MODELLORGANIZMUSOK GENETIKÁJA Caenorhabditis elegans, nematoda, fonalféreg http://www.wormbook.org/ Sidney Brenner Egy egyszerű, soksejtes szervezet. Talajban él, baktériumokkal táplálkozik. Petricsészében E. coli pázsiton szaporítható. Hermafrodita és hím egyedek! A kifejlett hímnős, hermafrodita 1 mm. Pontosan meghatározott szomatikus sejtszám: A hermafrodita 959, a hím 1031 testi sejtből áll, de a hím jóval kisebb. Az L1 lárva 558 testi sejtből áll. Az állat a hengeresférgekhez/fonálférgekhez tartozik, melyek között számos állati és növényi élősködő is található. Átlátszó minden fázisban, sejtjeinek leszármazási vonala pontosan ismert. Sejtsors térkép. 3 nap! egyedfejlődés a megtermékenyítéstől a szaporodásig, szobahőmérsékleten: 250-1.000 megtermékenyített pete /egyed egyszerű anatómia I-V autoszóma + XX (a hímnél X/O) Önmegtermékenyítéssel kevesebb utód, és 0,1-0,2 % hím is, nondiszjunkció miatt. Genetikai keresztezés, térképezés: XX és XO keresztezésben, fele hím A hermafroditáknál a recesszív mutációkat hordozó vonalakat önmegtermékenyítéssel egyszerű fenntartani (1/4, 2/4, 1/4 ) 8-1
Felül a hermafrodita, alul a hím állat rajza. Gonádok ősivarsejtek, szincícium, mitózis majd meiózis Spermatociták (amöboid), tárolás, megtermékenyítés spermatéka Hermafroditában a sperma produkció limitált (150 db) Oociták, uterusz 1000 db spicula vulva megtermékenyítés hím spermatociták előnye! 8-2
vulva peték posterior spermatheca oociták anterior spermatheca A megtermékenyített pete 2 órán át az uteruszban fejlődik. Kutikula, a korai embrionális osztódás blasztomer sejteket eredményez, sok egyenetlen osztódás, 28 sejtes formáig minden sejt érintkezik a felszínnel. Ekkor két prekurzor sejt bevándorol (gasztruláció) kialakul a három réteg endo-, mezo-, ektodermisz szövetek differenciálódása és kontraktilis fibrillák kialakulása formálja az embriót féreg formájúvá. 14. órában kikelés L1 lárva (558 sejt) A következő 50 órában három vedlés az új kutikula a régi alatt fejlődik ki, mindegyik kutikula más, az élősködőknél a gazda élőlényhez való alkalmazkodást segíti. A lárva állapotban a legtöbb sejt már nem osztódik tovább, csak méretbeli növekedés történik. Néhány blast sejt differenciálódik neuronná, izomsejtté és szaporítószervekké. A sperma produkció az L4 lárva fázisban kezdődik. A hermafroditákban a fiatal felnőtt állatban váltás oocita termelésére. Az amöboid spermiumok a spermatékában tárolódnak. A petesejt áthaladva az uterus felé megtermékenyül. Párzás során a hím spermatocitái a vulván keresztül szintén a spermatékába kerülnek. Idegen megtermékenyítés előnyben! 8-3
Az embrió fejlődése: a) sejtmagok fúziója b) megtermékenyített P0 petesejt c) az első osztódáskor nagy AB és kisebb P1 utódsejt keletkezik d,e,f) további osztódások ABp P1 P2, EMS MS, E P2 C, P3 P3 D, P4 /AB ABa, amöboid spermiumok A hat alapító sejt : AB, MS, E, C, D, P4 g) gasztruláció kezdete: az E jelű két sejt vándorol be a 28 sejtes stádiumban h,i) az L1 lárva kialakulása a kibújás előtt Az embrió fejlődésének első 100 percében végbemenő korai osztódások lineárisan ábrázolva. Látható, hogy 3 alapító sejtből (E, D, P4) csak egyféle sejttípus/szerv alakul ki, míg az AB, MS és C sejtekből többféle sejttípus is keletkezik. Minden vonalban ábrázolták a programmozott sejthalállal elpusztult sejtek számát is (L1 állapotig). az L1 lárva 558 sejtje 8-4
Az L1 lárva fejlődése Az L1 lárva 558 sejtből áll. A teljes fejlődés alatt összesen 1090 testi sejt keletkezik, de ezek közül 131 genetikailag meghatározott módon elpusztul (apoptózis, programozott sejthalál), így marad a hermafroditában 959 testi sejt. Az ivarsejtek száma némileg változó. Minden sejtosztódás ideje és az egyes sejtek leszármazása (sejtsors térkép) ismert. (Nomarski interferencia mikrosztkópia.) Nem szelvényezett, de az L1 lárvában 12 prekurzor sejtből, nagyjából azonos módon alakulnak ki a felnőtt állatra jellemző sejtek. A ventrális P sejtekből egy hipodermális sejt és öt motoros neuron alakul ki. A 12 sejt nem pontosan ugyanolyan osztódási sort hoz létre. Néhány vonalban egy vagy több neuron programozottan elpusztul, másoknál a hipodermális sejt osztódik tovább. Nematoda kísérleti rendszeren kapott eredményekért eddig kétszer adtak Nobel-díjat: programmozott sejthalál (2002) és RNS silencing (2007). 8-5
A komplett sejtsors térkép. A fejlődési stádiumok szerint, időben ábrázolja az egyes sejtek leszármazását és kialakulását. A korai embriófejlődés minden sejtje nélkülözhetetlen, a fejlődés determinált, már meghatározott az identitásuk, sorsuk (egérnél a 4-8 sejtes embrió sejtjei totipotensek!). Az egyes osztódási vonalak meghatározásához nagy segítséget jelentett a lézeres sejtkiütés. Irányítottan lehet egy adott sejtet megsemmisíteni, ami lehetővé teszi az egyedfejlődés, a fiziológia vagy a viselkedés terén okozott elváltozások tanulmányozását. Nemcsak belső molekuláris programozás van. A környező sejtek is befolyásolhatják a sejtidentitás kialakulását! (lásd később) 8-6
A C. elegans genom 97 Mb. 5 pár autoszóma + XX vagy X0 Méretük kicsi és nagyjából egyformák, ami nehezíti a citogenetikai vizsgálatokat. A kromoszómák holocentrikusak, azaz nincs határozott centromerük. Több pont is szolgálhat centromerként. Ennek előnye a genetikai mozaikok létrehozásakor mutatkozik meg (lásd később), a genetikai térképezést nem befolyásolja. Elkészült a klasszikus genetikai térkép is, amely 1600 lókuszt tartalmaz. A kromoszómák részletes fizikai térképe is elkészült, átfedő kozmid és YAC klónok helyzetének feltüntetésével. Ez nagy segítség a pozícionális klónozásnál, amikor, például pontmutáció esetén, a mutációt tartalmazó gén azonosítása a térképhelyzet meghatározása alapján történik. A kromoszómák középső részén egy térképegység (1 cm) akár 1500 kb is lehet (kevés rekombináció), míg a szélein csak 50 kb. Tehát a rekombináció gyakorisága erősen régió függő. Ennek az anomáliának köszönhetően az autoszómák genetikai térképén a középső régióban csoportosulnak (látszólag!) a gének (sötétkék régiók az ábrán). A genom szekvenciája 1998-ban készült el. 22 ezer fehérjekódoló gén (19 ezer gén 1998-ban) 2575 génnél alternatív splicing (12 %) A C. elegans vázlatos genetikai térképe. A számozás az egyes kromoszómák hosszát mutatja centimorganban (cm). nagy géndenzitás, kis gének - 3 kb/gén részben a rövid intronoknak köszönhetően A gének mérete 48 bázistól a 81 kb hosszig (titin) terjed. 6 exon/gén, az exonok a genom 26%-át teszik ki (a humán genomban ez 1%!). Átlagosan 123 bp egy exon és 47 bp egy intron (kicsik). 8-7
TRANS-SPLICING A C. elegans genom különlegessége, hogy egy promóterről több gén is átíródhat (25% policisztronos pre-mrns, 2-6 kódoló szekvencia) és a transzkript különleges érésen megy keresztül. Az érett mrns-ek már monocisztonosak. 70 %-ukon található egy ún. trans-leader szekvencia, amely az érés során, utólag kerül az RNS elejére. A genomikus szekvenciákban ez a rész nincs benne, külön gének kódolják, ezért hívják a betoldását trans-splicing-nak. A kétféle 22 bázis hosszú leader szekvencia teljesen konzeválódott. Az SL1 (splice leader 1) az 5 végi első kódoló szekvencia elé épül be, míg az SL2 a köztes kódoló szekvenciák elé. Funkciójuk nem teljesen világos. Talán a transzláció hatékonyságát növelik. A trans-splicing nagyon hasonlóan megy végbe, mint a cisz-splicing, de az U1 snrns nélkül. Az outron, az intronnal ellentétben, csak 3 végén határolt exon szekvenciával, ezért nincs 5 -végén hasítási szekvencia (splice site). A donor helyet az SL-snRNP biztosítja. Trans-splicing a Nematoda törzsben és néhány protisztánál létezik. Egy 1 kb hosszú tandem repeat régióban 110 SL1 RNA gén található, ami az 5S rrns géneket is tartalmazza. Az SL2 gének szétszórtan helyezkednek el, és csak 18 példány van belőlük. 8-8
Transzpozonok A genom 12%-a transzpozon eredetű. A legtöbb ilyen szekvencia azonban fosszilis, nem mozgásképes. Hétféle transzpozon példányai találhatók a genomban (Tc1 Tc7, Tc1/mariner superfamily). Jellemző rájuk a terminális inverted repeat és egy belső transzpozáz gén. (DNS transzpozonok, nem retrotranszpozonok!) Számuk, elhelyezkedésük jellemző a nematoda törzsekre, de törzsön belül is változhatnak a jellemzők, mivel vannak köztük ugrásra kész, mobilis elemek. A segítségükkel történhetett meg több gén izolálása is, miután rájöttek, hogy a spontán mutánsok egy részében valamelyik transzpozon okozta a mutációt. A mutánsokban a transzpozonok helyzetének megváltozását lehet vizsgálni, és az új helyre beépült transzpozon szekvencia segítségével izolálható az eltalált gén (hibridizáció, PCR technikák). A C. elegans Bristol N2 törzs kromoszómáin elhelyezkedő transzpozonokat mutatja a jobb oldali ábra. 8-9
GENETIKAI ESZKÖZÖK mutagenezis pete A kémiai mutagenezis etil-metil-szulfonát (EMS) segítségével jó hatásfokkal eredményez mutánsokat. A hermafrodita mutánsok nagy előnye, hogy recesszív mutáció esetében, önmegtermékenyítéssel, az utódok ¼ része homozigóta mutáns lesz. P spermium F1 A súlyos rendellenességeket mutató homozigóta mutáns vonalak fenntartása is egyszerű, további keresztezések nélkül, ha az állat képes táplálkozni, és az önmegtermékenyítés folyamata nem zavart. Így például a teljes izomzat paralízise esetében sem gátolt az utódok létrehozása (pl. Unc mutánsok). unc/+ F2 +/+ 25% unc/+ 50% A mutagenezis után az F1 nemzedék minden tagját egyenkét teszteljük, hogy milyen mutánsokat szegregál. Az ábrán lévő F1 utód az unc génben szenvedett mutációt. A mutánsok elemzése révén 1600 marker került fel a genetikai térképre. A térképezésben jellegzetes, jól felismerhető fenotípussal rendelkező markereket alkalmaztak. Így a rendellenes testformát okozó Dumpy (Dpy) vagy Long (Lon), valamint a kordinálatlan mozgást eredményező Uncoordinated (Unc) mutációkat. +/+ unc/unc 25% a mutáns új lemezre F3 unc/unc 100% Egyezményesen a fenotípust nagy kezdőbetűvel jelzik, míg a gének, allélek dőlt kisbetűs elnevezést kapnak. Például a dpy-10(e128) a dpy-10 génnek az e128-as mutáns allélja, ami Dpy fentípust okoz homozigóta recesszív formában. A fehérje géntermékek nevét csupa nagybetüvel jelölik: DPY-10. 8-10
TRANSZFORMÁCIÓ Komplementációs, génexpressziót vizsgáló vagy géncsendesítéses kísérletekhez fontos hogy tudjunk transzgenikus élőlényt létrehozni. Ez C. elegans esetében könnyű. A kísérletekben a klónozott DNS-t mikroinjektálással juttatják be a kutikula alá, a gonádba. Az oocita fejlődés elején sok sejtmagos szincícium! A oocita sejtmagok felveszik a DNS-t, ami a legtöbb sejtben megmarad az egyedfejlődés alatt. Önálló kromoszómaként funkcionál! Nem kell centromeron! A holocentrikus kromoszómáknak sincs határozott centromeronja. Az utódok között sok transzformáns, viszonylag stabilan öröklődik a bevitt DNS. 8-11
TRANSZFORMÁCIÓ 1) Mutánsok menekítése a vad típusú transzgén bejuttatásával (komplementáció, egy adott gén azonosítása több ORF közül) C. elgans transformáció 2) Riporter génkonstrukciók alkalmazása génexpresszió vizsgálatára A transzgén a kromoszómákba való beépülés nélkül is fent marad és öröklődik, de kis gyakorisággal el is veszhet. Ha az egyedfejlődés közben, egy mitózis alatt vész el, akkor olyan genetikai mozaikok jönnek létre, amelyekben egy leszármazási sejtvonal transzgén mentes. Az adott gén hatókörének tanulmányozásához ezek az egyedi mozaikok sok segítséget jelentenek (lásd a következő oldalt). lacz riporter génfúzió: β-galaktozidáz aktivitás kimutatás X-gal segítségével specifikus sejtekben 3) Stabil transzgenikus vonalak A transzgének kromoszómákba történő beépülését röntgen vagy gamma sugárzással érhetjük el. Ekkor valóban stabil transzgenikus vonalakat kapunk, ahol a transzgén hasonlóan öröklődik, mint bármelyik kromoszómális marker. A beépülés random. A homológ rekombinánsok (knock out állat) létrehozásának nagyon kicsi az esélye, de van rá példa. A GFP riporter génfúzió alkalmazása a leggyakoribb. 8-12
Géncsendesítés A C. elegans esetében ez a módszer hallatlanul bevált és egyszerű. Elég csak az állatokat a megfelelő antiszensz RNS molekulát termelő E. coli sejteken növeszteni, hogy a célgént elhallgattassuk. Az Arabidopsis genetika eszközei között már volt szó erről a módszerről. Először a cél mrns szekvencia egy részét tartalmazó kettős szálú RNS beinjektálásával értek el sikereket (dsrns). A felnőtt hermafrodita állatba injektált dsrns az utódokban is fennmaradó géncsendesítést idéz elő! Ez az RNS közvetített interferencia (RNAi, RNA-mediated interference). RISC A DICER enzimkomplex a beinjektált dsrns molekulákat kis, 22 bp nagyságú darabokra hasítja. Ezek az small interfering RNS-ek (sirna). Saját szabályozó, egyszálú RNS molekulák is előfordulnak, melyek komplementer részei képeznek kettős szálú részleteket. Ezek a szubsztrátjai a további, hasonló folyamatnak. A genomban kódolt saját szabályozó molekulákat micro RNS (mirna) névvel különböztetjük meg. A kettős szálú részek feldarabolásából származó 22 bp nagyságú molekulák eljutnak minden sejtbe. A RISC komplex (RNAi silencing complex) az sirna molekulákból képződött, egyszálú antiszensz RNS darabokkal ismeri fel a cél mrns-t. A specifikus hasítás olyan hatékony lehet, hogy egyáltalán nem képződik az adott gén által kódolt fehérje. Hiába íródik át megfelelően maga a gén. RNA-mediated interference Az antiszensz sirns molekulák nem csak a cél mrna specifikus felismerését és hasítását (inaktiválását) biztosítják, hanem újabb dsrns képződését is, reverz transzkriptáz közreműködésével. 8-13
Mutánsok és génazonosítás Reverz genetika egy szekvencia elrontásával ismerjük meg a mutáns fenotípust Forward genetika mutáns segítségével gén azonosítás Egy C. elegans pontmutáció helyzete, mint minden más élőlénynél, sok munkával azonosítható. Először a mutáció helyét kell rekombinációs térképezéssel, ismert klasszikus markerek segítségével meghatározni. A térképhelyzet pontosítása DNS-markerek segítségével történik, majd a gént tartalmazó régiót azonosítják a kromoszóma fizikai térképén. Az érintett gén azonosítása klónozás és komplementációs kísérletek (transzformánsok előállítása) segítségével történik, hiszen a behatárolt területen akár több tucat gén is lehet. Ilyenkor azonosítják a komplemetáló kozmid klónokat, majd különböző szubklónok segítségével történik az érintett gén végső azonosítása. Ez a pozícionális klónozás, ami meglehetősen munkaigényes. Ha nem túl nagy a behatárolt szakasz, a mutációt hordozó szekvencia direkt meghatározása is célravezető lehet, hacsak nem találunk egyszerre több génben is eltéréseket a közölt szekvenciától. Másik lehetőség a géncsendesítés, ahol a régióban szereplő minden génre terveznek csendesítő konstrukciót és azt nézik, hogy melyik képes ugyanazt a mutáns fenotípust létrehozni. Az előbbiekkel ellentétben, a mutáció azonnali klónozására van lehetőség, ha transzpozíciós mutagenezist végeztek. A szükséges kontroll kísérleteket (komplementáció, géncsendesítés) persze ekkor is el kell végezni, hogy igazoljuk, valóban az azonosított inszerció okozta az adott fenotípust. A Caenorhabditisban nincs lehetőség a knock out technika alkalmazására. Hasonlóan az Arabidopsis genetikában alkalmazott módszerhez, ezért először nagyon sok random inszerciós mutánst állítanak elő transzpozíciós mutagenezis segítségével. Ezek utódjait lefagyasztják, illetve PCR segítségével meghatározzák az inszerció helyét. A transzpozon lehet például a Tc1 természetes transzpozon is. Egy adott génben inszerciót hordozó mutánsokat a transzpozon végére és a génhez tervezett primerekkel lehet azonosítani. PCR termék csak akkor keletkezik, ha a Tc1 transzpozon az adott génben vagy annak közvetlen közelében található. A PCR termék hossza egyben azt is mutatja, hogy az inszerció milyen messze van a génhez tervezett primertől. Ha megvan a keresett mutáns, a lefagyasztott egyedek felélesztésével megkezdődhet a mutáció hatásának vizsgálata, tehát a fenotípus megállapítása. (Kis kiterjedésű gének, rövid intronok. Ahol hosszú intronok vannak, ott ez nehézkesen használható módszer.) A géncsendesítés alkalmazása a másik, jóval egyszerűbb lehetőség egy gén funkciójának tanulmányozására. 8-14
Genetikai mozaikok elemzése Az előzőekben már volt szó, hogy hogyan képződnek, véletlenszerűen, genetikai mozaikok a transzformált állatok utódjaiban. Ezt a jelenséget kihasználva tanulmányozni lehet egy adott gén hatásának időbeni lefutását, szövetspecifitását. Röntgen vagy gamma sugárzással a kromoszómákat is fel lehet tördelni rövidebb szakaszokra. Mivel holocentrikusak, a létrejött fragmentek viszonylag stabilan fennmaradnak és szegregálnak mitózis és meiózis alatt. A kisebb fragmentek átlag 200 oszódás után, a nagyobbak ritkábban, elveszhetnek. Ezzel bizonyos sejtvonalaknak megváltozik a genotípusa, ha az elveszett darab más alléleket hordoz, mint a kromoszómák. A kísérlethez homozigóta mutáns vonalat hoznak létre és ebbe juttatják be a vad típusú allélt hordozó extra fragmentet. Ez ma már úgy is lehetséges, hogy a klónozott gént hordozó DNS szakaszt transzformálják az állatba. A konstrukció tartalmaz egy marker gént is (Mkr+), amely jelzi, hogy mely sejtek hordozzák a vad típusú gént. Jelölési célra a GFP gén nagyon alkalmas, hiszen alap helyzetben minden sejt fluoreszkál. Tehát a nem világító sejtekből veszett el a komplementáló szakasz. Egy transzformált homozigóta recesszív törzs nagyon sok utódját kell átvizsgálni, hogy megtaláljuk azokat a véletlenszerűen kialakult mozaikokat, amelyek tisztázhatják az adott gén hatókörét. Az Unc fenotípus mögött több gén illetve speciális allél állhat, melyek terméke vagy az idegsejtekben, vagy az izomsejtekben szükséges a normál működéshez. Ha például egy unc gén hatókörét szeretnénk megállapítani, vizsgálhatjuk, hogy mely mozaikok lesznek kordinálatlan mozgásúak. Azok, amelyekben az izomsejtek, vagy azok, amelyekben az idegsejtek nem tartalmazzák a komplementáló szakaszt? Az unc-54 esetében akkor jön létre a mutáns fenotípus, ha az unc-54+ komplementáló szakasz az izomsejtekből vész el, az unc-32 esetében pedig az unc-32+ gén elveszése az idegsejtekből okoz mutáns fenotípust. Az eredményekkel egyezően kiderült, hogy az UNC-54 fehérje egy miozin alegység, az UNC-32 pedig a kolinerg neuronok működéséhez szükséges ATP-áz egyik alegysége. 8-15
Az embriogenezis genetikai felbontása A legtöbb állatban nagy szerepe van a korai embriogenezisben a petesejtben tárolt mrnseknek. Ugyanis, a megtermékenyülés után egy darabig még nem expresszálódnak az embrió saját génjei. A fejlődést az anya által a petesejtbe pakolt üzenetek (mrns-ek, fehérjék) irányítják. Ha az ezeket meghatározó gének sérültek az anyában, akkor az az utódokra lesz drasztikus hatással, az embriogenezis leáll. Az érintett géneket anyaihatású géneknek, a mutációkat anyai hatású mutációknak nevezzük (nem tévesztendő össze az anyai öröklődéssel!) Az anyai hatású mutációk kimutatására egy meglehetősen horrorisztikus, de praktikus módszert alkalmaznak. A vulva fejlődésben gátolt hermafroditákból nem képesek a lárvák kikelni. Ha ilyen egyedben normális az embriogenezis, az utódok kialakulnak és belülről felfalják az anyát, így jutnak a külvilágra. Ha az anya homozigóta mutáns egy anyai hatású génben (a rajzon m/m), akkor megmenekül, mert nem fejlődnek ki benne az utódok. Ebben az állatban viszont tanulmányozni lehet, hogy milyen stádiumban állt le az embriogenezis. mutagnezis +/+ P Anyai hatású letális mutációk azonosítása A mutagenizált hermafrodita által létrehozott utódok többsége nem tartalmaz ilyen mutációt. Kis hányaduk m/+ heterozigóta lesz (F1). Ezek, önmegtermékenyítés révén, ¼ részben olyan utódokat hoznak létre, amelyek m/m genotípussal rendelkeznek. Ezek a homozigóta mutánsok életképesek, de bennük az embriogenezis gátolt. Így ez a genotípus a túlélésüket eredményezi, ha az állatokban a vulvafejlődés is gátolt. Tehát az a mutáns vonal, amelyiknél F2 hermafroditák életben maradnak, anyai hatású mutációt hordoz. A mutáció az m/+ egyedek révén fenntartható. 8-16
A korai sejtosztódásokat anyai hatású gének irányítják A Nematoda petesejtnek nincsen előre meghatározott polaritása. Az lesz a vége (poszterior oldal), ahol a spermium bejut. A spermium átrendeződést vált ki a megtermékenyített petesejtben, bizonyos molekulák asszimetrikus elrendeződését eredményezi. A jobb oldali ábrán azoknak az ún. P-granulumoknak (ribonukleoprotein részecskék) az elrendeződése látható, amelyek a zigótában a csírasejtvonal létrejöttét határozzák meg. Az oocitában a megtermékenyítés előtt illetve közvetlen utána a P-granulumok egyenletes eloszlása figyelhető meg (A ábra). Kis idő után (B) a helyzetük asszimetrikus lesz és a poszterior részen halmozódnak fel. Ezen a részen alakul ki a P1 utódsejt, amiből majd a csírasejtvonal ered (P4). A másik utódsejtben (AB) ezek a részecskék nem kimutathatók. A folyamatban részt vevő gének azonosítására olyan anyai hatású mutációkat kerestek, amelyekben ez a polaritás már nem alakul ki. Hat par (partitioning) lókuszt (gént) azonosítottak. Mindegyik gén mutációja, homozigóta formában a zigóta polaritásának kialakulását gátolta, az utódsejtek (AB, P1) azonos nagyságúak lettek és mindegyikben kimutatható volt P-granulum. A B C Sok PAR fehérje az embrionális kortexben, a sejthártya alatt lokalizálódik, az embrió anterior VAGY poszterior oldalán. Péda erre a PAR-2 és a PAR-3 fehérjék felhalmozódása. A PAR-3 az anterior, a PAR-2 a poszterior oldalon található (C ábra). A PAR fehérjék lokalizálása a megtermékenyítés után, de a P-granulumok vándorlásának megkezdődése előtt kialakul. Ez érthető, ha feltételezzük, hogy ezeknek a fehérjéknek az egyik szerepe pont a P-granulumok vándorlásának irányítása. 8-17
ABa ABp P2 EMS A PAR fehérjék abban a sejtben fejtik ki hatásukat, amiben elhelyezkednek. Léteznek azonban olyan szignálok, amelyek a differenciálódás során más sejtek sorsát határozzák meg. Egy ilyen rendszer működik az AB sejtből kialakuló ABa és ABp (anterior, poszterior) utódsejtek programmozására. A két utódsejt egyforma, sorsuk az ABp és a P2 sejtek érintkezése révén dől el. Normál esetben az ABp érintkezik a P2 sejttel, az ABa nem. Ha a P2 sejtet elpusztítják lézer segítségével, az ABp sejt is az ABa sejtre jellemző programot hajtja végre. Ha az embriót úgy manipulálják, hogy az ABa sejt érintkezhet a P2 sejttel, akkor az az ABp fejlődését produkálja. Az érintett gének azonosítására ismét az anyai hatású mutációkat nézték át. Azokat keresték, amelyekben az ABp sej leszármazási vonala elakad. Kiderült, hogy a folyamatban egy sejtmembrán receptor (GLP-1) és egy membrán kötött ligand (APX-1) játszik szerepet. A Glp-1 mrns mind a négy sejtben jelen van (ABa, ABp, P2, EMS), de transzlációját más faktorok megakadályozzák a P2 és EMS sejtekben receptor csak az ABa, ABp sejtekben. Az APX-1 ligand csak a P2 sejtben termelődik, így a szignáltranszdukciós út csak az ABp (receptor) és P2 (ligand) sejtek érintkezésénél kapcsolódik be. A két fehérje nagyon hasonló a Drosophila Notch és Delta gének által kódolt fehérjékhez. A két élőlényben tehát hasonló alapsémák szerint zajlanak az egyedfejlődés kezdetekor a differenciálódási, sejtidentitást meghatározó folyamatok. 8-18