Debreceni Egyetem Orvos-és Egészségtudományi Centrum, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet A Kv1.3 ioncsatorna szerepe a T sejt aktivációban Hajdu Péter Debrecen, 211. november 14.
Az előadás tematikája: 1. A Kv1.3 csatornák szerepe a T sejtekben 2. A Kv1.3 csatorna: a lipidkörnyezet és az immunológiai szinapszis hatása 3. A Kv1.3 csatornák útja az immunszinapszisba 4. Kv1.3 ioncsatorna jellemzői a Smith-Lemli-Opitz szindrómás betegek T sejtjeiben
Az ioncsatorna egyszerűsített képe: A hidrofil pórus teszi lehetővé az ionok gyors membránon keresztüli áramlását (1 8 ion/s)
immunitás mozgás szívműködés ioncsatornák szekréció memória kontrakció gondolkodás érzékelés
Hogyan szabályozzák az ioncsatornák a T sejtes immunválaszt? K + K + TCR/ CD3 Kv1.3 ER IP 3 PLC E m ~-5 mv CaM Ca 2+ proliferáció CRAC [Ca 2+ ] idő T sejt CRAC:calcium release activated calcium channel (kalcium felszabadulás aktivált kalcium csatorna)
Miképpen tanulmányozhatók az ioncsatornák? Az ionáramok mérése a patch-clamp technikával R f E m I m I p - + V tartási V ki műv. erősítő áram (pa) 6 4 2 +3 mv -4 mv +3 mv -1 mv -5 mv -8 mv 2 4 6 8 1 idő (ms)
Az előadás tematikája: 1. A Kv1.3 csatornák szerepe a T sejtekben 2. A Kv1.3 csatorna: a lipidkörnyezet és az immunológiai szinapszis hatása 3. A Kv1.3 csatornák útja az immunszinapszisba 4. Kv1.3 ioncsatorna jellemzői a Smith-Lemli-Opitz szindrómás betegek T sejtjeiben
A koleszterin hatása a Kv1.3 kapuzására Hogyan befolyásolja a Kv1.3 csatorna funkcióját a humán T sejtmembrán koleszterintartalmának változása? az aktiváció és inaktiváció kinetikai paraméterei az egyensúlyi aktiváció és inaktiváció feszültségfüggése
A membrán koleszterin tartalom növelése lassítja a Kv1.3 (in)aktivációs kinetikát normált K + áram 1 3 Inaktivációs kinetika t τ = i I(t) I e + C max 1.5 mg/ml MβCD/C Kontroll 1.425 mg/ml MβCD 1 2 Idő idő (s) normált K + áram 2 Aktivációs kinetika 1 t τ = m ax + a I(t) I 1 e C 1.425 mg/ml MβCD Kontroll 1.5 mg/ml MβCD/C 1 2 idő (ms) 4 τ i (ms) 2 1 τ a (ms) 1 kontroll.5 1. 1.5 MβCD/C koncentráció (mg/ml) kontroll 1 1.5 MβCD/C koncentráció (mg/ml)
Az aktiváció kétfázisúvá válik a koleszterin bevitel hatására normált K + áram 1 Kontroll 1.5 mg/ml MβCD/C 25 5 idő (ms) τ a (ms) 5 τ a,f τ a,s 1 1.5 MβCD/C koncentráció (mg/ml) Módosított Hodgkin-Huxley modell: 1 mv 5 mv I t = I 1 exp t/ τ + ( ) a,f ( a,f ) ( a,s ) I a,s 1 exp t/ τ + C 4 4 R Ia,f R = I + I a,f a,s 1 1.5 MβCD/C koncentráció (mg/ml)
Összefoglalás I. A T sejt membrán koleszterintartalmának növelése lassítja a Kv1.3 inaktivációt és aktivációt, megváltoztatja az aktiváció feszültség függését. A membrán koleszterintartalmának csökkentése nincs biológiailag releváns hatással a Kv1.3 csatornák egyensúlyi és kinetikai paramétereire. A koleszterinszint emelése az aktiváció kétfázisú viselkedését eredményezte. Modell Z Z 1 Z 2 Z 3 Z 4 NY I K + AZ
Immunológiai szinapszis T sejtek aktivációja az immunszinapszisban (IS) zajlik le, ahová számos intracelluláris és sejtmembrán fehérje szegregálódik APC T sejt TCR/CD3 LFA-1 Kv1.3 TCR/ CD3 CD4/CD8 p56 lck elkülönülő piros és zöld jel a két molekula eltérő régióban lokalizálódik (c-smac és p-smac) hdlg K v β 2 ZIP-1/2 PKC Monks et al., Nature, 1998, 395:82-86
Az endogén Kv1.3 csatornák az IS-ba szegregálódnak PKC-θ-GFP ext. anti-kv1.3+ IgG-Cy3 tramszmissziós T sejt APC
A Kv1.3 csatornák áramának kinetikája megváltozik az IS-ban Aktivációs kinetika Inaktivációs kinetika Egyensúlyi aktiváció normált áram 1..5. -.5-1. 2 4 6 8 1 12 14 16 18 idő idő (ms) (ms) normált áram 1..8.6.4.2...2.4.6.8 1. 1.2 1.4 idő idő (s) (s) norm. konduktancia 1..8.6.4.2. -6-4 -2 2 4 6 tesztfeszültség (mv) :T-sejt IS-ben :egyedülálló T-sejt τ a (ms) 2.5 * 2. 1.5 1..5. D1 D1 IS-ban τ i (ms) 4 3 2 1 D1 * D1 IS-ban V 1/2 (mv) 2 1-1 -2-3 2 1-1 -2-3 k(mv)
A PK antagonisták gyorsítják a Kv1.3 csatornák inaktivációját Aktivációs kinetika Inaktivációs kinetika Egyensúlyi aktiváció normált áram 1..5. -.5 1 2 3 idő idő (ms) (ms) normált áram 1..8.6.4.2...5 1. 1.5 idő (s) norm. konduktancia 1..8.6.4.2. :,1 µm H89 (PKA) :,5 µm GF1923X (PKC) : kontroll -6-4 -2 2 4 6 tesztfeszültség (mv) τ a (ms) 2.5 2. 1.5 1..5 τ i (ms) 4 3 2 1 * * V 1/2 (mv) 1-1 -2-3 1-1 -2-3 k(mv). kontroll GF H89 kontroll GF H89-4 -4
Összefoglalás II a T-sejt és az APC közötti IS-ban feldúsulnak az endogén Kv1.3 csatornák az IS-ba rendeződés módosítja a Kv1.3 funkcióját a PK antagonisták egyértelműen nem bizonyítják a Kv1.3 működés foszforiláció indukálta megváltozását (a Kv1.3 átrendeződik más membrándoménekbe??)
Az előadás tematikája: 1. A Kv1.3 csatornák szerepe a T sejtekben 2. A Kv1.3 csatorna: a lipidkörnyezet és az immunológiai szinapszis hatása 3. A Kv1.3 csatornák útja az immunszinapszisba 4. Kv1.3 ioncsatorna jellemzői a Smith-Lemli-Opitz szindrómás betegek T sejtjeiben
A Kv1.3 ioncsatorna interakciós partnereinek keresése Potenciális interakciós partnerek: MAGUK (membrane-associated guanylate kinases): PSD-95 (SAP-9) SAP97 (hdlg) PCR totál Jurkat cdns-ből Western blot PSD-95 SAP97 1. 2. 3. 7 bp 95 kda WB: PSD-95 1. Jurkat 13 kda 1. 2. 3. WB: SAP97
A T sejtvonalak és Kv1.3 csatornák mgfp-vel jelölt vad típusú és C mutáns Kv1.3 csatornát kifejező T sejtvonalak PSD-95 és SAP97gén lecsendesítése shrns-sel
A Kv1.3-feldúsulás mérése és kvantitatív jellemzése Jurkat-mGFP-Kv1.3-WT-B-sejt párok APC mgfp-kv1.3 CD3 merge T sejt APC mgfp-kv1.3 CD3 merge I IS, AREA IS : átlagos intenzitás az IS-ben illetve az IS területe I outside : átlagos intenzitás a sejten belül I inside : átlagos intenzitás a citoszólban AREA membrane = AREA outside AREA inside I BG : átlagos háttér intenzitás AR = ( ) I I AREA IS BG IS ( I I ) AREA ( I I ) AREA AREAIS AREA outside BG outside inside BG inside membrane
Az előadás tematikája: 1. A Kv1.3 csatornák szerepe a T sejtekben 2. A Kv1.3 csatorna: a lipidkörnyezet és az immunológiai szinapszis hatása 3. A Kv1.3 csatornák útja az immunszinapszisba 4. Kv1.3 ioncsatorna jellemzői a Smith-Lemli-Opitz szindrómás betegek T sejtjeiben
Az SLO klinikai tünetei Rendkívül változatos tünetek: - súlyos és középsúlyos esetek: súlyos veleszületett rendellenességek (gyakran nem élik túl a perinatális periódust). - enyhébb esetek: különböző fizikális eltérések, viselkedészavarok, tanulási problémák. Kicsi, előrenéző orrlyukak, csüngő szemhéj, fejletlen állcsont. Abnormális genitáliák, pseudohermaphroditismus. A 2. és 3. lábujj összenövése (95%!). Hiperaktivitás, autoagresszivitás. Autista vonások. Alvási problémák. Visszamaradt növekedés. Késleltetett fejlődés. Porter 26, 28
Az SLO kialakulásáért felelős enzim: 7-dehidrokoleszterin reduktáz (DHCR7) 7-dehidrokoleszterin (7-DHC) NADPH NADP + koleszterin DHCR7 szteroid hormonok neuroszteroidok oxiszterolok epesavak magzati fejlődés, embrionális sejtdifferenciáció membránok
Kv1.3 csatornák biofizikai karakterizálása CD 4+ T sejt populáció szelekciója (panning) Elektrofiziológia (patch-clamp, teljes sejt konfiguráció) R f Kv1.3 I p - + V ki CD4 T helper E m I K+ V tartási teljes sejt áram (na) 1.5 1..5. -.5 Aktivációs kinetika t τ = m ax + a I(t) I 1 e C 4 8 12 16 idő idõ (ms) 4 teljes sejt áram (na) 1.2.8.4. Inaktivációs kinetika t τ = i I(t) I e + C max..5 1. 1.5 idő idő (s) (s) norm. konduktancia 1.2 1..8.6.4.2 G Egyensúlyi aktiváció = n V V 1/2 k 1+ e 1 V 1/2 =-2.8 mv k=-1.7 mv. -8-6 -4-2 2 4 6 tesztfeszültség (mv)
Membránösszetétel és aktivációs útvonalak monitorozása Gáz kromatográfia (7DHC és koleszterin) CFSE (karboxifluoreszcein- szukcinimidilészter) hígítási esszé sejtszám CFSE intenzitás
Köszönöm a figyelmet!