűzések Kutatásunk tárgya a plazma endothelin-1 szerepének vizsgálata cukorbetegségben. Klinikai vizsgálatok során összesen 239 egyén adatait dolgoztuk fel különböző szempontok szerint. A vizsgálatokba 1-es és 2-es típusú cukorbeteg és egészséges kontroll egyének mellett nem diabeteses hypertoniás és hyperlipaemiás egyéneket vontunk be. 2
célunk volt, hogy kutassuk szövődményes és szövődménymentes cukorbetegekben létrejön-e a plazma ET-1 szint változása, vizsgáljuk, hogy a plazma ET-1 szint változása utal-e a meg lévő érszövődmények súlyosságára; vizsgáljuk, hogy a cukorbetegséghez társuló hypertonia szerepet játszik-e a plazma ET-1 szint változásában, kutassuk, hogy a plazma ET-1 koncentráció változása lehet-e kialakuló érszövődmények korai markere, tanulmányozzuk a cukorbetegséghez társuló hyperlipaemia hatását a plazma ET-1 koncentráció alakulására. meghatározzuk, hogy kapcsolatba hozható-e a plazma ET-1 szint alakulása a plazma glukóz és HbA1c szintjével kutassuk az orális antidiabetikus kezelés és az inzulin terápia hatását a plazma ET-1 koncetrációra és kimutassuk, van-e kapcsolat az endogén inzulin termelés és a plazma ET-1 szintek alakulása között; 2-es típusú diabetes mellitusban célunk volt az endothelialis dysfunctio kutatása is, ezért a plazma ET-1 koncentrációja mellett a plazma teljes nitrit+nitrát (NO 2 +NO 3 ) szintjét is meghatároztuk, amely indirekt módon jelzi a vazodilatator nitrogén monoxid produkciót. Vizsgáltuk, hogy van-e kapcsolat a plazma ET-1 és a teljes NO 2 +NO 3 szintek között. befolyásolja a hypertonia a plazma teljes NO 2 +NO 3 szintjét. van-e összefüggés a plazma teljes NO 2 +NO 3 koncentrációja és az alkalmazott terápia között 2-es típusú diabetes mellitusban. Választ kerestünk arra, hogy a radioimmunoassay során alkalmazott eltérő extrakciós módszerek befolyásolják-e a metodika érzékenységét. Mérési módszerek A keringő plazma endothelin-1 koncentráció meghatározása A plazma mintákat 1-es típusú cukorbetegek vizsgálatakor acetonos kirázással, 2-es típusú cukorbetegek esetében pedig Sep-pak C18 kromatográfiás oszlopok (Waters, Millipore) 3
segítségével extraháltuk. Az extraktum felülúszóját elkülönítettük és vákuumos koncentrátorral beszárítottuk (Speedvac contrentrator), majd RIA pufferben újra feloldottuk. A minták mérése Peninsula antitestre épített radioimmunoassay módszerrel történt. Az assay sensitivitasa 0,3 fmol/cső. Plazma teljes nitrit+nitrát meghatározás: Bazális NO metabolizmus végtermékeit [nitrit+nitrát (NO 2 +NO 3 )] a plazmában kolorimetriás (Griess reagens) módszerrel határoztuk meg. A nitrátot kadmium ágyon redukáltuk nitritté (szobahőmérsékleten 24 órát inkubáltuk). Leolvasás ELISA readeren történt 540nm hullámhosszon (OXIS International Inc, BIOTECH, Nitric oxide Non-enzymatic Assay, Cat. No: 22111N) Eredményeink: A. 1-es típusú diabetes mellitusban 1. A hyperlipaemias cukorbeteg csoportban szignifikánsan magasabb plazma ET-1 koncentrációt találtunk összehasonlítva az egészséges kontroll csoport eredményeivel (p<0,05) 2. A szövődmények jelenléte a hyperlipaemias cukorbetegek plazma ET-1 szintjét tovább emelte és szignifikánsabban magasabbnak bizonyult mint a normolipaemias cukorbetegeké, a hyperlipaemiás nem diabeteses egyéneké és a kontroll személyeké (p<0,001). 3. A plazma ET-1 szint nem különbözött a kontroll, a hyperlipaemias nem cukorbetegek és a normolipaemias, szövődménymentes cukorbetegek között. 4. A késői szövődmények szerepét vizsgálva szignifikánsan magasabb plazma ET-1 koncentrációt találtunk a késői szövődményekben szenvedő 1-es típusú cukorbetegekben az egészséges kontroll csoporthoz, valamint a szövődménymentes cukorbetegekhez képest (p<0,01). 5. Az ET-1 marker funkcióját vizsgálva kimutattuk, hogy az emelkedett plazma ET-1 koncentráció már azokban az 1-es típusú cukorbetegekben is megfigyelhető, akiknél a hypertonia mellett más szövődmény még nem mutatható ki. 6. A szövődménymentes diabeteses csoport és az egészséges kontroll csoport plazma ET-1 koncentrációja nem különbözött 7. Nem találtunk korrelációt a plazma ET-1 koncentráció és a plazma HbA1c, a szérum glukóz, a szérum kreatinin szint, a szérum apo A1, apo B szintek, a plazma C-peptid és szérum inzulin koncentráció között, továbbá a diabetes ideje, a testtömeg index, és az életkor között 1- es típusú cukorbetegségben. 4
8. Nem találtunk összefüggést a napi exogén inzulin dózis és a plazma ET-1 szintje között. A vizsgálatok során a plazma ET-1 koncentráció mellett meghatároztuk a betegek totál antioxidáns státuszát (TAS). 1. Nem találtunk korrelációt a szervezet totál antioxidáns státusza és plazma ET-1 szintje között 2. Nem találtunk kapcsolatot a plazma TAS és a plazma ET-1 között hyper- és normolipaemias 1-es típusú cukorbetegekben és hyperlipaemias nem cukorbeteg személyekben B. 2-es típusú diabetes mellitusban 1. Az ischaemias szervkárosodásban szenvedő cukorbetegek plazma ET-1 koncentrációja magasabb, összehasonlítva azokkal, akiknél a hypertonia mellett más szövődmény még nem alakult ki. 2. Az endotheliális dysfunctio vizsgálata során szignifikánsan alacsonyabb plazma teljes NO 2 +NO 3 koncentrációt mértünk a hypertoniás 2-es típusú diabeteses csoportban, összehasonlítva a normotoniás betegek eredményeivel. A plazma ET-1 koncentráció nem különbözött a normo- és hypertoniás 2-es típusú cukorbeteg csoport, valamint az egészséges kontroll csoport között. 3. Nem mutatható ki különbség a 2-es típusú cukorbeteg csoport és az egészséges kontroll egyének plazma ET-1 koncentrációja között. 4. A normo- és hyperlipaemias 2-es típusú cukorbetegek keringő ET-1 koncentrációja megegyezett és nem különbözött a kontroll, és a hyperlipaemias kontroll csoportok értékeitől sem. 5. A szövődményes és szövődménymentes cukorbetegek plazma ET-1 koncentrációja nem különbözött sem egymáshoz, sem a kontroll csoporthoz képest. 6. Nem találtunk különbséget a plazma NO 2 +NO 3 koncentrációjában a kontroll és a diabeteses csoportok között. 7. A diéta mellett orális antidiabetikummal kezelt cukorbetegcsoport és az inzulin terápiában részesülő cukorbetegcsoport plazma ET-1 koncentrációja és teljes NO 2 +NO 3 szintje között sem volt kimutatható különbség. 8. Nem találtunk korrelációt a plazma ET-1 koncentráció és a plazma HbA1c, a vércukorszint, a szérum kreatinin szint, a plazma NO 2 +NO 3 és a plazma C-peptid koncentrációk valamint a testtömeg index és az életkor között 2-es típusú diabetes mellitusban. 5
9. Nem találtunk összefüggést a plazma teljes NO 2 +NO 3 koncentráció és a: a plazma C- peptid a plazma HbA1c szint, a szérum glukóz szint, valamint az életkor és a testtömeg index között 2-es típusú cukorbetegekben. C. Választ kerestünk arra, hogy a radioimmunoassay során alkalmazott eltérő extrakciós módszerek befolyásolják-e a metodika érzékenységét. Szoros pozitív korrelációt találtunk az acetonos kirázás és a Sep-pack C18 kromatográfiás oszlopon történt extrakciók között, azonban az utóbbi módszer érzékenyebbnek bizonyult. Következtetések 1. Eredményeink azt bizonyítják, hogy 1-es típusú cukorbetegségben a plazma ET-1 szint emelkedés érzékeny markere az érszövődmények kialakulásának. A hyperlipaemiás cukorbetegekben mért magasabb plazma ET-1 koncentráció az endothelialis dysfunctio markere lehet, és korai stádiumban - még a klinikailag diagnosztizálható szövődmények megjelenése előtt - jelezheti a kóros folyamatok kialakulását. Az ET-1 - összetett hatásait figyelembe véve - az egyik iniciáló faktora lehet a diabetesben felgyorsult érelmeszesedés kialakulásának. A hyperlipaemia jelenléte a folyamat további gyors progresszióját idézi elő. 2. 2-es típusú diabetes mellitusban a plazma ET-1 szint mérése önmagában nem bizonyult az érbetegség korai markerének. A magas plazma ET-1 koncentráció utalhat azonban a már kialakult, előrehaladott, de még tünetmentes ischaemias szervkárosodásra, ezért magas plazma ET-1 érétkek esetén a silent ischaemia veszélye miatt - a cardiovascularis szűrés indokolt. A hypertoniás cukorbetegekben mért alacsonyabb plazma NO 2 +NO 3 szint szintén utal az endothelialis dysfunctio kialakulására. 6
3. Sem 1-es sem 2-es típusú cukorbetegek vizsgálata során nem találtunk kapcsolatot a plazma ET-1 szint alakulása és a: plazma HbA1c, a szérum glukóz, és szérum kreatinin koncentráció; a testtömeg index, és az életkor között. 4. A radioimmunassay mérések során alkalmazott extrakciós metodikákat összehasonlítva a Sep-pack C18 oszlopon történt extrakció bizonyult érzékenyebb vizsgáló módszernek. Az 1-e és 2-es típusú cukorbetegek vizsgálata során talált eltérő eredmények a két betegségcsoport eltérő pathomechanismusából adódhatnak. 1-es típusú cukorbetegségben a plazma ET-1 koncentráció emelkedése az endothelialis dysfunctio korai markerének bizonyult, amelyet 2-es típusú cukorbetegek vizsgálata során nem tudtunk igazolni. 2-es típusú diabetes mellitusban endogén hyperinsulinaemia állhat fenn. Az inzulin fokozza az ET-1 szintézisét és elválasztását, azonban, ha ez a szekréció a simaizmok felét történik, akkor a plazma ET-1 szintek alakulása nem feltétlenül tükrözi az abluminálisan kiválasztott endothelin-1 mennyiséget. Az inzulin az ET A receptor számot is emeli, így az ET-1 felvétel és hatás fokozott lehet annak ellenére, hogy ez nem reflektálódik a plazmaszintekben. 2-es típusú cukorbetegek vizsgálata során a szöveti ET-1 elválasztás mérése megfelelőbb lenne az ET-1 szerepének tisztázásához, azonban ez in vivo nehezen kivitelezhető. A dolgozat témájában megjelent közlemények: 1. Sármán B., Tóth M., Somogyi A.: Az endothelin-1 és szerepe diabetes mellitusban. Orvosi Hetilap, 138: 2877-2881, 1997. 2. B. Sármán, M. Tóth, A. Somogyi: Role of Endothelin-1 in Diabetes Mellitus. Diabetes/Metabolism Reviews, 14: 171-175, 1998. (IF: 1,955) 3. B. Sármán, K. Farkas, M. Tóth, A. Somogyi: Circulating plasma endothelin-1, plasma lipids and complications in type 1 diabetes mellitus. Diabetes Nutrition and Metabolism Clinical and Experimental 13: 142-148 2000. (IF: 0,964) 7
4. Sármán B., Farkas K., Tóth M., Ruskoaho, H., Somogyi A: Az inzulin terápia hatása a vazoaktív faktorok koncentrációjára 2-es típusú diabetes mellitusban. Diabetológia Hungarica, 10 (2): 7-14, 2002 5. B. Sármán, K. Farkas, M.Tóth, A. Somogyi: Endothelin-1 is a marker of advanced vascular complications in type 2 diabetes mellitus. (közlésre benyújtva) 6. Farkas K., Szaleczky E., Sármán B., Kocsis I., Jermendy Gy., Somogyi A.: A nitrit/nitrát plazmaszintek és az antioxidáns státus vizsgálata 1-es típusú cukorbetegségben szenvedőkben. Diabetológia Hungarica 8:13-18, 2000. 7. K. Farkas, B. Sármán, Gy. Jermendy, A. Somogyi: Endothelial nitric oxide in diabetes mellitus: too much or not enough? Diabetes Nutrition and Metabolism Clinical and Experimental 13: 287-297, 2000. (IF: 0,964) 8. Somogyi A., Szaleczky E., Pusztai P., Braun L., Sármán B.: A plazma antioxidánsai II típusú cukorbetegekben. Magyar Belorvosi Archívum, 50:187-192, 1997. 9. Somogyi A., Sármán B., Pusztai P.: Az 1-es típusú diabetes mellitus patogenezisében szerepet játszó tényezők. Diabetologica Hungarica, 3: 127-133, 1998. További közlemények 10. Molnár J., Sármán B., Pusztai P., Kocsis I., Somogyi A.: Intenív inzulin kezelésben részesülő 1. típusú cukorbetegek szérum szelén koncentrációja. Diabetologica Hungarica: 6:205-208, 1998. 11. Sármán B.: UKPDS vizsgálat, a diabétesz új osztályozása. Kardioknoll, IV: 9-11, 1999. 12. Somogyi A., Sármán B.: A diabetes mellitus diétás kezelése. Táplálkozás, Anyagcsere, Diéta, 2: 7-11, 1997. 13. Somogyi A, Sármán B.: Vezérfonal a diabetes mellitus szövődményeinek prevenciójához, Rehabilitáció, IX. évf. 1: 6-9, 1999. 8
14. Somogyi A, Sármán B.: Hormonpótlás, - cukoranyagcsere diabetes mellitus. Háziorvosi Továbbképző szemle 5: 299-304, 1999. 15. Hutás G., Sármán B., Pusztai P., Végső Gy., Somogyi A.: :Diabeses mastopathia 1. típusú, hosszú ideje fennálló diabetes mellitusban. Diabetológia Hungarica 8: 177-182, 2000. 16. Somogyi A, Sármán B.: Ambuláns vérnyomás monitorozás (ABPM) azaz 24 órás vérnyomásmérés diabetes mellitusban. Granum 2: 9-13, 2000. IDÉZHETŐ ABSTRACTOK 1. Sármán B, Farkas K, Tóth M, Somogyi, A.: Az endothelin-1 szerepének vizsgálata inzulin dependens diabetes mellitusban. Diabetologia Hungarica 6(Supp.l): 61; 1998. 2. Sármán B, Tóth M, Farkas K, Somogyi, A., Tulassay Zs, Determination of circulating plasma endothelin-1 concentration in type 1 diabetes mellitus. Diabetologia 41, Suppl. 1, 318 1998; (IF: 4,986) 3. Sármán B., Tóth M., Pusztai P., Somogyi A., Tulassay Zs.: Az Endothelin-1 plazmakoncentrációjának alakulása 1-es típusú cukorbetegségben. Magyar Belorvosi Archívum Suppl. 3: 300; 1998. 4. Sármán B, Tóth Miklós, Somogyi Anikó: Vérzsírok hatása a vasoaktiv endothelin-1 plazma koncentrációjára 1. típusú cukorbeteg és nem cukorbeteg egyénekben. Diabetológia Hungarica, 7; Suppl.:1., 1999. 5. B. Sármán, M. Tóth, I. Kocsis, A. Somogyi: Is plasma ET-1 a marker of vascular complications in type 2 diabetes mellitus? Diabetologia 42, Suppl. 1, A320, 1999. (IF: 5,177). 6. Sármán B., Farkas K., Szaleczky E. Müzes Gy. Somogyi A.: Lehet-e a keringő plasma endothelin-1 az érszövődmények markere 2-es típusú diabetes mellitusban? Diabetológia Hungarica, 8; Suppl.1, 2000. 9
7. B. Sármán, K Farkas, M Tóth, A. Somogyi: Is there an associacion between exogen insulin therapy and vasoactive substances in type 2 diabetes mellitus. Diabetologia Vol. 43 suppl.1. pp.a 271 2000 (IF:5,721) 8. Sármán B., Ruzicska Éva, Toth M., Pusztai P., Somogyi A.: Az insulin terápia, a plazma nitrit/nitrát szint és a keringő endothelin-1 kapcsolata a diabetes mellitusban Folia Hepatologia 2001 6. Suppl. 1. 9. Sármán B., Farkas K., Tóth M., Pusztai P., Somogyi A: Az exogén inzulinterápia és a plazma endothelin-1 koncentráció 2-es típusú diabetes mellitusban. Diabetológia Hungarica 9 (Suppl.1): 39-40, 2001. 10. Sármán B., Ruzicska É., Tóth M., H. Ruskoaho, Somogyi A: Lehet-e a plazma ET-1 az érszövődmények markere 1-es típusú diabetes mellitusban? Diabetológia Hungarica (Suppl. 1) 2002 (közlés alatt) 11. Szaleczky E., Braun L., Sármán B., Pusztai P., Tulassay Zs., Somogyi A.: Antioxidant vitamin levels in well controlled type 2 diabetes mellitus. Diabetologia Suppl. 40. A 303, 1997. (IF:5,347) 12. Somogyi, A., Szaleczky, E., Pusztai P, Farkas K, Sármán B, A zsíroldékony antioxidans vitaminok koncentrációjának alakulása I. típusú cukorbetegségben és dyslipidaemiaban. Diabetologia Hungarica 6(Supp.l): 63; 1998. 13. Pusztai P, Szaleczky E, Sármán B, Kocsis I, Somogyi, A., Intenzív inzulinkezelésben részesülő I. típusú cukorbetegek antioxidans statusa. Diabetologia Hungarica 6(Supp.l): 59; 1998. 14. Molnár J., Sármán B, Pusztai P, Kocsis I, Somogyi, A.: Intenzív inzulinkezelésben részesülő I. típusú cukorbetegségben megbetegedettek serum szelén koncentrációja. Diabetologia Hungarica 6(Supp.l): 51; 1998. 15. Farkas K, Sármán B, Szaleczky, E., Herold M, Somogyi, A., Az A-vitamin koncentráció vizsgálata I. típusú cukorbetegekben. Diabetologia Hungarica 6(Supp.l): 14; 1998. 10
16. Szaleczky, E., Sármán B, Kocsis I, Somogyi, A.: Adequate antioxidant defence in type I. diabetes. Diabetologia 41, Suppl. 1, A321, 1998. (IF: 4,986) 17. Somogyi A, Szaleczky E, Pusztai P, Farkas K, Sármán B, Lipid soluble antioxidant vitamin status in IDDM patients with dyslipidaemia. Diabetologia 41, Suppl. 1, A349, 1998. (IF: 4,986) 18. Pusztai P, Sármán B, Szaleczky E,Molnár J, Somogyi A, Vitamin E concentration in hyperlipidaemia. Diabetologia 41, Suppl. 1, A349, 1998. (IF: 4,986) 19. Farkas K, Sármán B, Molnár J, Kocsis I, Somogyi A: Antioxidant vitamin status in IDDM and hyperlipidaemia. Diabetologia 41, Suppl. 1, A349, 1998.(IF: 4,986) 20. Ruzicska É., Sármán B., Herold M., Somogyi A: Vitaminstatus 2-es típusú diabetes mellitusban. Diabetológia Hungarica, 8; Suppl.1, 2000. 21. Éva Ruzicska, B. Sármán, K. Farkas, M. Herold, A. Somogyi : Effect of metabolic parameters on A and E vitamin levels in type 2 diabetes Diabetologia Vol. 43 suppl.1. pp.a 290 2000 (IF:5,721) 22. Éva Ruzicska, B. Sármán, G. Földes, R. dechâtel, R. Heikki, M. Toth, A. Somogyi: Cardiac Expression of Natriuretic Substances in Experimental Diabetes Mellitus Combined with Angiotensin II Incuded Cardiac Hypertrophy Diabetologia Vol. 44 suppl.1. pp.a 306 2001 (IF:5,721) 11