Áramlási citométerek klinikai alkalmazása

Áramlási citométerek klinikai alkalmazása

MIRE JÓ? - Mit lehet mérni vele? Intracelluláris analitok DNS citokinek Struktúrfehérjék enzimek Adhéziós fehérjék receptorok Solubilis faktorok

Immunfenotipizálás COMBINATION POPULATION IDENTIFIED CD4+/CDw29+ Helper/effector, more mature memory cells CD4+/CD45R+ Suppressor inducer, less mature non-memory cells CD4+/Leu8+ Suppressor inducer, some helper function CD4+/Class II MHC Activated cells, immature cells CD4+/CD25+ Activated cells (IL2 receptor) CD4+CD38+ Immature cells, activated cells CD8+/CD11b+ Of the CD11b+ cells the suppressors are bright CD8+ and NK are dim CD8+ CD8+/CD28+ Cytotoxic precursor/effector cells CD8+/CD57+ Cytotoxic function CD8+/Class II MHC+ Activated cells, immature cells CD8+/CD25+ Activated cells (IL2 receptor) CD8+/CD38+ Immature cells, activated cells CD16+/CD57+ Low NK activity CD16+/CD56+ Most potent NK activity

Leukémia-diagnosztika

Intracelluláris festés sejtfelszíni marker kombinálása

Őssejtek kimutatása CD34+ őssejtek Irradiációs kezelést követően az őssejtszám normalizálódásának a monitorozása Őssejtmobilizálás sikere

Sejtciklus elemzése DNS próbák DAPI } Hoechst } UV Sejtciklus Propidium iodide (PI) } 7-AAD } 488 TOPRO-3 } DRAQ5 } 633 Kötött molekulák száma megfelel a sejtben lévő DNS-molekulák számának Sejtciklus során a sejt mérete és DNS-tartalma változik

Apoptózis FACS-szal mérhető: DNS-fragmentek Membránstruktúra és integritás (Annexin-V, PI) Mitokondrium-funkció (Mitotracker Red) Kaszpáz aktivitás (ellenanyagokkal)

Sejtproliferáció vizsgálata CFSE-festés

Solubilis paraméterek (citokinszintek) mérése

ELISA vs. FACS citokinszint mérése http://cvi.asm.org/cgi/content/full/8/4/776/f4

Intracelluláris paraméterek sejtaktiváció alatt

Sejtizolálás - sorting

Minta Csontvelő: legalább 3 ml javasolt. Heparinos fecskendőbe való vétel esetén: azonnal a laborba küldeni (20-25 C), Éjszakára: RPMI oldatba kell tenni és hűteni Perifériás vérminta (20-25 C) ACD (72 óra) Na Heparin (48 óra) K2-K3EDTA (30 óra) Szövet (2 8 C) apró darabokra vágva 20%-os RPMI oldatba (24 óra), Fiz.sót kerülni kell (kivéve, ha azonnal feldolgozzák). Fixálni tilos Testfolyadék (RPMI oldatba kell tenni és hűteni) 24 óra Liquor (CSF): sterilen kell venni; (2-8 C) azonnal a laborba kell vinni

HEMATOLÓGIAI ANALIZÁTOROK

Mikor, miért mérünk? Teljes vérkép indikációi: Általános szűrővizsgálatok Gyulladásos, fertőzéses betegségek Endokrin és tumoros betegségek Vérvesztés (akut és krónikus) Hematológiai betegségek Vérzékenység Autoimmun betegségek, allergiás betegségek Só- vízháztartás változásainak követése

Egyéb vizsgálatok, melyek egyes hematológiai kórképek diagnosztikájában nélkülözhetetlenek: We CRP PCT LDH Haptoglobin Folsav, B12 Ca, P, ALP Fe, TVK, stfr transzferrin,ferritin Elektroforézis Immunfixáció Immunglobulinok

Mit látunk a leleten?

Kvantitatív vérkép WBC 4-10 G/l RBC 4-5,5 T/l HGB 130-160 g/l HCT 0,4-0,52 l/l MCV 80-95 fl MCH 28-32 pg MCHC 330-370 g/l (CHCM) 330-370 g/l RDW 11,5-14,5% HDW 2,2-3,2 g/dl PLT 130-400 G/l MPV 7-11 fl PDW 25-65% PCT 0,12-0,36% FRAGM %MICRO %MACRO %HYPO %HYPER

Származtatott paraméterek MCV (mean corpuscular volume) = Htc/RBC Ref: 80-95 fl MCH (mean corpuscular hemoglobin) = Hb/RBC Ref: 28-32 pg MCHC (mean corp. hemoglobin contrentation) = Hb/Htc Ref: 330-370 g/l

Lehetőségek és korlátok A hematológiai automatákból teljesen megbízható értékeket kapunk: - fehérvérsejtszám, vörösvérsejtszám, hemoglobin koncentráció, MCV Nagyobb odafigyelést kíván: - a qualitatív eloszlás, a reticulocyta és a thrombocyta szám (főként alacsony tartományban) Standardizáció hiánya miatt készülékfüggő: - RDW (RBC distribution width) - MPV ( mean platetet volume) - PDW (platelet distribution width)

Kvalitatív vérkép Újszülött Gyermek Felnőtt Limfocita 20-70% 25-50% 20-40% Monocita 1-10% 1-6% 3-8% Neutrofil granulocita 15-60% 25-60% 40-70% Pálcikamagvú 1-8% 3-6% 1-2% Eozinofil granulocita 1-5% 1-5% 1-5% Bazofil granulocita 0-1% 0-1% 0,5-1%

Mérési elvek

Hematológiai analizátorok Advia 2120 Siemens Sysmex XE

Elektromos impedancia (DC) elvű mérés: Disrupts electrical current proportional to the size of the cell Hydrodynamic focusing Laminar flow Three-part WBC differential Issues: Aperture size Coincidence passage loss (coincidence correction) Orientation of cell in aperture Low hemoglobin (RBC parameter)

Radiofrekvenciás ellenállás (RF) elve: Impedance - size cells Conductivity (RF) proportional to cell interior density (granules and nucleus) Five-part WBC differential Scatterplot (RF X DC) Computer cluster analysis provides absolute counts ( impedance)

Optikai elvű mérés: Flow cytometry (measurement in a flow ) Deflects light beam ( mirrors bouncing light) Cells in solution run through quartz flow cell Hydrodynamic focusing (uses sheath fluid) using principle of laminar flow Focused laser beam (coherent, monochromatic) Computer cluster analysis of cytograms provide quantitative and qualitative information Forward angle light scatter correlates to cell volume/size Side angle (orthogonal) light scatter correlates to degree of internal complexity (granules and nucleus)

Fehérvérsejt diferenciálás festés nélkül

Peroxidáz pozitív sejtek L N N L E M L N N M B N M = Monocyta N = Neutrophil E = Eosinophil L = Lymphocyta B = Basophil Wright festés Peroxidáz festés

Felhődiagram peroxidáz festéssel 1 Zaj 2 Magvas vörösvérsejt 3 Összetapadt thrombocyták 4 Lymfocyták és basophylek 5 Large Unstained Cells (LUC) 6 Monocyták 7 Neutropylek 8 Eosinophylek Morfológiai flag-ek: ATYP (Atípusos lymphocyták) IG (Éretlen granulocyták) MPO (Myeloperoxidase hiány) NRBC (Magvas vörösvérsejtek) PLT-CLM (Összetapadt thrombocyták)

A vörösvérsejt mérés No matter what your shape or size... We can make you a SPHERE Izovolumetriás gömbbé alakítás

A vörösvérsejtek optikai detektálása Alacsony szögű fényszórás 2 o - 3 o (Térfogat) Nagy szögű fényszórás 5 o - 15 o (HGB koncentráció)

A vörösvérsejtek optikai detektálása Laserdiode Sample stream Beamsplitter Dark stop Mirror Referentie signaal Absorption Low-angle High-angle scatter detector scatter detector

A térfogat / hemoglobin eloszlás 28 41

A térfogat / hemoglobin eloszlás RBC citogram: hemoglobin koncentráció az x tengelyen, vvt térfogat az y tengelyen ábrázolva 1. 60 fl térfogat 2. 120 fl térfogat 3. 28 g/dl Hemoglobin koncentráció 4. 41 g/dl Hemoglobin koncentráció

Térfogat- MCV A térfogat / hemoglobin eloszlás HGB koncentráció - CHCM

Trombocita meghatározás A meghatározás elve azonos a vörösvérsejt méréssel. Trombocita citogram 5 2 3 1 Trombociták 2 Nagy trombociták 3 Vvt-k 4 Vvt fragmentumok 5 Vvt árnyékok 1 Paraméterek: PLT, MPV, L-PLT 4 Plt térfogat: 0-60 fl

Retikulocita mérés A mérés elve: izovolumetriás gömbbé alakítás után a retikulocita RNS tartalom festése fluoreszcens festékkel (Oxazine).

Retikulocita mérés Retikulocita citogram: -abszorpció (sejt érettség) az x tengelyen -fényszórás (sejt nagyság) az y tengelyen. 1 RTC trombocita küszöb 2 RTC Coincidencia küszöb 3 RTC küszöb 4 Alacsony/közepes RTC küszöb 5 Közepes/Magas RTC küszöb A Érett RBC B Alacsony abszorpciójú retikulociták C Közepes abszorpciójú retikulociták D Magas abszorpciójú retikulociták E Trombociták F Coincidencia

Retikulocita mérés Retikulocita térfogat eloszlási hisztogram (0-200 fl) Retikulocita hemoglobin koncentráció (RETIC HC) eloszlási hisztogram a celluláris hemoglobin koncentráció alapján. (0-50 g/dl) Retikulocita celluláris hemoglobin (RETIC CH) hisztogram a sejtek hemoglobin tartalma alapján Érett RBC populáció (piros) Retikulocita populáció (kék)

Újabb retikulocita paraméterek Éretlen retikulocita frakció (IRF): a fluoreszcenciaintenzitás alapján elkülönített érési csoportok között a közepesen és erősen éretlen (H + M) csoport összege. Az IRF az eritropoetikus aktivitás változásának indikátora (krónikus vesebetegek, csontvelő,- őssejt- és vesetranszplantáltak terápia monitorozása, anémiák differenciálása). Átlagos retikulocita hemoglobin tartalom (CHr vagy RetHe): a felhasználható vas mennyiségének érzékeny indikátora. Jelzi a megelőző 3-4 nap funkcionális vasszintjét. (Vashiány: CHr < 28 pg) Diagnosztikus érték: vashiányos anémia, vasterápiára adott válasz megítélése, eritropoetin kezelés monitorozása

Eritropoetin kezelés Kezdeti állapot 4 nap múlva 2 hét múlva 1 hónap múlva

Hemolízis: RBC, Hct Interferáló tényezők új mintából ismétlés Transzfúzió, vas és B12 terápia: RDW, bimodális RBC hisztogram Lízisrezisztens vvt-k: WBC, lymphocyta Higítás, megnövelt lízisidő Fragmentocyták: RBC PLT Kenetvizsgálat, fragmentocyta program Magvas vörösvérsejt NRBC :WBC,lymphocyta NRBC program, kenetkészítés

Interferáló tényezők Magas WBC : RBC, inkorrekt Hgb és származtatott értékek - mintahígítás Krioglobulinok: WBC - 37⁰-os inkubáció, ismételt mérés Hidegagglutininek: RBC,MCV,MCHC 37⁰-os inkubáció, ismételt mérés Lipémia: Hgb, MCHC, MCH Ismétlés új mintából PLT aggregátumok: WBC, PLT Kenetvizsgálat, ismétlés citrátos vérből Óriás trombociták: WBC, MCV, PLT kenetvizsgálat

Ha már preanalitika K2-EDTA-s csövekbe MEGFELELŐ TÉRFOGATÚ minta Általában min. 0,5 ml manuális mérések esetén 8 órán belül lemérendő 24 órán belül mérni kell, ha +4 C-on tároljuk Kenet készítés 4 órán belül! HEPARIN: nem jó (háttér-szín) Citrát: nem jó (hígítás) Nem alvadásgátolt (brrrrr)

Szobahőmérsékleten való tároláskor 8 óra után bekövetkező változások: vörösvérsejtek elvesztik bikonkáv alakjukat MCV, Ht fehérvérsejt szám abszolút lymphocyta szám retikulocita szám már 6 óra után magvas vörösvérsejtek 24-36 óra után eltűnnek MPV, IRF

Hibás eredményekhez vezet FVS 1. Nem lizáló VVT 2. Magvas VVT 3. Fragmentált FVS 4. Nem lizált >35 fl partikulák 5. Nagy / aggregált PLT 6. Fibrines, alvadékos, törmelékes minták (gyermekgyógyászati, onkológiai betegek) RBC 1. >100 G/l FVS 2. Nagy mennyiségű óriás PLT 3. Agglutinált VVT-k 4. <36 fl VVT-k 5. Fibrines, alvadékos, törmelékes minták (gyermekgyógyászati, onkológiai betegek)

Analitikai hibák néhány lehetőség Hideg agglutininek alacsony vvt-szám, nagy MCV arteficiális oka az agglutinált vvt Agglutinált vvt esetén a hematokrit és az MCHC is pontatlan Hideg agglutinin: hideg vérben okoz eltérést Hideg agglutinin számos betegségben, így autoimmun kórképekben, mononucleosis infectiosaban és mycoplasma pneumonia fertőzésekben jelen lehet MEGOLDÁS: melegíteni kell a mintát (ill. ismerten fennálló probléma esetén melegített csőbe kell venni a vért)

Magvas VVT-k: Méretük megegyezik a limfocitákéval, tévesen FVS-nek számolhatja a készülék

Fragmentált vagy igen mikrociter VVT-k Előfordulhat, hogy ezeket a készülék nem tudja elkülöníteni a PLT-től Hisztogrammot meg kell nézni

Hematocrit: téves mérések Feltétel: a vvt szám és térfogat mérése jó legyen Ha ezek bármelyike hibás, a hematokrit mérés eredménye is hibás A vér/edta arány kevésbé befolyásolja az automata által kiadott htc értéket, mint a centrifugával mért htc-értéket

Hibás eredményekhez vezethet Hgb 1. Nagyon magas FVS 2. Súlyos lipémia 3. Heparinos vér 4. Lízisnek ellenálló VVT 5. Lipémia 6. Hiperbilirubinémia MCV 1. Nagyon magas FVS-szám 2. Óriás PLT-k nagy száma 3. Agglutinált VVT-k 4. Kis (<36 fl) VVT fragmentek 5. Rigid VVT-k

Összecsapzódott PLT-k: Tévesen csökkent a PLT-szám. PLT-histogramm jobb oldalán emelkedés Perifériás keneten a kenet szélén láthatók

Óriás PLT-k: Tévesen VVT-ként értékeli a készülék VVT-szám alig változik PLT hisztogramm jobb oldalán, VVT hisztogramm bal oldalán kiemelkedés

PLT < 40 G/L Kóros eredmények kezelése 1. Minta integritásának ellenőrzése (mikroalvadék.) 2. Kenet, ebben fragmens, óriás PLT, nagyon kis VVT keresése WBC ++++ 1:2 arányban izotoniás sóoldattal hígítás össz FVS-t vonja ki VVT-ből; htc-fuga; MCV-t a helyes VVT & Hct alapján számolja (MCV = Hct/VVT x 10), ne adja ki: HGB, MCH, MCHC. PLT-számot a nagy FVS-szám nem befolyásolja

PLT ++++ Kóros eredmények kezelése Kenet értékelése (VVT-fragmens, mikrociták) Ha nincs benne kóros VVT, hígítandó RBC > 7.0 T/L Hígítandó a minta