2013.02.15. Fluorescencia aniotrópia, Luminescencia Fluorescencia Reonancia nergiatransfer A molekuláknak at a fénemissióját, amelet a valamilen módon (például fénnel való besugárással) gerjestett molekula a hőmérsékleti sugáráson kívül kibocsát, gűjtőnéven luminescenciának neveük. és Fluorescencia kioltás Biofiika seminárium Ujfalusi Zoltán 2013. február 12-14. PT ÁOK Biofiikai Intéet Síkban polariált fén Síkban polariált fén Polariáció Fluorescencia polariáció 1. Gerjestés: dipólusvektor jön létre absorpciós momentum θ Fotoselekció: random populációból a elektromos vektorral párhuamos absorpciós vektorú molekulák kiválastása Ima Polariátor I ma cos2 Malus törvén (Étienne-Louis Malus) Párhuamos állás: Θ = 0, I = Ima Merőleges állás Θ = 90, I = 0 Vertikálisan sikpolariált gerjestő fén Csak a megfelelő orientáltságú absorpciós momentummal rendelkeő fluorofórok gerjestődnek a mintában! 1
2013.02.15. Fluorescencia polariáció 2. Fluorescencia emissió: polariált fén emissiós momentum Fluorescencia polariáció horiontális detektor Polariációfok: absorpciós és emissiós momentum különbsége Oka: gerjestés időtartama (τ) alatti elmodulás (ns) I v I vh I vv Polariált fén A τ Résben polariált fén fén polariált fén minta Nicol prima vertikális detektor Absorpciós momentum Rotációs diffúió missiós momentum A emissiós momentum vektor nem esik egbe a a absorpciós momentum vektorral a fluorofórok rotációs diffúiós mogásának követketében! Polariációfok I p I vv vv GI GI vh vh Intenitásvektorok különbsége normálva a eredő intenitás vektorra Példa: ha I vv = I vh p = 0 ha I vh = 0 p = 1 Fluorescencia Aniotrópia Iotróp rendser: Iránultság sempontjából homogén rendser. Aniotróp rendser: olan rendser melben vannak kitüntetett iránok. Fluorescencia Aniotrópia Fluorescencia aniotrópia: Polariált fén segítségével a iotróp fluorofór populációt aniotrópá alakítjuk át. A vertikális és horiontális síkban mért intenitások segítségével lehet meghatároni a aniotrópiát! Ivv GIvh r I 2GI vv vh missiós aniotrópia v Intenitásvektorok különbsége normálva a teljes intenitásra Különböő fluorofórok aniotrópiája össeadható Perrin egenlet Jean Baptiste Perrin, Nobel díj, 192 Alkalmaás Rotációs korrelációs idő a molekulák rotációs diffúiós képességéről ad információt! Határ aniotrópia r 0 : határérték aniotrópia ( modulatlan molekula, ha r = r 0 φ végtelen) τ: fluorescencia élettartam φ: rotációs korrelációs idő ( mogékonság ) Stokes-instein össefüggés Rotációs korrelációs idő V: objektum térfogata η: köeg viskoitása T: absolút hőmérséklet R: egetemes gáállandó Molekulák rotációs diffúiójának meghatároása Molekulák köti interakciók detektálása Konformácós váltoások éslelése Membránok fluiditásának meghatároása lőnök: alacson detektálási küsöb (< nm) real-time mérések koncentráció független 2
2013.02.15. Módserek össehasonlítása Fotonok és molekulák ütköése Fotonok és molekulák ütköése Fénforrás Minta Detektor Fén (foton) ütköése a molekulákkal fénsóródás Polarimetria Absorpciós fotometria Fluorescencia spektroskópia Fluorescencia polariáció Monokromatikus, polariált fén Monokromatikus fén Monokromatikus fén Monokromatikus, polariált fén Optikailag aktiv Gerjestődik, absorbeál Gerjestődik, absorbeál, fént emittál Gerjestődik, absorbeál, fént emittál lforgatás Intenitáscsökkenés mittált fénintenitás Polariáció, Aniotrópia absorpció Fénelnelés: -g foton energiája -> molekula energiája ( = h / ). -A elnelt energia átalakul: - Hő - Fluorescencia - Fosforescencia - Fluorescencia kioltás és fluorescencia reonancia energia transfer Fluorescencia Reonancia nergiatransfer (FRT) - Theodor Förster, 1948 A FRT feltételei A Förster típusú energiatransfer a gerjestett állapotban lévő fluoreskáló molekula (donor), valamint eg megfelelő spektroskópiás követelméneket kielégítő molekula (akceptor) köött dipól-dipól kölcsönhatás révén, sugárás nélküli energiaátadás formájában jön létre. A gerjestett donor relaációja a akceptor molekula emissiója révén valósul meg! Fluorescens donor és akceptor molekula. A donor és akceptor molekula köötti távolság 2-10 nm! Átfedés a donor emissiós spektruma és a akceptor absorpciós spektruma köött. k t~1/r R A FRT molekuláris mechanimusa Spektrális átfedés kt konst. J( )n 4 2 kfr κ Hullámhoss J= átfedési integrál n= köeg törésmutatója R= donor-akceptor távolság κ= orientációs faktor 3
Normált f ' 2013.02.15. Fluorescencia Reonancia nergia Transfer k t = konst. * J(λ) n -4 k f R - κ 2 J(λ): átfedési integrál, n: törésmutató (1.33-1.), k f: a fluorescencia emissiójának sebességi állandója, R: a donor és a akceptor molekula köötti távolság, κ: orientációs faktor (2/3) k t~1/r R Kritikus Förster-távolság A a távolság melen a FRT hatásfok a felére csökken (transferhatásfok 0.5). FRT hatásfok R k t = (1/t D ) * (R 0 /R) k t: a energia transfer sebességi állandója, t D : a donor molekula fluorescencia élettartama a akceptor hiánában, R: a donor és a akceptor molekula köötti távolság, R 0: Förster távolság a donor és a akceptor molekula köött. Kritikus Förster-távolság R 0 = 0.211 [h -4 Q 0 k 2 J( )] 1/ A energia transfer hatásfoka kt kt t D k k k k f ic IC t R k 2 (k-néget) = orientációs faktor, a donor emissiós vektorának és a akceptor absorpciós vektorának relatív orientációjáról tudósít várható érték 0 4 köött általában a k 2 = 2/3 (gors mogások miatti átlagolódás követketében) 1: stead-state mérések = 1 (F DA / F D ) F DA : fluorescens intenitás a akceptor jelenlétében F D : fluorescens intenitás a akceptor hiánában η = a köeg törésmutatója (1.33-1.) Q 0 = a donor kvantumhatásfoka akceptor hiánában J(l) = átfedési integrál 2: időfüggő mérések (fluorescencia élettartam) = 1 (τ DA / τ D ) т DA : élettartam a akceptor jelenlétében τ D : élettartam a akceptor hiánában Távolságmérés FRT segítségével (Molekuláris mérősalag) Hőmérséklet-függő FRT mérések 2.5 FRT hatásfok R 2.0 1.5 1.0 5 10 15 20 25 30 35 [Hőmérséklet] ( C) 4
2013.02.15. Össefoglalás Fluorescencia kioltás FRT távolságok meghatároására alkalmas megfelelő donor akceptor párok esetén. Molekulák köötti kölcsönhatások tanulmánoása. Molekulákon belüli serkeeti váltoások tanulmánoása. A fluorofórok által kibocsátott fén intenitásának csökkenése olan molekulák vag ionok jelenlétében melek elektronserkeete megfelelő ahho, hog a gerjestett állapotban lévő fluorofórral ütköve annak gerjestési energiáját átvegék, majd at valamilen formában dissipálják (például hő). Versengés a fluorescencia kibocsátása és a nem sugárásos átmenet köött csökkent fluorescencia emissió. Kioltás típusai Statikus : A kioltó és a fluorofór még a gerjestés előtt eg kompleet (sötét komple) alkot, mel komple nem képes fént emittálni. A gerjestett állapotban lévő molekulák sáma csökken. - Diffúió által nem befolásolt! - Fluorescencia élettartam nem éréken rá! Kioltás típusai Dinamikus : A kioltó és a fluorofór molekulák diffúiós folamatok révén egmás köelébe kerülnek, eg ütköési kompleet honak létre, majd a gerjestett fluorofór átadja a energiáját a kioltónak. - Diffúió által befolásolt! - Fluorescencia élettartamot csökkenti! Fluorofór + : Nincs emissió Kioltó Sötét komple h*υ (a gerjestés előtt jön létre) Gerjestés Fluorofór + : Kioltó h*υ Gerjestés Ütköési komple (a gerjestés után jön létre) Fluorofór + Kioltó Hogan dönthető el, hog milen típusú kioltásról van só? Kioltók típusai Semleges kioltók: Akrilamid, nitroidok stérikus visonok monitoroása. Dinamikus kioltás Statikus kioltás Töltéssel rendelkeő kioltók: jodid, céium, kobalt elektrostatikus visonok monitoroása [a fehérje töltése fontos (Ls, Arg, His, Asp, Glu)]. 5
Fluorescencia intenitás 2013.02.15. redmének értékelése Stern-Volmer egenlet (a kioltás mértékének kvantifikálása) A fluorofórok hoáférhetőségét tükröi a Stern-Volmer állandó (K SV ). A bimolekuláris sebességi állandó (k q ) sintén a kioltás eredménességét, aa a fluorofórok hoáférhetőségét tükröi. k q = 1 10 10 M -1 s -1 diffúió kontrollált kioltás k q < 1 10 10 M -1 s -1 stérikus elfedettség k q > 1 10 10 M -1 s -1 kötés kialakulása Ma Volmer (1885-195) Otto Stern (1888-199) Fiikai Nobel díj (1943) Stern-Volmer egenlet F 0 1 K [ Q sv ] F F 0 : fluorescencia intenitás a kioltó hiánában F : fluorescencia intenitás a kioltó jelenlétében K sv : Stern-Volmer állandó [Q] : kioltó koncentrációja Módosított Stern-Volmer egenlet (Lehrer-egenlet) A kioltó sámára nem egformán hoáférhető fluorofórok esetén! K SV= 5 M -1 α : a kioltó által hoáférhető fluorofór arána meredekség: 1/(αK SV) metséspont: 1/α Triptofán fluorescenciájának kioltása akrilamiddal 150 100 50 0 350 400 450 500 550 00 50 Hullámhoss (nm)