Balicza-Himer Leonóra Bevezetés az áramlási citometriába
Az áramlási citometria alapjai Folyadékáramban lévő önálló részecskék gyors multiparaméteres mérése Bizonyos molekulák észlelése nagyszámú molekula sokaságban, fluoreszcens festékkel jelölt specifikus antitest segítségével
Az áramlási citométer működési elve Sejtszuszpenzió áramoltatása nyomáskülönbség hatására zárt keringési rendszerben, köpenyfolyadék segítségével FACS: Fluorescence Activated Cell Sorter FACS Aria FACS Calibur
Hidrodinamikai fókuszálás Hidrodinamikai fókuszálás egy kis keresztmetszetű kapilláris fejbe, ebben egy kis térfogat (egy sejt) megvilágítása lézerrel Nagy sebesség (akár 100.000-1.000.000 sejt/perc) központi tér köpeny folyadék minta köpeny folyadék hidrodinamikai fókuszálás fluoreszcencia jel a festett sejtekről egysejtes áramlás lézer fényforrás fényszórás jelek minden sejtről
A jel feldolgozása, sokszorozása A sejtről érkező fényszórás és fluoreszcencia jelek detektálása A sejtenként beérkező adatok digitalizálása és feldolgozása számítógépen áramlási rendszer (köpenyfolyadék) optikai rendszer adatgyűjtés adatfeldolgozás adat analízis fényforrás (lézer) FLUORESZCENCIA JELEK detektorok, jelsokszorozók (+ analóg-digitális konverter) Sejtek megvilágítása Jelek generálása FÉNYSZÓRÁS JELEK
Az áramlási citométer felépítése áramlási kamra mintavevő kamra lézerek detektorok szeméttartály
Az áramlási citométer felépítése
Az áramlási citometria előnyei sejtenkénti multiparaméteres analízis (akár 8-12 féle tulajdonság/sejt) nagy sebesség (akár 10.000 sejt / perc) populáció / heterogenitás / korrelációanalízis lehetősége sejtszortírozás (tetszőleges tulajdonság alapján) lehetősége Az áramlási citométerrel begyűjthető optikai jelek Minden sejtről: fényszórás jelek Előre irányuló fényszórás (FSC) Oldalirányú fényszórás (SSC) A jelölődött sejtekről: fluoreszcencia többféle hullámhossztartományban
Fényszórás jelek feldolgozása Előre irányuló fényszórás Forward scatter (FSC) sejtméret, sejtalak Oldalirányú fényszórás Side scatter (SSC) sejt intracelluláris fénytörése granuláltság
SSC granuláltság A fényszórás jelek feldolgozása 2D dot plot, vérminta granulocita monocita FSC méret, alak vörösvérsejt limfocita
A fluoreszcencia fogalma Egy anyag gerjesztés hatására bekövetkező fénykibocsátása energiaveszteség gerjesztés (excitáció) fénykibocsátás (emisszió) Fluorofór: a fény kibocsátásáért felelős molekula, vagy annak egy része Stokes-törvény: Az emittált foton energiája mindig kisebb, hullámhossza pedig nagyobb, mint a gerjesztő fotoné gerjesztő fény kibocsátott fény
Fluoreszcencia a sejtanalitikában Hoechst DAPI fluoreszcein (FITC) Alexa 488 fikoeritrin (PE) Alexa 568 allofikocianin (APC) propidium-jodid Alexa 647 rodamin Áramlási citofluorimetria Fluoreszcens mikroszkópos technikák Fehérje és DNS technikák
A fluoreszcencia jelentősége nagy érzékenység (~pmol/l) veszélytelen a hasonló érzékenységű radioaktív detektálási módszerekkel szemben detektálás: akár több millió sötét molekulához képest néhány fluoreszcens molekula kvantitatívan is detektálható (intenzitás) A fluoreszcens festékekkel szemben támasztott követelmények Olyan hullámhosszon emittáljanak, ahol kicsi az autofluoreszcencia Az emissziós spektrumuk a lehető legkisebb mértékben fedjenek át (kompenzáció) Jól detektálható, erős fluoreszcenciát eredményezzenek (érzékenység) Alacsony legyen az aspecifikus kötődés mértéke Legyenek olcsók A fehérjék (antitestek) jelölése egyszerű protokollal legyen megvalósítható Ne módosítsák jelentősen a jelölt molekula tulajdonságait
A fluoreszcens fényjelek elkülönítése
Az áramlási citométerekben leggyakrabban alkalmazott lézerek, festékek
Színátfedés, színkompenzáció %-os elektronikus jelerősség korrekció
Az adatok értékelése Hisztogram fluoreszcencia intenzitás -sejtszám Dot plot FSC-SSC
A fluoreszcens jel intenzitása Összefüggés van a jelintenzitás (detektor feszültség), a fluoreszcencia intenzitás és a fluoreszcens molekulák száma közt: A fényesebb sejtek nagyobb feszültség impulzust hoznak létre
Qdot technológia: kimutatás Qdot-biokonjugátummal direkt jelölés Qdottal kapcsolt antitesttel A célfehérjék detektálása Quantum dot (Qdot) nanokristály technológia Qdot nanokristály: a fluoreszcenciához hasonló, de más fizikai hátterű fénykibocsátásra alkalmas félvezető anyag a Qdot mérete szabja meg a kibocsátott fény hullámhosszát Qdot nanokristály szerkezete Előnyök: a fluoreszcens technikát használó molekuláris biológiai módszerek bármelyikében használható nincsenek átfedő spektrumok egyetlen gerjesztő fényforrás elegendő hosszú életidejű jel és stabilitás: hosszú távú vizsgálatok időbeli nyomonkövetésére alkalmas
Felhasználási területek sejtek, receptorok aránya / mennyisége / eloszlása (sejtfelszíni vagy intracelluláris molekulák) fehérjék (strukturális fehérjék, antigének, enzimaktivitás) ionok, szabadgyökök, sejtpigmentek mérése kromoszómák (DNS könyvtárak) DNS, RNS tartalom (sejtciklus, sejtosztódás, proliferáció) életképesség vizsgálat (apoptózis, nekrózis) Kinetikus mérések (sejtaktiváció időbeli nyomonkövetése) membrán fluiditás vizsgálat, Ph, membrán potenciálok funkcionális vizsgálatok sejtszortírozás
Általános jelölési protokoll A biológiai minta feldolgozása, egysejtes állapotba hozása A sejtek lecentrifugálása (ált. 100.000-1.000.000 sejt / minta) Direkt jelölés: 1. Fluoreszcensen jelölt specifikus antitest hozzáadása 2. Vortex, inkubálás 3. Mosás(ok): Centrifugálással a felülúszó eltávolítása 4. A pellet felöntése pufferrel, vortex, mérés Indirekt jelölés: 1. Specifikus 1. antitest hozzáadása 2. Vortex, inkubálás 3. Mosás(ok): Centrifugálással a felülúszó eltávolítása 4. 1. antitesthez kötődő fluoreszcensen jelölt 2. antitest hozzáadása 5. Vortex, inkubálás 6. Mosás(ok): Centrifugálással a felülúszó eltávolítása 7. A pellet felöntése pufferrel, vortex, mérés Opcionális: A vörösvérsejtek lízise Intracelluláris jelölés: fixálás / permeabilizálás
Sejtfelszíni markerek Sejtpopulációk Százalékos megoszlás Dot plot FSC-SSC Kvadráns dot-plot APC-PE Hisztogram fluoreszcencia intenzitás -sejtszám
Intracelluláris markerek, sejtaktiváció Negatív 5,1% RMF: 6,184 1. minta 28,3% RMF: 7,604 2. minta 48,9% RMF: 8,944 pozitív 95,3% RMF: 12,536
Propidium-jodid (PI) Sejtszám Életképesség vizsgálatok PI fluoreszcencia intenzitás -+ -+ -+ ++ ++ ++ -- -- -- +- +- +- AnnexinV-FITC
Sejtszám Sejtszám Sejtszám Sejtciklus, proliferáció vizsgálatok PI fluoreszcencia CFSE fluoreszcencia CFSE fluoreszcencia
Kinetikai vizsgálatok Intracellulaláris Ca 2+ (Fluo3, Fura-Red) Mitokondriális Ca 2+ (Rhod2) Nitrogén-oxid termelés (DAFFM) Szuperoxid termelés (DHE) Plazmamembrán potenciál (DiBAC4(5) Mitokondrium membrán potenciál (TMRM, JC-1)
Sejt szortolás Tetszőleges tulajdonság alapján a sejtek egyenkénti kiválogatása Több különböző jelöléssel akár több (2-4) sejtpopulációt is szétválogathatunk További vizsgálatokhoz (WB, PCR) használhatóak a kiszortolt sejtek Létezik steril sortolás is Elektromos feszültség hatására a sejtek egyenként, a lapátok mentén a megfelelő gyűjtőcsőbe folynak Tisztaság: > 95% Kiszortolt sejtek száma: 300 sejt/sec Visszanyert sejtek: > 50%
Az áramlási citometria használhatósága Egyedülálló molekuláris biológiai módszer Egy heterogén populációból sejtenkénti multiparaméteres analizis Nem csak az egyes sejtek többféle sejtfelszini és intracelluláris fehérje expresszióját, nukleinsavtartalmát, és még számos más paraméterét határozhatjuk meg, de aktuális aktivációs állapotukat is nyomon követhetjük az időben Az egyes sejtek fehérjeexpressziójának mértéke is összehasonlithatóvá válik Élő sejteket vizsgálhatunk, melyeket egy kívánt paraméterre kisortolva azok akár további vizsgálatokra is alkalmasak lehetnek A jelölő antitestek más módszerekhez is használhatóak, gyors jelölési procedúra Azonnal kvantitativan értékelhető eredményeket kapunk Számos más, csak szűk területen alkalmazható molekuláris biológiai módszer kiváltására alkalmas lehet