Egyed szintje Ökoszisztéma Szervrendszerek szintje Szervek szintje Szöveti szint Sejtek szintje Atomok szintje Molekulák szintje
TARTALOM: 1. Molekuláris biológiai/genetikai technikák 2. A genomika technikái 3. Komplex technikák Más előadásokban kerülnek tárgyalásra
TARTALOM (1): 1. Molekuláris klónozás 2. Polimeráz láncreakció (PCR) 3. Gél elektroforézis 4. Makromolekulák kimutatása 5. Gél retardáció 6. Footprint analízis 7. Immunhisztokémia 8. In situ hibridizáció 9. FRET 10. Áramlásos citometria 11. FACS
1. Molekuláris klónozás a. Restrikciós endonukleázok b. DNS ligázok c. Plazmid vektorok d. Restrikciós/ligálásos klónozás e. Egyéb enzimek
A restrikciós enzimek 1 1978 Werner Arber Daniel Nathans Hamilton O. Smith EcoRI
A restrikciós enzimek 1 5 túlnyúló vég: (pl. EcoRI) 3 túlnyúló vég: (pl. KpnI) Tompa vég: (pl. SmaI) VÁGÁS ELŐTT VÁGÁS UTÁN 5 - GAATTC -3 5 - G-3 5 -AATTC -3 3 - CTTAAG -5 3 - CTTAA-5 3 -G -5 5 - GGTACC -3 5 - GGTAC-3 5 -C -3 3 - CCATGG -5 3 - C-5 3 -CATGG -5 5 - CCCGGG -3 5 - CCC-3 5 -GGG -3 3 - GGGCCC -5 3 - GGG-5 3 -CCC -5 EcoRI metiláz RESTRIKCIÓS MODIFIKÁCIÓS RENDSZER CH 3 5 - GAATTC -3 5 - G-3 5 -AATTC -3 3 - CTTAAG -5 3 - CTTAA-5 3 -G -5 CH 3 EcoRI RE nem vág X
DNS ligáz 2 DNS ligáz Egy DNS molekula Két DNS molekula
Plazmidok 3 1. Kisméretű nagy kópiaszámú 1. Fertilitás plazmidok 2. Rezisztencia plazmidok 3. Virulencia plazmidok 2. Nagyméretű kis kópiaszámú
3 Plazmid vektorok 1. Klónozó vektorok 2. Génbeviteli vektorok 3. Génexpressziós vektorok
3 Plazmid vektorok Plazmid vektor Rekombináns plazmid
Molekuláris klónozás 3 Eredeti DNS molekulák: EcoRI hely EcoRI hely EcoRI enzim Ligáz Rekombináns DNS molekula:
Molekuláris klónozás 4 Plazmid vektor DNS fragments Rekombináns plazmid Rekombináns plazmid előállítása ligálással Transzformáció (sejtbe juttatás) E. coli Sokszorozódás a sejtben Baktérium sejtek sokszorozódása Egy kolónia egyetlen sejtből származik
lac operon 4 DNS P laci C E O lacz lacy laca T DNS represszor CAP hely pol kötő hely operátor strukturális gének terminátor laktóz rep
lacz gén 4 - X-Gal kromogén szubsztrát DNS P rep laci C E O lacz lacy laca T DNS represszor CAP hely pol kötő hely operátor strukturális gének terminátor indoxyl galaktóz IPTG X-Gal
lacz gén 4 - X-Gal kromogén szubsztrát DNS P rep laci C E O lacz lacy laca T DNS represszor CAP hely pol kötő hely operátor strukturális gének terminátor pol -gal permeáz transzacetiláz
lacz gén a klónozásban 4 DNS P lacz laci C E O -fragment lacy laca T DNS represszor CAP hely pol kötő hely operátor strukturális gének terminátor lacz -fragment Idegen DNS lacz - lacz -
Egyéb enzimek a klónozásban 5 5 -AGTGGGAATTCAAGGC-3 3 -TCACCCTTAAGTTCCG-5 EcoRI hasítás 5 -AGTGGG-3 3 -TCACCCTTAA-5 5 -AATTCAAGGC-3 3 -GTTCCG-5 - Klenow fragment - S1 nukleáz - Alkalikus foszfatázok 5 -AGTGGGAATT-3 3 -TCACCCTTAA-5 5 -AGTGGG-3 3 -TCACCC-5 5 -AGTGGG-OH-3 3 -TCACCCTTAA-P-5 5 -AATTCAAGGC-3 3 -TTAAGTTCCG-5 5 -CAAGGC-3 3 -GTTCCG-5 5 -P-AATTCAAGGC-3 3 -HO-GTTCCG-5 5 - P 3 -HO P - 5 OH-3 P - 5 defoszforiláció 5 -AGTGGG-OH-3 3 -TCACCCTTAA-5 5 -AATTCAAGGC-3 3 -HO-GTTCCG-5
2. PCR: 6 1993 polimeráz lánc reakció Forward primer Reverz primer denaturáció annealing szintézis 1. ciklus 2. ciklus 3. ciklus
PCR A PCR reakcióhoz szükséges: 1. DNS templát 2. DNS polimeráz 3. Két primer 4. dntp-k 5. Puffer 6 Denaturáció (2 DNS szál szétválik) Összekapcsolás (a primer kapcsolódása az egyszálú DNS-ekhez) Szintézis (új DNS szál képződése a primerről a DNS pol által) A DNS mennyisége minden ciklusban duplázódik (optimális körülmények között) melegítés 94-96 C -ra hűtés 60-65 C -ra melegítés 68-72 C -ra Primer Új DNS Régi DNS
3. Gél elektroforézis 7 a. Agaróz gél elektroforézis b. Poliakrilamid gél elektroforézis (PAGE)
Agaróz gél elektroforézis 7 Molekulasúly marker
Agaróz gél elektroforézis 7 Etidium bromidban való áztatás A DNS csíkok fluoreszkálnak UV UV UV
Poliakrilamid gél elektroforézis 7 Molekulasúly marker 40 nukleotid gél 10 nukleotid
SDS-PAGE Sodium dodecil szulfát poliakrilamid gél elektroforézis 7 Fehérje 2 alegysége diszulfid híddal összekötve Egy alegységből álló fehérje -S-S- A SH HS B Negatív töltésű SDS molekulák C A C B A futás független a (1) molekulaszerkezettől (denaturáció) (2) és az aminosav összetételtől (maszkírozó hatás)
4. Makromolekulák kimutatása a. Southern blot b. Northern blot c. Western blot d. Eastern blot
Gél elektroforézis Southern blot 8 DNS Restrikciós emésztés Sir Edwin Southern Nitrocellulóz membrán Autoradiogram Filter papír Nitrocellulóz Gél Hibridizáció radioaktívan jelölt DNS próbával Lúgos oldat DNS transzfer a kapilláris erő felhasználásával: gélről nitrocellulóz membránra
Southern blot 8 (A) DNS transzfer gélről a membránra DNS Megemésztett marker DNS Papír törölköző Nylon membrán Gél Agaróz gél Puffer Nylon membrán (B) Hibridizációs analízis P Jelölt DNS próba Hibridizáló csíkok Nylon membrán Röntgen film
Northern blot 9 Sejtek, szövetek RNS kivonat RNS Agaróz gél elektrofotézis RNS marker RNS minta (hasonlóan a genomiális DNS-hez, nincsenek nem egzakt csíkok a molekulák heterogenitása miatt) Szűrő papír Blottolás Nitrocellulóz Gél Hibridizáció és autoradiográfia
Northern blot 9 Sejtek RNS kivonat Gél elektroforézis RNS minta Blottolás, Northern hibridizáció, autoradiográfia Elektroblot DNS próba hibridizációja a komplementer RNS molekulához
Western blot 10 (A) Elektroforézis/transzfer (B) Antitest reakció Elektromos áram Inkubáció antitest-1-el: Ab 1 ( ) SDS-PAGE Membrán Inkubáció enzimmel kötött antitesttel: Ab-2 ( ) (C) Színreakció Szubsztrát hozzáadása
5. Gél retardáció analízis 11 DNS/fehérje kölcsönhatás kimutatása Restrikciós fragmensek Restrikciós fragmensek + magi proteinek DNS marker
6. Footprint analízis DNS/fehérje kölcsönhatás kimutatása 12 Végjelölt restrikciós fragmensek - sejtmagi kivonat Végjelölt restrikciós fragmensek + sejtmagi kivonat DNS-kötő protein Részleges DNáz-I emésztés Footprint Gél elektroforézis, autoradiográfia Footprint (lábnyom)
7. Immunhisztokémia 13 - immunfluoreszcencia fluoreszcens festék B anti-c antitest B A Y Y C B B B A C B kecske anti-nyúl másodlagos antitest nyúl anti-c elsődleges antitest sejtfelszíni antigének citoplazmatikus antigének E sejtmag D citoplazma sejtfelszíni antigének citoplazmatikus antigének E sejtmag D citoplazma Közvetlen (direkt) módszer Közvetett (indirekt) módszer
7. Immunhisztokémia - immunperoxidáz módszerek 13 DAB + H 2 O 2 Ni-DAB + H 2 O 2 - peroxidáz diamino-benzidin (peroxid jelenlétében): barna csapadék - biotin avidin peroxidáz peroxidáz B B A Y C B kecske anti-nyúl másodlagos antitest nyúl anti-c elsődleges antitest Y peroxidáz Kecske anti-nyúl antitest (másodlagos antitest) Nyúl anti-c antitest sejtfelszíni antigének citoplazmatikus antigének E sejtmag D citoplazma Közvetett (indirekt) módszer peroxidáz biotin anti-nyúl antitest (másodlagos antitest) Y anti-c antitest peroxidáz peroxidáz avidin
7. Immunhisztokémia - immunperoxidáz módszerek 13 DAB + H 2 O 2 Ni-DAB + H 2 O 2 ABC módszer (ABC = avidin-biotin complex) Y avidin biotin peroxidáz Y Y anti-nyúl antitest (másodlagos antitest) elsődleges antitest antigén
7. Immunhisztokémia 13 - alkalikus foszfatáz - digoxigenin anti-digoxigenin alkalikus foszfatáz alkalikus foszfatáz B B A sejtmag Y C citoplazma kecske anti-nyúl másodlagos antitest nyúl anti-c elsődleges antitest Közvetett (indirekt) módszer B sejtfelszíni antigének citoplazmatikus antigének E D DIG Y anti-c antitest alk. foszfatáz anti-nyúl antitest Y alk. foszfatáz anti-nyúl antitest anti-c antitest Y DIG anti-c antitest alk. foszfatáz
8. In situ hibridizáció 14 - DNS vagy mrns kimutatása A próba jelölése: 1. Radioaktív (S 35 ) 2. Nem radioaktív - fluoreszcens - enzimatikus Radioaktív S 35 biotin próba (DNS vagy RNS) fluoreszcens festék sztreptavidin Fluoreszcens FISH avidin biotin Enzimatikus peroxidáz anti-dig antitest cél-dns DIG fluoreszcens festék fluoreszcencia Anti-DIG antitest DIG anti-dig-peroxidáz DIG próba cél-dns
Fluoreszcens in situ hibridizáció Metafázisos kromoszóma Osztódó sejt 14 tárgylemez A DNS denaturálódik Fluoreszcens jelölés
9. FRET Fluorescence resonance energy transfer 15 Kék fluoreszcens protein Sárga fluoreszcens protein UV fény gerjesztés Kék fény kibocsátás Kék fény gerjesztés Sárga fény kibocsátás Protein X Protein Y Nincs fehérje kölcsönhatás Van fehérje kölcsönhatás UV fény Kék fény UV fény Sárga fény
10. Áramlásos citometria 16 Flow cytometry PMT3 PMT4 Minta Fotomultiplier-ek PMT2 PMT1 szűrők Kétszínű szűrők sejtek Scatter detektorok Lézer Válogató
11. FACS Fluorescence activated cell sorting 17 Minta Burok folyadék Zöld fluoreszcencia vörös fluoreszcencia Fénysugár megosztó Lézer 90 0 fényszóró (garnularitás) Előre fényszóró (méret) Töltő gallér Detekciós lemezek Gyűjtő csövek Hulladék