A fény Abszorpciós fotometria Fluoreszcencia spektroszkópia. 2010. október 19. Huber Tamás PTE ÁOK Biofizikai Intézet E A fény elektromos térerısségvektor hullámhossz A fény kettıs természete: Hullám (terjedéskor) Részecske (kölcsönhatáskor) B x Elhajlás (diffrakció) Interferencia Polarizáció Fotoeffektus Compton-effektus x Transzverzális hullám Az elektromos és a mágneses térerısség vektorai merılegesek egymásra, valamint a haladási irányra! A spektrumok megjelenési formái vonalas (atomok (magas hımérséklető, ritka gázok)) széles hullámhossz tartományokat nulla intenzitás jellemez a spektrumvonalak pozíciói a fényt kibocsátó kémiai elemre jellemzıek (kémiai összetevık, koncentráció) sávos (molekulák) sok, egymáshoz közeli vonal megjelenésük a molekula forgásával, illetve a molekulát alkotó atomok vibrációival (rezgéseivel) kapcsolatos Sir Isaac Newton (1642 1727) folytonos (hevített anyagok) a folytonos spektrumban minden hullámhossz képviselve van, és a szomszédos hullámhosszak intenzitásai folytonosan kapcsolódnak egymáshoz, vagyis a spektrumban nincsenek ugrásszerő intenzitásváltozások Emissziós (kibocsátási) illetve abszorpciós (elnyelési) színképek
Magas hımérsékleten izzó szilárd és folyékony anyagok Izzó gázok emissziós spektruma Joseph von Fraunhofer (1787 1826) Sötét vonalak a Nap spektrumában, amelyeket a szoláris kromoszférában lévı elemeknek a Nap forró belsejérıl kibocsátott látható sugárzás bizonyos hullámhosszain történı abszorpciója okoz. Izzó gázok abszorpciós spektruma http://astro-canada.ca/_en/a3300.html Néhány elem vonalas (emissziós) spektruma He A spektrum Egy hullám, például elektromágneses hullám felhasadása alkotó frekvenciáira. Egy intenzitás-jellegő mennyiség ábrázolva egy energiajellegő mennyiség függvényében. Ne Ar intenzitás, beütésszám (pl. radioaktivitás mérése), fotonszám, transzmittancia, abszorbancia (extinkció, OD) energia és azzal arányos mennyiségek (pl. frekvencia, hullámhossz, hullámszám) abszorpció λ (nm) Fény és anyag kölcsönhatása Kvantált energiafelvétel (foton) Atomi rendszerrel (anyaggal) kölcsönható elektromágneses sugárzás: visszaverıdhet (reflexió) elnyelıdhet (abszorpció) áthaladhat (transzmisszió) a biológiai hatás létrejöttének feltétele! A fényabszorpció A beesı fénynyaláb elektromos tere az útjába esı kis részecskék töltéseit rezgésre kényszeríti apró oszcillátorok vagy rádióadók elektromágneses hullámokat bocsátanak ki Ha ez a rezonanciafrekvencia: a rezgési amplitúdó megnı, belsı súrlódás lép fel az oszcillátor energiája lecsökken az anyag részlegesen elnyeli a sugárzást
Transzmisszió Gerjesztı fény f rezonancia I 0 Atomi/molekuláris rendszer I I 0 I Fényintenzitás-változás fényforrás minta detektor T = I / I 0 Általában százalékban (%) adjuk meg. Abszorpció Az abszorpció E OD A = lg (I 0 /I) = ε(λ). c. x I = I 0. 10 -ε (λ) x c Lambert-Beer törvény Megjegyzés: a transzmittancia nem additív: ha az egyik komponens átenged 30%-ot, a másik 60%-ot, akkor a kettı együtt NEM 90%- ot fog átengedni! ε (λ) : az extinkciós koefficiens (anyagi minıségtıl függ), c: a minta koncentrációja, x: az optikai úthossz Miért ε (λ) és nemcsak ε? Hogyan mérjük az abszorpciót? fotometria = abszorpciós spektroszkópia abszorpció Egy fotométer egyszerő sémája: fényforrás monokromátor minta detektor Prizma vagy optikai rács + rés λ (nm) Mert az abszorpció λ függı, így az ε is az kell hogy legyen! Folytonos fényő, pl.: halogén, deutérium, xenon, stb. lámpa mőanyag, üveg, kvarc küvettákban
Egy- és két-utas fotométerek Az emisszió és az abszorpció mérése A fotométer linearitása; stray light effect emisszió Tér bármely irányából! Várható tendencia Meredekség: ε abszorpció Csak lineáris elrendezésben! abszorpció koncentráció A fotométer linearitása; stray light effect Kicsi abszorpció mellett A probléma oka: nem tökéletesek a monokromátorok! I 0 99% λ kiválasztott minta I 89% λ kiválasztott Optikai rács Második, harmadik, stb. felharmónikusok megjelenése! és 1% λ felharmónikus és 1% λ felharmónikus
Nagy abszorpció mellett Fényszórás I 0 minta I Tömény (nagy koncentrációjú) mintáknál jelentkezhet a stray light effect mellett! 99% λ kiválasztott és 1% λ felharmónikus 1% λ kiválasztott és 1% λ felharmónikus minta Ezt is érzékeli a detektor!!! Az abszorpciós fotometria alkalmazásai Különbözı oldatok (pl. fehérjeoldatok!!!) koncentrációjának meghatározása híg oldatok esetén használatos (az oldatban lévı molekulák nem befolyásolják egymás energiaszintjeit) A fehérjék abszorpciójának értelmezése Idıfüggı változások nyomon követése Elektroforetikus minták kiértékelése Anyagi, minıségbeli, szerkezeti változások követése (pl. kémiai reakciók hatására) Idıfüggı mérések Abszorpció 0,2 0,0-0,2-0,4 Abszorpció egyéb alkalmazása SDS-PAGE minták kiértékelése 0 1000 2000 3000 4000 idõ (s)
Lumineszcencia: a fényt kibocsátó rendszer nem a magas hımérséklet miatt világít ( hideg emisszió ). Molekulákból vagy ionokból: molekuláris lumineszcencia. Alapjelenségeit a Jablonski-féle séma szerint értelmezzük. Lumineszcencia alapjelenségek, paraméterek Az energiaszintek felhasadnak: Vibráci ciós szintekre (atommagok rezgı mozgása) Ezek tovább rotáci ciós szintekre (atommagok tengely körüli k forgásából) Gerjesztés módjai ofotonabszorpció (fotolumineszcencia) okémiai reakció (kemilumineszcencia) obiokémiai reakció (biolumineszcencia) oradioaktív bomlás energiája (radiolumineszcencia) Lumineszkáló molekulák szerkezete: konjugált kettıs kötéseket tartalmazó győrőkkel rendelkeznek 1,5-IAEDANS o Ha S 0 alapállapotú molekulát E= h*n energiával gerjesztünk, 10-15 s alatt S 1 gerjesztett állapotba kerül (igen ritkán: S 2 állapotba) o A foton-abszorpció során az elektron spin állapota nem változik meg o A rendszer alapállapotra törekszik: A molekula olyan vibrációs szinten van, ami nem felel meg a környezettel való termikus egyensúlynak S 2 -S 1 átalakulás: 10-12 s alatt S 1 -S 0 átalakulás: 10-8 s alatt Termikus relaxáció: A forró molekula és a környezete közti hıcsere (Vibrációs relaxáció: a vibrációs energia hıvé alakul) Fotoemisszió: A gerjesztett molekula alapállapotba kerül egy foton kisugárzása révén Kasha-szabály: A fluoreszcencia-emisszió az elsı gerjesztett állapot legalacsonyabb vibrációs szintjérıl történik Bizonyíték: bármilyen hullámhosszú foton elnyelésével kerül a molekula gerjesztett állapotba, az emissziós spektrum alakja nem változik S 1 -S 0 nem spintiltott (internal conversion=ic) S 1 -T 1 átalakulás: spintiltott folyamat (spinváltó átmenet, intersystem crossing=isc)
Az S 1 -S 0 átmenet A rendszer többféle úton adhatja le az energiát fény formájában: a. Fluoreszcencia Az elektron a termikus relaxáció után egy lépésben tér vissza az alapállapotba Lecsengése: nanoszekundumos (10-9 ) nagyságrendő b. Foszforeszcencia S 1 állapotú molekula sugárzás nélküli átmenettel T 1 triplett állapotba kerül ebbıl sugárzási energia kibocsátásával kerül S 0 alapállapotba (tiltott spin átmenet miatt kisebb valószínőséggel) Lecsengése: 10-6 -10 s c. Késleltetett fluoreszcencia T 1 állapotból termikus gerjesztéssel S 1 állapotba, majd onnan S 0- ba ( magas hımérséklető foszforeszcencia ) A lumineszkáló anyagot jellemzi: Abszorpciós-,, fluoreszcencia-, foszforeszcencia gerjesztési si és emissziós s spektruma Sugárz rzás s kvantumhatásfoka Gerjesztett állapot élettartama Emisszió polarizáci ciófoka (anizotrópi piája) Az emissziós spektrum A kisugárzott fény teljesítménysőrőségének hullámhossztól való függését kifejezı függvény: J E / λ (λ) Azt a sugárzási intenzitást jelöli, mely egy adott hullámhossz λ környezetében mérhetı. A λ intervallumot a rés szélessége határozza meg. Fluoreszcencia emissziós spektrum Az elsı szingulett gerjesztett állapot legalsó vibrációs szintjérıl az alapállapot valamely vibrációs szintjére való átmenetkor keletkezik. Információt ad az alapállapot vibrációs szintrendszerérıl. Gerjesztési spektrum o Egy rögzített emissziós hullámhosszon detektálunk. o Az intenzitást a gerjesztési hullámhossz függvényében mérjük. o Függvényalakja az abszorpciós spektruméval egyezik meg, de csak az adott hullámhosszon emittáló komponensre jellemzı. Foszforeszcencia emissziós spektrum Az elsı triplett gerjesztett állapotból a szingulett állapotba való átalakuláskor keletkezik. Szobahımérsékleten csak kristályos anyagokon (oldatban: kioltók pl. O 2 ) figyelhetı meg. A fluoreszcencia sávhoz képest a vörös felé eltoldódott.
Stokes-eltolódás A mérés alapelvei Legfontosabb probléma: a gerjesztı fény és az általa okozott lumineszcencia fény elkülönítése I. Fluoreszcencia mérésénél: A gerjesztési és észlelési irányok célszerő megválasztása Három elrendezés 1. Az észlelés iránya merıleges a gerjesztés irányára 2. Az gerjesztés és az észlelés iránya párhuzamos A minta elülsı oldaláról kilépı fluoreszcenciát érzékeljük 3. A minta gerjesztéssel ellenkezı irányú, hátsó oldaláról detektálunk!! Fényszőrık, monokromátorok!! II. Foszforeszcencia mérésénél A gerjesztı fény a foszforeszcenciafénytıl idıben elkülönüljön Az intenzitás idıbeli változása is mérhetı legyen Foszforoszkóp alkalmazása: A mintát gerjesztés után optikai ernyıvel eltakarjuk Ekkor juthat a detektorhoz az emittált fény Az az idı, amely a gerjesztés befejezése és a megfigyelés kezdete között eltelik: függ a forgási sebességtıl függ a nyílások számától Gyakorlatilag elérhetı legrövidebb idı: 10-5 s nagyságrendő Mindig alacsony hımérsékleten kell mérni A forgó átlátszatlan henger résén a gerjesztı fény áthatol, de a foszforeszcencia a henger falán nem jut át Köszönöm a figyelmet! Negyedfordulat után a gerjesztı fény útja záródik el, a foszforeszcencia a detektorhoz jut a henger másik részén