A terhességi trofoblaszt betegségek potenciális biológiai markerei Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei Dr. Végh György Témavezető: Dr. Fülöp Vilmos Dr. Kopper László Semmelweis Egyetem Egészségtudományi Kar Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika Budapest 2001
SUMMARY Gestational trophoblastic diseases are a spectrum of pregnancy related, invasive and noninvasive proliferative trophoblastic disorders, which include partial mole, complete mole and gestational choriocarcinoma. Despite important advances in the diagnosis and therapy of these diseases, molecular pathogenesis has remained largely unknown. Our purpose was to identify potential differences in gene expression between normal placenta and gestational trophoblastic tumors. Atlas human cdna expression array membrane hybridization technique was used to study the gene expression pattern in normal trophoblast and choriocarcinoma cell lines. As compared to normal trophoblast cells, 6 genes were upregulated and 3 genes were downregulated in choriocarcinoma cells. The downregulation of Hsp-27 in choriocarcinoma cells was confirmed both in vitro with cell lines and in vivo with paraffin sections using RT-PCR, Western-blot and immunohistochemical methods. Furthermore the expression of c-erbb proteins, and matrix metalloproteinases and their inhibitors were invastigated with paraffin sections by immunohistochemistry. Our findings summerized in this thesis are the following: 1. Atlas cdna array is a useful and suitable technique to identify differentially expressed genes in normal and malignant cells or tissues, and suitable for search after new biological markers as well. 2. Hsp-27 may play an important role in the genesis and the development of early placenta and the differentiation of trophoblasts. Furthermore, the downregulation of Hsp-27 in choriocarcinoma may contribute to the extreme sensitivity of malignant trophoblastic tumors to chemotherapy. 3. Supposingly c-erbb protein family may be important in the pathogenesis of gestational trophoblastic diseases and in the progression to persistent postmolar tumors. 4. The expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors may be related to the development of gestational trophoblastic diseases.
BEVEZETÉS A terhességi trofoblaszt betegségek csoportját a terhességgel kapcsolatos invazív és noninvazív proliferatív trofoblaszt elváltozások képezik, amelyek főbb formái a részleges mola hydatidosa, a teljes mola hydatidosa és a terhességi choriocarcinoma. A trofoblaszt tumorok szinte egyedülálló tulajdonsága a gyors lokális invazió, illetve a távoli metasztázis képzés ellenére is hatékony kemoterápia iránti érzékenység. A betegség diagnosztikájában és kezelésében elért óriási eredmények ellenére azonban a patogenetikai tényezők mindeddig ismeretlenek maradtak. A choriocarcinoma kialakulásának kockázata komplett mola hydatiosa után fokozott, ennek ellenére nem áll rendelkezésre olyan paraméter, amely előre jelezné a molás megbetegedés progresszióját. A sejtszaporodás egy bonyolult szabályozási folyamat, amelyet meghatározott protoonkogének és tumorszupresszor gének koordinált kölcsönhatása irányít. A korai méhlepényben a fiziológiás onkogén kifejeződés és a terhességi trofoblaszt betegségekben a megváltozott onkogén expresszió közötti határok elmosódhatnak, a különbségek magyarázata pedig nem teljesen ismert. Néhány protoonkogén aktivációját, valamint tumorszupresszor gén megváltozott kifejeződését már kimutatták terhességi trofoblaszt daganatokban is. Több daganatféleség esetében kimutatták, hogy a protoonkogének és tumorszupresszor gének sejtproliferációra és differenciálódásra való hatása összefüggésben van a daganatos átalakulás és daganatfejlődés többlépcsős folyamatával. Ezért a normál méhlepényben és a terhességi trofoblaszt tumorokban túlzottan, vagy csökkent mértékben kifejeződő protoonkogének, tumor szupresszor gének, illetve fehérjetermékeik, valamint egyéb funkcionálisan fontos gének kutatása és további elemzése mélyebb betekintést nyújthat a betegség patogenezisébe.
CÉLKITŰZÉSEK Munkám célja az volt, hogy a normál lepényi és kóros trofoblaszt sejtek, illetve szövetek proliferációját és invázióját befolyásoló funkcionálisan fontos gének és fehérjetermékeik eltérő kifejeződését és viselkedését, valamint azok lehetséges patogenetikai szerepét vizsgáljuk normál terhességekben és a terhességi trofoblaszt betegségekben, az alábbi megközelítésekből. 1. Az Atlas human cdna expression array membránhibridizációs módszer segítségével a normál trofoblaszt és choriocarcinoma sejtvonalak génkifejeződésének mintázatát hasonlítottuk össze 588 ismert funkcionális fehérje génjeinek expressziója közötti potenciális különbségeket keresve. 2. Kemoterápia rezisztencia kialakulásában játszott szerepéből kiindulva vizsgáltuk a Hő shock fehérje 27 (Hsp-27) kifejeződését a normál placentában és choriocarcinomában in vitro és in vivo körülmények között. 3. A c-erbb fehérjék családjának expresszióját elemeztük normál méhlepényben és terhességi trofoblaszt betegségekben. Tanulmányoztuk továbbá ezeknek a proteineknek a lehetséges szerepét a posztmoláris gesztációs trofoblaszt tumorok kialakulásában és klinikai kimenetelében. 4. A jó és rosszindulatú trofoblaszt sejtek anyai szövetekbe történő inváziójában szerepet játszó mátrix metalloproteinázok (MMP-k) és gátlóik jelenlétét vizsgáltuk a normál placentában és a terhességi trofoblaszt betegségekben. Kiértékeltük, vajon ezeknek a fehérje enzimek kifejeződésében tapasztalható különbségek kapcsolatba hozhatóak-e posztmoláris trofoblaszt tumorok kialakulásával és a betegség prognózisával.
A KÍSÉRLETEK SORÁN HASZNÁLT MÓDSZEREK 1. A humán normál trofoblaszt (3A-Sub-E) és a choriocarcinoma (Jar, JEG-3) sejtvonalak tenyésztése. 2. Klinikai adatok és szövettani minták: 51 terhességi trofoblaszt betegség és 11 normál első trimeszteri terhességmegszakítás szövettani anyagát használtuk fel munkánkhoz. A terhességi trofoblaszt betegségek között 16 részleges mola, 25 teljes mola és 10 terhességi choriocarcinoma szerepelt. A teljes molaterhességek közül 8 esetben (32.0%) alakult ki perzisztens posztmoláris terhességi trofoblaszt tumor. 3. A teljes RNS és mrns izolálása a normál trofoblaszt és choriocarcinoma sejtekből. 4. Sejtmag és citoplazmatikus fehérje izolálás a sejtvonalakból. 5. A normál trofoblaszt és choriocarcinoma sejtek génkifejeződés különbségeinek meghatározása az Atlas human cdna expression array membránhibridizációs technikával. 6. A Hsp-27, a 60S Riboszómális fehérje L6 (RP-L6) és a DNS repair fehérje (HIP- 116) sejtvonalakban való megjelenésének meghatározása reverz transzkripciós polimeráz láncreakcióval (RT-PCR). 7. A Hsp-27 sejtvonalakban való megjelenésének meghatározása Western-blot technikával. 8. A Hsp-27, az EGFR, a c-erbb-2, a c-erbb-3, a c-erbb-4, az MMP-1, az MMP-2, az MMP-3, az MMP-9, az MMP-13 és a TIMP-1 (Tissue inhibitor of metalloproteinase 1) szövettani metszeteken végzett immunhisztokémiai analízise. A Hsp-27 kifejeződésének immunhisztokémiai vizsgálata a normál trofoblaszt és choriocarcinoma sejtvonalakon. 9. Az EGFR jelenlétének vizsgálata szövettani metszeteken in situ mrns hibridizációval.
EREDMÉNYEK Kísérleti eredményeink az alábbiakban foglalhatók össze: 1. Az Atlas human cdna expression array membránhibridizációs technikát használva 588 ismert génből kilenc gén expressziója mutatott erős különbséget a normál trofoblaszt és choriocarcinoma sejtvonalak között. Ebből 3 gén esetében: a Hsp-86, a Hsp-27 és a Fibronektin receptor -alegység (FR- ) gének fokozottan fejeződnek ki a normál méhlepény trofoblaszt sejtekben a choriocarcinoma sejtekhez képest. Hat gén: a Protoonkogén c-myc, NF- B transzkripciós faktor p65, GATA-2 transzkripciós faktor, RP-L6, HIP-116, és a humán ideg növekedési faktor (hngf), pedig a choriocarcinomában expresszálódik erősebben a normál placentához képest. Ezek közül három esetben RT-PCR eljárással is igazoltuk a hibridizációval kapott eredményeket. 2. Az Atlas membránon tapasztalt eltérő Hsp-27 expressziót, nevezetesen csak a normál trofoblaszt sejtekben való kifejeződését igazoltuk RT-PCR, Western-blot és immunhisztokémiai módszerekkel, nukleinsav és fehérje szinteken a normál trofoblaszt és choriocarcinoma sejtvonalakon. Az immunhisztokémiai vizsgálatot formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövettani metszeteken is elvégeztük. Az eredmény, hasonló volt, a choriocarcinomában csökkent, a placentában fokozott Hsp-27 expressziót találtunk. 3. Az epidermális növekedési faktor receptor (EGFR) kifejeződése choriocarcinomában és a teljes mola szincicio- és citotrofoblaszt sejtjeiben szignifikánsan erősebb, mint a részleges mola és a placenta szincicio- és citotrofoblasztjaiban. Ez a megfigyelés az immunhisztokémiai és az in situ mrns hibridizációs módszerrel végzett kísérletekben egyaránt összhangban volt. Ugyancsak szignifikánsan nagyobb a c-erbb-2 protein koncentrációja a choriocarcinoma tumorsejtjeiben és a teljes mola extravillozus trofoblaszt sejtjeiben, mint a részleges molában és a normál méhlepényben. A c-erbb-3 és c- erbb-4 fehérjék megjelenése nem különbözött a normál lepény és a terhességi trofoblaszt betegségek csoportjai között. Végül az EGFR és a c-erbb-3 fehérjék erős kifejeződése a teljes mola hydatidosák extravillozus trofoblaszt sejtjeiben szignifikáns összefüggésben volt a posztmoláris perzisztens trofoblaszt tumorok kialakulásával.
4. Az MMP-1 és az MMP-2 kifejeződése choriocarcinomában szignifikánsan erősebb, mint a normál méhlepény, részleges és teljes molák szinciciotrofoblaszt sejtjeiben, valamint a normál méhlepény extravillozus trofoblaszt sejtekben. Ugyancsak szignifikánsan erősebb MMP-2 immunreaktivitást találtunk a részleges és a teljes molák extravillozus trofoblaszt sejtjeiben, mint a normál lepény extravillozus trofoblasztjaiban. Az MMP-3, az MMP-9 és az MMP-13 megjelenése nem különbözött a placenta és a terhességi trofoblaszt betegségek csoportjai között. A TIMP-1 szignifikánsan alacsonyabb koncentrációban fejeződött ki a choriocarcinomában, mint a normál lepényben, a részleges molában és a teljes molában. Végül nem találtunk összefüggést a vizsgált enzimek és a posztmoláris perzisztens trofoblaszt tumorok kialakulása között.
KÖVETKEZTETÉSEK Eredményeinkből az alábbi következtetések vonhatók le: 1. Eredményeink azt mutatják, hogy az Atlas human cdna expression array membránhibridizációs technika hasznos és alkalmas módszer a normál és tumoros sejtek génkifejeződési különbségeinek meghatározásra. Alkalmas továbbá olyan biológiai markerek keresésére is, amelyek a későbbiekben diagnosztikus és prognosztikus értékűek lehetnek a malignus betegségek előrejelzésében. Adataink arra utalnak, hogy a különböző mértékben expresszálódó gének meghatározása fontos betekintést adhat a terhességi trofoblaszt betegségek patogenezisébe és további kutatást érdemel. 2. Vizsgálataink alátámasztották azt a korábbi megfigyelést, hogy a Hsp-27 nagy koncentrációban expresszálódik a korai méhlepényben. Megerősítettük azt a feltételezést, hogy a Hsp-27 szerepet játszik a korai lepény kialakulásában, fejlődésében és a trofoblasztok differenciálódásában. Ezen kívül a Hsp-27-nek a kemoterápia rezisztencia kialakításában játszott szerepéből, valamint a choriocarcinomában való hiányos kifejeződéséből kiindulva racionális magyarázatot találtunk a trofoblaszt tumorok egyedülálló kemoterápia érzékenységére. Ennek a bizonyítására természetesen még további funkcionális kísérletek szükségesek. Amennyiben feltételezésünk igaz, a betegség felismerésekor kiszűrhetőek a kemoterápiára rezisztens esetek, és ezeknél a betegeknél hatékonyabb citosztatikus szerek kombinációja, vagy a megszokott protokolloktól elérően, új és eredeti kezelési lehetőségek jönnének szóba. 3. Eredményeinkből arra következtethetünk, hogy az EGFR és a vele rokon c-erbb onkogén család kifejeződése kulcsszerepet játszik a terhességi trofoblaszt betegségek patogenezisében és megjelenésében. Ugyanakkor az EGFR és c-erbb-3 proteinek emelkedett koncentrációja teljes molákban korai markerként jelezheti a perzisztens posztmoláris terhességi trofoblaszt tumorok kifejlődését a méhkiürítést követően. 4. Vizsgálataink során kimutattuk, hogy az MMP-k és szöveti inhibitoraik fontos szerepet játszanak a terhességi trofoblaszt betegségek patogenezisében és progressziójában.
Ugyanakkor az MMP-knek úgy tűnik nincs szerepe a poszmoláris perzisztens trofoblaszt tumorok kialakulásában a méhkiürítést követően.
PUBLIKÁCIÓS LISTA 1. Az értekezéssel kapcsolatos külföldi közlemények: 1. Végh Gy, Tuncer ZS, Fülöp V, Genest DR, Mok SC, Berkowitz RS: Matrix metalloproteinases and their inhibitors in gestational trophoblastic diseases and normal placenta. Gynecol Oncol 75: 248-253, 1999. (IF: 1.860) 2. Végh Gy, Fülöp V, Liu Y, Ng SW, Tuncer ZS, Genest DR, Páldi-Haris P, Földi J, Mok SC, Berkowitz RS: Differential gene expression pattern between normal human trophoblast and choriocarcinoma cell lines: Downregulation of Heat shock protein-27 in choriocarcinoma in vitro and in vivo. Gynecol Oncol 75: 391-396, 1999. (IF: 1.860) 3. Tuncer ZS, Végh Gy, Fülöp V, Genest DR, Mok SC, Berkowitz RS: Expression of epidermal growth factor receptor-related family products in gestational trophoblastic diseases and normal placenta and its relationship with development of postmolar tumor. Gynecol Oncol 77: 389-393, 2000. (IF: 1.972) 1. Az értekezéssel kapcsolatos hazai közlemények: 1. Végh Gy, Fülöp V, Páldi-Haris P, Földi J, Cseh I: A protoonkogének és tumorszupresszor gének kifejeződése terhességi trofoblaszt tumorokban és a normál lepényben. In: A szülészet-nőgyógyászat aktuális elméleti és gyakorlati kérdései. Ed: Cseh I; Richter Gedeon RT, Budapest, 1998, 252-255. (ISBN: 963-715218010) 2. Fülöp V, Mok S, Szigetvári I, Szepesi J, Gáti I, Dancsó J, Végh Gy, Berkowitz RS, Doszpod J: Módosított, szelektív kalcium-foszfát precipitációs módszer alkalmazása a choriocarcinoma sejtekbe történő géntranszfekcióra. Klin Kisérl Med 25: 88-92, 1999. 3. Fülöp V, Cseh I, Mok S, Szigetvári I, Szepesi J, Dancsó J, Végh Gy, Berkowitz RS: A c- erbb-2 és c-fms onkogének kifejeződése normál lepényben és terhességi trofoblaszt betegségekben. Magy Nőorv L 62: 39-43, 1999. 4. Végh Gy, Fülöp V, Tuncer ZS, Genest DR, Cseh I, Mok SC, Berkowitz RS, Páldi-Haris P, Földi J, Szepesi J, Szigetvári I, Doszpod J: Az epidermális növekedési faktor receptor és a rokon jellegű c-erbb onkogének és termékeinek szerepe terhességi trofoblaszt betegségekben és a normál lepényben. Magy Nőorv L 63: 129-134, 2000. 5. Végh Gy, Fülöp V, Tuncer ZS, Cseh I, Mok SC, Berkowitz RS, Páldi-Haris P, Szepesi J, Szigetvári I, Gáti I, Doszpod J: Az MMP-1, MMP-3 és MMP-9 tumormarkerek megjelenése terhességi trofoblaszt tumorokban és a normál lepényben: Immunhisztokémiai analízisen alapuló tanulmány. Magy Nőorv L 63: 241-245, 2000.
6. Fülöp V, Végh Gy, Cseh I: Az onkogének és tumor szupresszor gének, valamint egyéb funkcionális fehérjék szerepe a normál lepényben és a terhességi trofoblaszt betegségekben. (review) A fogamzástól a változás koráig 3(1-2): 27-44, 2000. 7. Végh Gy, Fülöp V, Páldi-Haris P, Földi J, Cseh I, Mok SC, Szepesi J, Szigetvári I, Berkowitz RS, Doszpod J: Génkifejeződés eltéréseinek meghatározása normál és malignus trofoblaszt sejtvonalak között membránhibridizációs módszerrel. Magy Nőorv L 63: 403-407, 2000. 8. Fülöp V, Végh Gy, Cseh I, Mok SC, Berkowitz RS, Páldi-Haris P, Doszpod J, Földi J: A hő shock fehérje-27 kifejeződése normál méhlepényben és a choriocarcinomában. Magy Nőorv L 64: 23-27, 2001. 9. Fülöp V, Végh Gy, Doszpod J: A c-erbb családba tartozó onkofehérjék a normális lepényben és a terhességi trofoblaszt betegségekben (in vitro vizsgálatok). Orv Hetil 142: 1147-1154, 2001. 10. Végh Gy, Tuncer ZS, Cseh I, Mok SC, Berkowitz RS, Saoud G, Páldi-Haris P, Földi J, Doszpod J, Fülöp V: A zselatinázok és inhibitoruk szerepe a terhességi trofoblaszt betegségekben és a normál lepényben. A fogamzástól a változás koráig 2001. (in press) 1. Egyéb közlemények: 1. Cseh I, Végh Gy, Dancsó J: A portio vaginalis uteri diagnosztikus konizációja a terhesség alatt. Magy Nőorv L 60: 221-225, 1997. 2. Cseh I, Dancsó J, Thürmer A, Végh Gy, Arató G: Különböző cytológiai anyagvevő eljárások hatása a cervix szűrés eredményességére. Magy Nőorv L 61: 135-142, 1998. 3. Fülöp V, Végh Gy: A differenciáldiagnózis és progresszív betegellátás szerepe az uterus hegszétválás sikeres kezelésében. Magy Nőorv L 63: 246-248, 2000. 4. Murányi Z, Illyés M, Vajda M, Zsirai L, Végh Gy, Drávucz S: 24 órás ambuláns vérnyomás monitorizálással szerzett tapasztalataink patológiás terhességekben. Magy Nőorv L 63: 439-443, 2000. 5. Dancsó J, Vajda M, Végh Gy, Fülöp V: Testösszetétel vizsgálata bioelektromos impedancia analízissel. Magy Nőorv L 64, 2001. (in press) 1. Idézhető absztraktok:
1. Mitsányi A, Fedina L, Forgács B, Végh Gy, Pásztor E: Response patterns of postganglionic sympathetic neurons to volleys in cutaneous and muscular afferent nerves. Abstracts of the XXXII. Congress of the International Union of Physiological Sciences held in Glasgow, August 1-6. 3, 67-68, 1993. 2. Mitsányi A, Fedina L, Végh Gy, Forgács B, Pásztor E: Incidence of A- and C-responses in somatosympathetic reflexes to excitation of A+C fibre afferents of muscular and cutaneous origins. Neurobiology 2: 87, 1994. 3. Török M, Hamvas F, Végh Gy, Doszpod J: Passive versus activa sensorial cardiotocography in the prenatal period. Acta Obst Gynec Japon (Supplement) 49: 533, 1997. 4. Végh Gy, Fülöp V, Tuncer ZS, Mok SC, Berkowitz RS, Cseh I: Matrix metalloproteinases and their inhibitors in normal placenta and gestational trophoblastic diseases. Placenta (Supplement) 20: 60, 1999. (IF: 2.101) 5. Fülöp V, Tuncer ZS, Végh Gy, Mok SC, Berkowitz RS, Doszpod J: Expression of epidermal growth factor receptor family products in gestational trophoblastic diseases and normal placenta: Association of c-erbb-3 and c-erbb-4 with persistence in hydatidiform mole. Placenta (Supplement) 20: 56, 1999. (IF: 2.101) 6. Végh Gy, Fülöp V, Páldi-Haris P, Földi J, Mok SC, Doszpod J, Berkowitz RS: Identification of differences in gene expression between normal and malignant trophoblast cell lines using membrane hybridization technique: Downregulation of Heat shock protein-27 in choriocarcinoma. Placenta 21: A18, 2000. (IF: 2.587) 7. Fülöp V, Végh Gy, Tuncer ZS, Bátorfi J, Mok SC, Cseh I, Gáti I, Berkowitz RS: The role of epidermal growth factor receptor related c-erbb oncogene family products in gestational trophoblastic diseases and normal placenta. Placenta 21: A19, 2000. (IF: 2.587)