A PROTOKLOROFILLID FORMÁK SZERKEZETE, IN VIVO ÉS IN VITRO EGYMÁSBA ALAKULÁSÁNAK LEHETŐSÉGEI ÉS HULLÁMHOSSZFÜGGŐ FOTOKÉMIAI REAKCIÓI

A PROTOKLOROFILLID FORMÁK SZERKEZETE, IN VIVO ÉS IN VITRO EGYMÁSBA ALAKULÁSÁNAK LEHETŐSÉGEI ÉS HULLÁMHOSSZFÜGGŐ FOTOKÉMIAI REAKCIÓI Doktori Értekezés Készítette: Kósa Annamária Témavezető: Dr. Böddi Béla tanszékvezető egyetemi tanár az MTA doktora ELTE Biológia Doktori Iskola Vezetője: Dr. Erdei Anna Kísérletes Növénybiológia Doktori Program Programvezető: Dr. Szigeti Zoltán ELTE Növényszervezettani Tanszék Budapest 2010

Tartalomjegyzék A gyakran használt rövidítések jegyzéke.......4 1. Bevezetés......5 2. Irodalmi áttekintés.. 7 2.1.A NADPH: protoklorofillid oxidoreduktáz enzim szerkezete és működése....7 2.2. A NADPH:protoklorofillid oxidoreduktáz szerveződése etiolált zárvatermő csíranövények leveleiben. 12 2.2.a A protoklorofillid natív komplexeinek szerkezete és spektrális tulajdonságai levelekben...12 2.2.b A protoklorofillid natív komplexeinek fotoaktivitása levelekben.. 17 2.3. A NADPH:protoklorofillid oxidoreduktáz szerveződése etiolált borsó csíranövény epikotiljában.. 21 2.3.a A protoklorofillid natív komplexeinek szerkezete és spektrális tulajdonságai borsó epikotilban...21 2.3.b A protoklorofillid natív komplexeinek fotoaktivitása borsó epikotilban......24 2.3.c Klorofill típusú pigmentek, mint fotodegradációs folyamatok szenzibilizátorai.. 26 2.4. Az etioplasztiszfejlődést befolyásoló külső tényezők...... 27 2.4.a A citokinin hatása etiolált növények zöldülésre.......28 2.4.b A nitrogénhiány hatásai a plasztiszok ultrastruktúrájára.. 29 3. Célkitűzések..31 4. Anyagok és módszerek....34 4.1. Növényi anyagok. 34 4.2. Homogenátum készítése borsó epikotiljából és leveléből, és a homogenátumokkal végzett kísérletek.. 35 4.3. Borsó hajtástenyészet. 37 4.4. Hidrogén-peroxid és szuperoxid anion kimutatása specifikus jelölőfestékekkel és borsó epikotilok kezelése exogén hidrogén-peroxiddal...37 4.5. Pigmentkivonás..38 4.6. Megvilágítás...39 4.7. Fluoreszcencia spektroszkópia. 41 4.8. Számítógépes spektrumanalízis....42 4.9. Elektronmikroszkópia...42 1

5. Eredmények 43 5.1. Az etiolált borsó epikotil fluoreszcencia emissziós sajátságai.....43 5.1.a A legfelső, középső és legalsó epikotil szegmensek összehasonlítása....43 5.1.b A 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumok sávarányainak változása az epikotilok korával....45 5.2. A 636 nm-es emissziós maximumú protoklorofillid forma átalakulása megvilágítás hatására borsó epikotilban.....46 5.2.a Fehér fényű felvillanásos megvilágítás hatása.. 46 5.2.b Folytonos, kis intenzitású fehér fény hatása 48 5.2.c 632.8 nm-es lézerfény hatása....49 5.3 Etiolált levelek és izolált etioplasztisz belső membránok pklid komplexeinek átalakulása 632.8 és 654 nm-es lézerfény hatására...52 5.3.a Folytonos, kis intenzitású fehér és lézer fény hatása etiolált búza levelekben....52 5.3.b Etiolált búza levelek megvilágítása lézer flash-ekkel....54 5.3.c Folytonos, kis intenzitású fehér és lézer fény hatása etiolált búza levelekből izolált etioplasztisz belső membránok pklid komplexeinek fototranszformációjára 57 5.3.d Búza és borsó levél összehasonlítása..58 5.4 A 636 nm-es protoklorofillid komplex in vitro aggregáltatása etilált borsó epikotilokban....60 5.4.a Fagyasztás-felmelegítés ciklusok hatása az epikotilok fluoreszcencia emissziójára és etioplasztiszainak ultrastruktúrájára.60 5.4.b Epikotil homogenátumok készítése glicerint és szacharózt tartalmazó közegben..62 5.4.c Az epikotilok pklid komplexeinek arányváltozásai a homogenizálás hatására...66 5.4.d A homogenizáló közeg összetételének hatása a P655-re 68 5.4.e A homogenátumban kialakult P655 jellemzése..68 5.4.f Az ATP hatása a P655 keletkezésére 71 5.4.g Fagyasztott-felmelegített epikotil P655 komplexének regenerálása homogenizálással..72 5.5 Az etiolált borsó epikotilok levelekéhez képest nagyobb fényérzékenységének vizsgálata...74 5.5.a Etiolált borsó csíranövények természetes fényre helyezése után bekövetkező szemmel látható változások...75 5.5.b A keletkező reaktív oxigénformák és szöveti lokalizációjuk...75 5.5.c A pklid-ek teljes kifehéredése és regenerációja......78 5.6 A protoklorofillid formák arányainak megváltoztatása...80 5.6.a Exogén citokinin hatása etiolált szervtenyészetek spektroszkópiai tulajdonságaira és etioplasztiszainak ultrastrukturájára 80 5.6.b Különböző mértékű nitrogénhiány hatása szervtenyészetben fejlődött borsó szárak etioplasztiszainak kialakulására.83 5.6.b.1 A különböző nitrogéntartalmú táptalajokon fejlődött borsó növénykék morfológiai tulajdonságai..84 5.6.b.2 A különböző mennyiségű nitrogént tartalmazó táptalajokon fejlődött borsó növénykék szárának összehasonlítása..84 2

6. Az eredmények megvitatása 88 6.1. Az egyes pklid komplexek variabilitása borsó epikotilokban..88 6.2. A borsó epikotil 636 nm-nél emittáló pklid formájának egy része monomer pklid-por- NADPH hármas komplex 89 6.2.a A P636 flash-fotoaktivitása..89 6.2.b A P636 mesterséges aggregáltatása....93 6.2.c A P655 re-aggregációja P636-ból 99 6.3. A 655 nm-nél emittáló pklid komplex megvilágításával közvetlenül lehet 676 nm-en emittáló klid vagy kl formát előállítani.101 6.4. A nem közvetlenül átalakuló monomer pklid-ek élettani szerepe...104 6.4.a A nem flash-fotoaktív monomer pklid-ek fotooxidációs, fotodestrukciós folyamatok fotoszenzibilizátorai.104 6.4.b Kis fényintenzitáson történő zöldülés.106 6.5. A teljes bleachelés utáni regeneráció.. 107 6.6 A pklid komplexek arányait befolyásoló tényezők a növénynevelés során..109 6.6.a A szervtenyészetben fejlődött etiolált borsó szárak és az etiolált epikotil összehasonlítása...109 6.6.b Az exogén citokinin hatása etiolált borsó szervtenyészetek szárának etiolasztisz ultrastruktúrájára és spektrális tulajdonságaira.110 6.6.c A nitrogén hatása etiolált borsó szervtenyészetek szárának etiolasztisz ultrastruktúrájára és spektrális tulajdonságaira..111 7. Következtetések 113 8.A Összefoglalás..118 8.B Summary 119 9. Irodalomjegyzék...120 10. Köszönetnyilvánítás...146 11. Függelék..147 3

A gyakran használt rövidítések jegyzéke BAP benzil-amino purin Cxxx klorofillid komplex, melynek fluoreszcencia emisszós maximuma xxx nm-nél van DAB diaminobenzidin kl klorofill klid klorofillid NBT nitrobluetetrazolium PFD foton flux denzitás pkl protoklorofill pklid protoklorofillid PLT prolamelláris test POR fénytől függő NADPH:protoklorofillid oxidoreduktáz (EC 1.3.1.33) PT protilakoid Pxxx protoklorofillid komplex, melynek fluoreszcencia emisszós maximuma xxx nm-nél van ROS reaktív oxigén fajták 4

1. Bevezetés A klorofillok alapvető szerepet játszanak a fényenergia kémiai energiává történő átalakításában a fotoautotróf szervezetekben. Az élő szervezetekben a klorofillok pigmentprotein komplexeket alkotnak, amelyek a kloroplasztiszokban fotokémiai rendszerekben lokalizáltak. A fotoszintézis fotokémiai reakcióihoz kapcsoltan a klorofillok egy része irreverzibilisen fotooxidálódik/degradálódik, ezért a növények anyagcseréje szempontjából alapvetően fontos, hogy a klorofill bioszintézise pótolja a lebomló molekulákat. A klorofill bioszintézis kulcslépése a NADPH: protoklorofillid oxidoreduktáz enzim által katalizált protoklorofillid - klorofillid átalakulás. Ez a redukciós lépés zárvatermő növényekben csak fény hatására megy végbe. Ezért a sötétben nevelt zárvatermő csíranövényekben protoklorofillid halmozódik fel, kloroplasztiszok helyett pedig etioplasztiszok fejlődnek. Az etioplasztiszok belső membránrendszere szabályos szerkezetű prolamelláris testekből és kevésbé rendezett protilakoidokból áll. A NADPH: protoklorofillid oxidoreduktáz enzim részt vesz a prolamelláris testek kialakításában. In vivo körülmények között a NADPH: protoklorofillid oxidoreduktáz enzim, a NADPH koenzim és a protoklorofillid hármas komplexeket alkot. Ez a hármas komplex képezhet monomer egységet vagy dimerré, illeve oligomerré aggregálódhat úgy, hogy ennek következtében a protoklorofillidek π-elektronfelhői is kölcsönhatásba kerülhetnek. Ezért spektroszkópiai módszerekkel jól elkülöníthetőek. Ezekről az aggregált állapotú formákról sok információ van a szakirodalomban. Egyértelműen bizonyították róluk, hogy ms-os időtartamú felvillanásos megvilágításra a NADPH: protoklorofillid oxidoreduktáz enzim egységek aktív centrumában kötött protoklorofillidek klorofillidekké redukálódnak. Számos olyan kérdés tisztázatlan azonban, mint például az előforduló protoklorofillid komplexek pontos száma vagy aggregációs állapota, illetve az ezeket befolyásoló faktorok. A monomer protoklorofillidet tartalmazó formák (amelyekről kiderült, hogy természetes fényviszonyok között olyan növényi szövetekben is előfordulnak, amelyek más szövetek által leárnyékolva fejlődnek) szerkezetéről, zöldülésben való szerepéről és fotoaktivitásáról pedig csak feltételezések vannak az irodalomban. Munkánk során etiolált szárakban és levelekben in vivo és in vitro vizsgáltuk a protoklorofillid komplexek fotokémiai aktivitását, egymásba 5

történő átalakulásuk lehetőségeit, és a nevelési körülmények hatását a különböző komplexek arányaira. Munkánk során 632.8 nm-es He-Ne lézerfénnyel és 654 nm-es lézerdióda fénnyel, a megvilágítás idejét és foton flux denzitás értékét, valamint a minta hőmérsékletét változtatva, megkíséreltük szelektíven átalakítani az egyes protoklorofillid formákat. Glicerint és szacharózt tartalmazó pufferekben kísérletet tettünk a rövid hullámhosszú protoklorofillid formák aggregáltatására. Megfigyeltük a protoklorofillid formák regenerációját előzetesen kifehérített, majd sötétbe helyezett mintákban. Tanulmányoztuk a citokinin és a nitrogén ellátottság szerepét a prolamelláris test membránrendszerének kialakulásra borsó szervtenyészetekben. 6

2. Irodalmi áttekintés A NADPH: protoklorofillid oxidoreduktáz enzim szerkezete és működése A klorofill (kl) bioszintézis egyik kulcslépése a protoklorofillid (pklid) átalakulása klorofilliddé (klid), ami a porfirin váz D pirrol gyűrűjében a C17 és C18 szénatomok közötti kettőskötés telítődését jelenti. A folyamatot a NADPH: protoklorofillid oxidoreduktáz (POR) enzim katalizálja, amely koenzimként NADPH-t használ (Griffiths 1978). Zárvatermő növényekben az enzim katalitikus aktivitása fényfüggő. Más taxonokba sorolható fotoszintetizáló szervezetekben fény-független pklid redukciós rendszer is van. Ezekben a zárvatermőkre jellemző pklid reduktáz (LPOR vagy light - POR) mellett található egy azzal azonos funkciójú, de eltérő molekulaszerkezetű, alegységösszetételű, genom kódolású és katalitikus mechanizmusú enzim (DPOR vagy dark - POR) is. Anaerob fotoszintetizáló baktériumokban csak a DPOR fordul elő (Fujita 1996, Masuda and Takamiya 2004). Jelen dolgozat csak a fényfüggő LPOR enzimmel foglalkozik, ezért a továbbiakban a POR rövidítés csak az LPOR-t (EC 1.3.1.33) jelenti. A POR enzim széles körben elterjedt a legtöbb aerob fotoszintetizáló szervezetben a cianobaktériumoktól a szárazföldi növényekig; aminosav szekvenciája a különböző csoportokban nagymértékben azonos (Fujita 1996, Armstrong 1998). A POR in vivo az enzimek között különleges tulajdonságokkal rendelkezik: az általa katalizált reakció 1 ms-os megvilágítás alatt végbemegy (Böddi et al. 2003), maximális sebesség 14 C-on mérhető, de 80 C-on is képes működni az enzim (Sironval and Brouers 1970). 77 K-en történő megvilágítás hatására fotokémiai intermedierek keletkeznek (Lebedev and Timko 1998). Egy növény egész élete folyamán képes kl-t szintetizálni, erre szüksége van a növekedése és a pigmentek turn overe miatt is (Brown et al. 1991). Ennek ellenére azt tapasztalták, hogy etiolált csíranövények megvilágítása után a POR gén expressziójában gyors negatív reguláció következik be (Forreiter et al. 1990). Ezzel nem összeegyeztethető módon olyan eredményekről is beszámoltak, hogy a POR mrns-ének szintjére változó hatással volt a fény: egyes fajok esetében változatlan maradt a szint, másoknál csökkent (Meyer et al. 1983). Az ellentmondást feloldotta, hogy árpában (Hordeum vulgare L.) és lúdfűben (Arabidopsis 7

thaliana (L.) Heynh) két, fény által szabályozott izoformáját mutatták ki az enzimnek: a POR A-t és a POR B-t (Armstrong et al. 1995, Holtorf et al. 1995). Aminosav szekvenciájukat tekintve nagyon hasonlóak, kivéve az N-terminális régiót. Mindkét izoforma mrns-e szintetizálódik etiolált csíranövényekben, de a POR B mrns-e tovább akkumulálódik fényen, még a POR A mrns-e gyorsan degradálódik megvilágítás után. Úgy gondolták, hogy ezek eltérő aránya okozza etiolált csíranövényekben, hogy a különböző fajok POR transzkriptumai eltérően reagálnak fényre (Armstrong et al. 1995). Ezt a képet némileg módosította a POR C kimutatása Arabidopsisból. Etiolált növényekben nem detektálható az mrns-e, de megvilágítás után megnő a mennyisége (Oosawa et al. 2000). Tehát a POR B és a POR C gének expressziója nemcsak a csíranövények fejlődése során mutatható ki, hanem a növény későbbi élete folyamán ezek a gének felelősek a nagy mennyiségű kl bioszintézisért. Érdekes eredmény, hogy Arabidopsis porb és porc dupla mutánsokban, melyek etioplasztiszaiban kisebb prolamelláris testek (PLT) alakulnak ki, kloroplasztiszaikban pedig a tilakoidok kevesebb gránumot alkotnak, a POR A ektopikus overexpressziójával helyreállítható a normális fejlődés és a kl bioszintézis (Paddock et al. 2010). Találtak olyan fajokat, amelyekben a POR gének szerveződése, illetve expressziója a fény hatására különbözik az előzőekben leírtaktól. Például uborka (Cucumis sativa L.) etiolált szikleveleiben folyamatos megvilágítás hatására nő a POR mrns és fehérje szintje (Kuroda et al. 1995). A fényindukált POR gén expressziója megmarad érett levelekben is, ami jól összeegyeztethető a kl akkumulációval (Kuroda et al. 2000). Kiderült, hogy uborkában csak egyetlen POR gén van (Fusada et al. 2000). Borsóban (Pisum sativum L.) szintén egy gén kódolja az enzimet, de POR ellen termeltetett antiszérummal két különböző polipeptidet találtak (Spano et al. 1992, Sundqvist and Dahlin 1997). A POR enzimek transzkripciója a sejtmagban történik, a citoplazmában történő transzláció után egy nagyobb molekulasúlyú prekurzor transzportálódik a plasztiszokba (kloro- vagy etioplasztisz). Ezt a sztrómában működő peptidáz hasítja. A búzából (Triticum aestivum L.) kinyert érett protein kb. 36 kda (Teakle and Griffiths 1993). A POR enzim aminosav szekvenciája alapján a rövid szénláncú alkohol dehidrogenáz enzimcsalád tagja (Wilks and Timko 1995). Az ebbe a csoportba tartozó enzimek másodlagos szerkezetére jellemző egy központi, hét szálból felépülő β-lemez, amelyet kilenc α-hélix vesz körül (Townley et al. 2001) (I1. ábra). A POR sajátos vonása a csoporton belül egy nagy extra hurok (loop) az ötödik és hatodik β-szál között. Ez egy hidrofób régió, amiről azt feltételezték, 8

hogy a membránokhoz (Birve et al. 1996) vagy más proteinekhez való kötődésben lehet szerepe (Reinbothe et al. 2003). I1. ábra: A POR enzim másodlagos szerkezete, koenzim (sárga)- és szubsztrát (zöld)-kötőhelye. (Townley et al. 2001) Az elképzelések szerint a POR harmadlagos szerkezetét tekintve globuláris protein. N- terminális régiójában egy tipikus NAD(P)-kötő motívum (Rossmann-fold: βαβαβ struktúra) van, ami biztosítja a kofaktor-kötőzsebet (Birve et al. 1996). Pklid redukciós mutánsok komplementációs vizsgálata alapján tudják, hogy konzervatív Tyr és Lys aminosav oldalláncok esszenciálisak a POR aktivitásához. Feltételezik, hogy a Tyr mint protondonor, a Lys pedig a Tyr pka értékének csökkentésében fontos, ami lehetővé teszi a deprotonációját (Wilks and Timko 1995). A konzervatív Tyr és Lys a hatodik α-hélixen (α -F) van, ami a szubsztrátkötőhely egy részét alkotja. Feltételezik róluk, hogy szerepük van a szubsztrát és kofaktor kötésének megfelelő orientációjában (Lebedev et al. 2001). A POR által katalizált reakciónak a biokémiában szokatlanul nagy sebessége ráirányította a figyelmet az enzim katalitikus aktivitásának a vizsgálatára. Különböző spektroszkópiai módszerekkel kimutatták, hogy fotofizikai és fotokémiai intermedierek léteznek a fs ms időskálán a pklid és klid között (Franck and Mathis 1980, Iwai et al. 1984, Lebedev and Timko 1999, Heyes et al. 2003, Heyes and Hunter 2005, Sytina et al. 2009). Ez azt jelenti, hogy a porfirin gyűrű 17-18 C atomja közötti kettőskötés több lépésben telítődik. Egyes intermedierekről kimutatták, hogy átmeneti ionként és/vagy szabad gyökként ( ion-gyök 9

komplex ) fluoreszcencia kioltóként ( quencher ) viselkednek (Belyaeva et al 2001). Az elmúlt évek kutatási eredményei alapján elfogadott elmélet szerint megvilágításkor a pklid C17-C18-as kettőskötésén átmeneti töltésszeparáció valósul meg, ami előmozdítja a hidrid ion transzferjét a NADPH kofaktorról a pklid C17-es szénatomjára, ezt követően pedig lezajlik a fentebb említett proton átvitel a szomszédos Tyr-ról a C18-as szénatomra (Heyes et al. 2006). Mindez a pikoszekundumos időskálán (Zhong 2007) (I2. ábra). I2. ábra: A POR enzim röntgen-krisztallográfia alapján kapott szerkezeti modellje és az aktív centrumának kialakításában szerepet játszó Tyr és Lys aminosav oldalláncának, a szubsztrátként kötött pklid-nek és a NADPH koenzimnek egymáshoz viszonyított térbeli orientációja. A szaggatott vonalak azt jelzik, hogy a pklid C17-C18 szénatomjai között található kettőskötés telítéséhez a NADPH-ról két elektron és egy proton (hidrid), a Tyr oldalláncáról pedig egy proton származik. (Zhong 2007) Olyan mutánsokkal végzett kísérletek, amelyekben a Cys-t Ser-re cserélték ki, mutatják, hogy a Cys 119 a NADPH kötésben lehet fontos (Townley et al. 2001), a Cys 281 a feltételezett aktív hely része. A Cys 308 egyik kötőhely kialakításában sem szerepel, de közel van az aktív helyhez, így hatást gyakorolhat a pklid kötésére vagy redukciójára. Elképzelhető, hogy a háromdimenziós struktúra fenntartásában van szerepe (Aronsson et al. 2001). A POR enzim egységeken két kötőhelyet feltételeznek, melyek közül az egyik az aktív centrum (Klement et al. 1999, Franck et al. 2000, Buhr et al. 2008). A POR enzim szubsztrátspecificitásának vizsgálatát etiolált búza etioplasztiszának PLT-éből izolált enzimeken végezték, különböző szubsztrátok hozzáadásával. A POR képes volt katalizálni pklid-a, Zn protofeoforbid-b fotoredukcióját; de nem fogadott el szubsztrátként protoklorofill- 10

a-t, protoklorofill-b-t (Schoch et al. 1995) illetve pklid-a t (ciklopenton gyűrű izoméria) vagy bármilyen pklid-a-tól eltérő C13 2 -szubsztituált komponenst (Helfrich et al. 1996). További vizsgálatokat végeztek zab (Avena sativa L.) etioplasztiszokból származó pigmentmentes POR-on. Azok a pklid analógok, melyek oldalláncai az A vagy B pirrol gyűrűn voltak, aktív szubsztrátnak bizonyultak, de a D vagy E gyűrűn oldalláncokkal rendelkező analógok nem szubsztrátjai a POR-nak (Klement et al. 1999). Ezzel jó összhangban vannak Rüdiger és mtsai (2005) a POR aktív centrum topológiájának megismerésére irányuló in vitro vizsgálatának eredményei. A szerzők kémiailag módosított pklidek reakcióképességét tanulmányozták maltózkötő proteinnel fúziós konstrukcióként expresszáltatott borsó POR-ral. A szubsztrátok úgy kötődnek a POR aktív centrumában, hogy a C, D és E pirrol gyűrűik a kötőzseb belsejében helyezkednek el, míg az A és B gyűrűk az enzim felszíne felé irányultak, sőt onnan ki is nyúlhatnak. A rekombináns enzimmel szemben a natív esetében nem feltétlenül valósul meg az A és B gyűrűk közegnek való kitettsége, mivel az etioplasztiszokban a POR nagyrészt aggregált formában van jelen, így nem marad szabad hely az enzim felszínén. A reakciósebességnek a szubsztrát és kofaktor koncentrációktól, valamint a fényintenzitástól való függésének vizsgálata azt mutatta, hogy egy pklid és egy NADPH molekula szerepel a fotoaktív reakciókomplex kialakításában, a reakció pedig monokvantumos mechanizmuson keresztül folyik (azaz egy foton elég, hogy kiváltsa a két elektron hidridként való transzferjét) (Griffiths et al. 1996, Lebedev and Timko 1999). Összetett rendszerekben in vitro is sikerült létrehozni olyan mesterséges komplexeket, amelyek a natív struktúrához hasonlóan fotoaktivitást is mutattak. Tisztított POR apoenzimet, NADPH-t, a pklid Zn analógját, plasztisz lipideket és nagy koncentrációjú glicerint használtak (Klement et al. 2000). Ezek a munkák azt mutatták, hogy a natív komplexek kialakulásában nemcsak a pigment-pigment és a pigment-fehérje kölcsönhatások fontosak, hanem az etioplasztisz membránjaiban található lipidek is. Az itt található, főleg glikolipidek pontos szerepe nem tisztázott, de a glikolipidek és a POR enzim közötti kölcsönhatás feltétele annak, hogy a PLT-k szabályos, köbös membránszerkezete kialakuljon. A POR enzim valószínűleg Trp maradékokon keresztül kapcsolódik a lipidek poláros fej csoportjaihoz (Birve et al. 1996). 11

Heyes és Hunter (2004) a POR enzim katalitikus aktivitásának in vitro vizsgálata alapján egy ciklikus sémát állított össze (I.3. ábra) I3. ábra: A POR enzim katalitikus ciklusa in vitro megfigyelések alapján. (Heyes and Hunter 2004) A számok az abszorbciós és fluoreszcencia emissziós maximumokat jelölik nm-ben kifejezve. A NADPH:protoklorofillid oxidoreduktáz szerveződése etiolált zárvatermő csíranövények leveleiben A protoklorofillid natív komplexeinek szerkezete és spektrális tulajdonságai levelekben Az Irodalmi áttekintésben eddig ismertetett eredmények mind enzimológiai, molekuláris biológiai vizsgálatokon alapulnak. Ismert viszont, hogy a POR enzim egységei natív struktúrákba rendeződnek, melyek eltérő spektrális tulajdonságokkal rendelkeznek, így a sötétben nevelt zárvatermő csíranövények leveléről mért abszorpciós és fluoreszcencia emissziós spektrumok összetettek (Shibata 1957, Cohen and Rebeiz 1981). A kék tartományban (400-500 nm) ez az összetettség részben azzal magyarázható, hogy a pklid Soret (By(0-0) és Bx(0-0)) sávjai karotinoidok abszorpciós sávjaival fednek át. A vörös tartomány 610 nm feletti régiójában viszont sötétben nevelt levelekben csak a pklid pigmenteknek van 12

abszorpciós és fluoreszcencia emissziós sávja (Houssier and Sauer 1969). Az a tény, hogy ennek ellenére egymással átfedve, együtt, több sáv figyelhető meg, arra utal, hogy a pklid in vivo többféle komplexet alkot (Kahn et al. 1970, Schoefs 2000a). Ezt a fajta spektrális variabilitást a kromofórok eltérő molekuláris kölcsönhatásai okozzák. Mivel az egyes komplexek szerkezetéről a szakirodalomban sokáig nem volt pontos információ, bevezették a forma kifejezést és fogalmat. Sőt, mivel spektrálisan nem lehet in vivo elkülöníteni, nem különböztették meg a pklid-et és annak észtereit (amit ma protoklorofillnak (pkl) nevezünk) sem, és összefoglaló néven pkl-ként jelölték. A forma kifejezést olyan molekulakomplexekre használták, amelyekben a kromofór azonos (pklid vagy annak észtere), de különböző molekuláris kölcsönhatásokban vesz részt. A tényleges szerkezetre való tekintet nélkül, ezeket a formákat csak vörös abszorpciós és/vagy fluoreszcencia emissziós maximumukkal jellemezték. Manapság a forma mellett a komplex elnevezés is elterjedt, és ezzel a szerkezetre vonatkozó információt is próbálják megadni. A spektrális sokféleséget okozó tényezők közé sorolható a pigmentek aggregációja (Böddi et al. 1989), az etioplasztiszokon belüli eltérő lokalizációja (Ryberg and Sundqvist 1982), és különböző proteinekhez való kötődése. Az egymáshoz kapcsolódó POR enzim egységei között a pklid molekulák közvetlen közelében NADPH található, amelynek redox állapota befolyásolja a maximumok pozícióját (El Hamouri 1984, Franck et al. 1999). A POR proteinek aggregációjának hatására az általuk kötött pklid molekulák is közel kerülnek egymáshoz, köztük kölcsönhatások alakulhatnak ki, ezeket modellezték in vitro rendszerekben. Specifikus, közvetlen kölcsönhatás jöhet létre egy pigmentmolekula ciklopentanon gyűrűjén lévő C13 1 ketocsoport és egy másik molekula Mg atomja között (Brouers 1979). Nem specifikus kölcsönhatások alakulhatnak ki pusztán a π - elektronfelhőik átfedése miatt, oldalláncok közvetlen kapcsolódása nélkül is (Böddi et al 1986). Közvetett kölcsönhatás olyankor valósul meg, ha a pigmentmolekulákat hídként, két funkciós csoporttal rendelkező molekula köti össze (víz, vagy in vitro rendszerekben dioxán). A vízmolekulák száma és megkötésük módja befolyásolhatja a spektrális tulajdonságokat. A fenti kölcsönhatások ismétlődése révén dimérnél nagyobb aggregátumok is kialakulhatnak (Böddi et al 1983). 13

Az aggregáció és a spektrális sajátosságok közötti összefüggések tanulmányozására különböző mesterséges rendszereket alakítottak ki. Izolált, spektroszkópiai tisztaságú pkl vagy pklid aggregációját vizsgálták, és elő tudtak állítani fehérje és NADPH nélküli rendszerekben a natív pkl és/vagy pklid formákkal megegyező abszorpciós maximumú pigmentaggregátumokat: Vizsgálták a pigmenteket apoláros oldószerekben (Seliskar and Ke 1968, Brouers 1972), szilárd filmek multimolekuláris rétegeiben (Böddi et al. 1980) és Triton X-100 micelláris oldataiban (Böddi et al 1983, Myśliwa-Kurdziel et al. 2007) is. A szilárd filmekben megfigyelték a különböző nagyságú pigmentaggregátumok egymásba történő átalakulását, a 640 és 650 nm-es abszorpciós maximumú formák különböző térszerkezetű módosulatait (Böddi et al. 1980). Triton X-100 micelláris oldatában az egy micellára jutó pigmentmolekula szám megváltoztatható. Ilyen módszerrel sikerült kimutatni, hogy legalább 10 pkl(id) kell a 650 nmes abszorpciós maximumú forma kialakulásához (Böddi et al 1983). Ezek a rendszerek csak modellezik a spektrális tulajdonságok és az aggregáció kapcsolatát, a nagymértékű spektrális hasonlóság ellenére nem feltétlenül várható teljesen azonos struktúra (például azonos módon történő kölcsönhatás az oldalláncok között). In vivo vizsgálatokat is folytattak a POR aggregációs állapotával kapcsolatban. A PLTek kialakulása és a 655 nm-es pklid forma megjelenése között in vivo korreláció figyelhető meg (Butler and Briggs 1966, Klein and Schiff 1972), ami arra utal, hogy a PLT és a fotoaktív pklid keletkezése a POR aggregációjának a következménye (Böddi et al. 1989, Sundqvist and Dahlin 1997). A POR aggregációs állapotának vizsgálatára a PLT-ekben, különböző crosslinkereket (kémiai keresztkötést kialakító vegyületeket) használtak. A poliakrilamid gélelektroforézissel szétválasztható komplexek között a legnagyobb mennyiségben a POR dimerje volt, de nagyobb aggregátumokat: tetramért, hexamért és oktamért is kimutattak. Ráadásul, olyan nagy komplexek is kialakultak, amelyek be sem tudtak lépni a gélbe (Wiktorsson et al. 1993). (Maltózkötő proteinnel fúziós konstrukcióként expresszáltatott borsó POR esetében in vitro is kimutattak dimerizációt (Martin et al. 1997).) A foszforiláció kedvez a POR proteinek aggregációjának az etioplasztiszokban, de a pontos mechanizmus nem tisztázott (Wiktorsson et al. 1996, Kovacheva et al. 2000). 14

A natív állapotról mért komplex spektrumok a spektroszkópiában régóta ismert módszerekkel összetevőikre bonthatók (különbségi spektrumok számolásával, deriválással vagy Gauss komponensekre történő bontással) (Böddi et al. 1991, 1997, Horton and Leech 1975). Mivel a különböző pklid komplexek lokalizációja eltérő az etioplasztiszokon belül, az őket kötő membránpartikulumok elkülöníthetők egymástól és spektrumaik mérésével azonosíthatóak a PLT-ekben és protilakoidokban (PT) lokalizált komplexek. A PT-ok spektrumának fő emissziós sávja 633, míg a PLT-oké 656 nm környékén van. Ezzel a módszerrel a pklid komplexek tehát fizikailag is megkülönböztethetők egymástól (Ryberg and Sundqvist 1982). Etiolált levelek és azokból izolált etioplasztisz belső membránok 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumainak analízisével a következő maximumokkal rendelkező pklid formákat mutatták ki: 633, 644-645, 655-657 és 670 nm (Böddi et al. 1992, 1993). Részletes fluoreszcencia spektroszkópiai adataikat az 1. táblázat mutatja. Etiolált búzaleveleken 10 K-en végzett mérésekből kimutatták, hogy van egy további, kis amplitúdójú, 628 nm-es emissziós maximumú sáv is (Kis-Petik et al. 1999). I1. táblázat: Etiolált levelekben, illetve izolált etioplasztisz belső membránokban általánosan előforduló protoklorofillid formák 77 K fluoreszcencia spektroszkópiai jellemzői (Böddi 1994) Gerjesztési maximum (nm) Emissziós (0-0) sáv (nm) Emissziós szatellit (1-0) sáv (nm) Félértékszélesség (nm) Félértékszélesség (nm) Félértékszélesség (nm) 436 12.6 633 14.5 693 20.8 443 10.7 645 14.3 710 17.3 451 11.8 657 10.5 726 17.7 463 12.6 670 20.1 740 21.0 A különböző sávok amplitúdó arányai és a maximumok pozíciói függnek a vizsgált növények korától (Schoefs et al. 1994), nevelési körülményeitől és fajuktól (Schoefs et al. 2000a). Levelek spektrumában általában a 655-657 nm-es sáv dominál, de nagyon fiatal (2 naposnál fiatalabb) (Schoefs and Franck 1993) és öregedő (Avarmaa et al. 1984) etiolált növények esetében a 631-633 nm-es sáv nagy intenzitású. A 633 nm-es emissziós maximumú pklid forma monomer állapotú pklid-et (vagy pkl molekulát) tartalmaz. A szakirodalom szerint ebben a formában a pigmentek többsége nem a POR enzimhez kötött (Kis-Petik et al. 1999). Erre a sávra nagy félértékszélesség jellemző, ami 15

a pigmentmolekulák nagyfokú rezgési szabadságát mutatja. Ez azt jelenti, hogy a környezetükkel csak gyenge kölcsönhatásban vannak (Böddi et al 1989). Kimutatták, hogy a PT membránokban lokalizáltak (Ryberg and Sundqvist 1982). A 644-645 nm-nél emittáló formáról cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópiai (Mathis and Sauer 1972), izolációs és in vitro rekonstitúciós módszerek (Martin et al. 1997, Ouazzani Chahdi et al. 1998) eredményei alapján feltételezik, hogy két POR - pklid NADPH hármas komplex által alkotott dimer. A PLT-ek felületéről szonikálással leválasztott membránfrakcióban mutatták ki nagyobb arányban ezt a komplexet (Böddi et al. 1989). A 655-657 nm-es pklid komplexben található a pklid és a POR enzim többsége etiolált levelekben. Szerkezetéről bizonyított, hogy oligomer, vagyis több hármas komplex (nagy) aggregátuma (Böddi et al. 1989, Wiktorsson et al. 1993). A POR enzim egységek közötti aggregáció következtében az aktív centrumokban kötött pklid molekulák közel kerülnek egymáshoz, köztük exciton kölcsönhatások alakulnak ki (Böddi et al. 1989). A fehérje aggregáció olyan molekuláris környezetet biztosít az egységek által közrezárt térben, amelyben olyan pklid molekulák is felhalmozódnak, amelyek nem az aktív centrumokhoz kötődnek, de elektronfelhőikkel a fenti exciton kölcsönhatásokban vesznek részt (Böddi 1994). A NADPH molekulák komplexen belüli helyzete szigorúan meghatározott, mivel részt vesznek a fotoredukcióban és az aggregátumok, illetve a PLT membránok összetartásában is (Ryberg and Dehesh 1986, Engdahl et al. 2001). A komplex a PLT-ek belsejében található (Böddi et al. 1989). A 670 nm-es fluoreszcencia emissziós sáv összetett, a 655-657 nm-es forma vibrációs sávjának és egy ismeretlen szerkezetű, 674 nm-nél abszorbeáló pigment sávjának átfedéséből jön létre (Kis-Petik et al. 1999). Az etioplasztiszok 77 K fluoreszcencia emissziós spektrumában leírtak ennél hosszabb hullámhosszaknál megjelenő sávokat is (Sironval et al. 1967). A régió Gauss komponensekre bontásával kapott maximumok a következők: 682, 692, 712 és 730 nm (Böddi et al. 1992). A kapott sávokat a rövidebb hullámhosszaknál emittáló pklid komplexek vibrációs szatellit sávjainak lehet tekinteni (I1. táblázat, Kis-Petik et al. 1999, Schoefs et al. 2000a). Mások szerint ezek külön ú. n. távoli vörös pklid formák Qy (0-0) átmeneteinek megfelelő fő sávjai (Ignatov and Litvin 2002, Stadnichuk et al. 2005, Amirjani and Sundqvist 2006). 16

A kriogenikus hőmérsékleten kimutatható, 628 nm-es emissziós maximumú formáról az ismeretes, hogy nem POR enzimhez kötött, sőt, más fehérjéhez való kapcsolódása sem bizonyított. Feltehetően olyan monomer állapotú pkl és/vagy pklid, amely gyengén kötött a molekuláris környezetében (Kis-Petik et al. 1999). A protoklorofillid natív komplexeinek fotoaktivitása levelekben A különböző komplexekben található pklid molekulák fotoaktivitása eltérő. Néhány ms-os megvilágításra csak azok a pklid molekulák redukálódnak klid-dé, amelyek hármas komplexet alkotnak NADPH-val és a POR enzimmel, aminek az aktív centrumában helyezkednek el (Griffiths 1978, Lebedev and Timko 1998). Ezeket a pklid-eket flash fotoaktívnak nevezik, jelezve ezzel, hogy a reakció a ms-os időskálán játszódik le. A 655-657 nm-es oligomer és 644-645 nm-es dimer komplex pklid-jeiről bizonyított, hogy ebbe a csoportba sorolhatók (Böddi et al. 1990) (I4. ábra). A 644 és 655 nm-nél emittáló pklid komplexek 1-2 ms-os megvilágításával első lépésben POR klid NADP + egységeket tartalmazó aggregátumok alakulnak ki: a 644-645 nm-es komplexből közvetlenül keletkező dimer 682 nm-nél, a 655-657 nm-es komplexből kialakuló oligomer pedig 686-688 nm nél emittál (Böddi and Franck 1997, Franck et al. 1999). Ezek a komplexek két független, eltérő molekuláris módosulásokkal járó útvonalon alakulnak tovább (Schoefs 2001, Schoefs and Franck 2008): P628-629 P633-636 P644 C682 P655 C688 I4. ábra: A protoklorofillid különböző molekulakomplexeinek feltételezett egymásba történő átalakulási lehetőségei, és flash-fotoaktivitása irodalmi adatok alapján (hivatkozások a szövegben). Pxxx/Cxxx: xxx nm-nél emittáló protoklorofillid/klorofillid komplex (77 K fluoreszcencia spektrumok alapján) 17

(1) Az egyik lehetőség, hogy a hármas komplexekben az oxidált állapotú koenzim NADPH-ra cserélődik (Heyes et al. 2008) (vagy redukálódik vissza), és kialakul egy 694 696 nm-nél emittáló POR klid - NADPH oligomer (Oliver and Griffith 1982, Franck et al. 1999). A 686 688 nm-es oligomer forma esetében bizonyított ez az átalakulás, de a 682 nm es dimer forma ilyen irányú módosulását is feltételezik. Ezt a lépést a nagy aggregátumok szétesése követi a Shibata shift (lásd később) lejátszódása közben, aminek az eredménye egy 680 nm nél emittáló POR - klid - NADPH komplex vagy más proteinhez kötött klid (Shibata 1957). (2) A másik lehetőség, hogy a klid molekula elhagyja az aktív centrumot, helyére pedig pklid kerül (Schoefs et al. 2000b). Az eltávozó klid molekula 675 676 nm-nél emittál (gyors észterifikációjával kl-a keletkezik, ami ugyanitt emittál) (Domanski and Rüdiger 2001); a keletkező POR pklid NADP + hármas komplexeket tartalmazó dimer illetve oligomer emissziós maximuma pedig 637-638 nm, illetve 649-650 nm (Böddi and Franck 1997). A klid kiesése az aktív centrumból gyors folyamat (kb. 5 s a fototranszformáció után). A 686 688 nm-es komplexben található klid-nek csak kis hányada megy keresztül ezen a lépésen. Ilyenkor a pklid a POR egységek által közrezárt térben található, nem aktív központban kötött, pklid molekulákból pótlódik (Böddi 1994). Hosszabb idejű megvilágítás esetén a hármas komplexek regenerációja a nem fotoaktív pklid formák pigmentjeiből történhet (Kahn et al. 1970, Schoefs et al. 2000b). Tehát az in vivo kísérleteken alapuló munkák eredményei alapján általában több, páthuzamosan zajló fototranszformációs utat feltételeznek, szemben az I3. ábrán látható ciklikus reakciósémával. Utóbbi esetében egyébként a szerzők nem foglalkoznak azzal, hogy a POR-pklid-NADPH komplexben a spektrális tulajdonságai alapján dimer pklid-et lehetne feltételezni, amit megerősít az is, hogy fototranszformációjának eredményeként 684 nm-nél emittáló klid komplex alakul ki. A különböző fototranszformációs útvonalak arányát több tényező is befolyásolja. Ilyen a rövid és hosszú hullámhossznál emittáló pklid formák aránya, mely függ a vizsgált növényi fajtól és szervtől (Amirjani et al. 2006), a növény korától (Schoefs and Franck 1993) és ehhez kapcsolódóan a PLT-ek fejlettségi állapotától (Schoefs et al. 1994). 18

A szakirodalomban tényként kezelik, hogy az etiolált levelekben található monomer állapotú pklid in vivo flash megvilágításkor változatlan marad (Schoefs and Franck 2003), sőt a neki megfelelő fluoreszcencia emissziós sáv intenzitása megnövekszik (Dujardin and Sironval 1970, Böddi et al. 1991). Ez utóbbi jelenséget azzal magyarázzák, hogy átalakulnak a mellette levő, energiamigrációban akceptorként szereplő hosszabb hullámhosszú formák, és az energiamigráció megszűnése megemeli a monomer fluoreszcencia hozamát. Érdemes azért kiegészítésként megemlíteni, hogy az energiatranszfer a rövid hullámhosszú monomer pklid formákról a hosszabb hullámhossznál emittálók irányába korlátozott, az etioplasztiszon belüli eltérő lokalizációjuk miatt (Amirjani and Sundqvist 2006). A 633 nm-es sávot monomer pklidhez és monomer pkl-hoz is rendelik (Lindsten et al. 1988). A pkl esetében érthető a fotoaktivitás hiánya, mert a POR nem fogadja el az észteresített pigmentet szubsztrátként (Schoch et al. 1995). A monomer pklid-ek esetében feltételezik, hogy legalább egy részük a POR enzim aktív központjában kötött és a NADPH-val együtt a fentiekhez hasonló hármas komplexet alkot (Grevby et al. 1989). Ilyen szerkezet feltételezése mellett viszont flashfotoaktívnak kellene lennie, ami Mc Ewen és mtsai (1996) szerint nem kizárható. Ezzel szemben az általánosan elfogadott hipotézis alapján minden fototranszformáció a dimer és oligomer pklid komplexeken keresztül megy végbe (Domanski and Rüdiger 2001). A monomerek egyetlen szerepe ezek szerint csak a nagyobb, flash-fotoaktív komlexek regenerálása (Kahn et al. 1970, Hendrich and Bereza 1993). Ilyen esetben feltételezik a monomer pklid-ek transzlokációját a PT membránokból a POR aktív centrumokba (Schoefs et al. 2000b). Érdemes megemlíteni egy jóval korábban közölt fototranszformációs sémát (Mathis és Sauer 1973), melyben feltételezték a monomer pklid-ek egy kisebb mennyiségének a közvetlen átalakulását 672 nm-nél abszorbeáló klid-dé. In vitro kísérletekben megfigyelték a rövid hullámhossznál (633 nm környékén) emittáló pklid-ek fototranszformációját (Schoefs and Franck 2003). Birve és mtsai (1996) etiolált búza levelekből izoláltak POR frakciókat, melyek 630 nm-es fluoreszcencia emissziós maximumuk alapján monomer pklid-et tartalmaztak. Ezek flash-sel történő megvilágításának eredményeként 675 nm-nél emittáló klid keletkezett. A fenti az in vitro eredmények alapján felvetődhet a kérdés a monomer pklid-et tartalmazó komplexek esetleges fotoaktivitásáról. 19

Etiolált levelek flash-megvilágítása után néhány másodperccel tehát a keletkező POR - klid - NADPH komplexek többsége 694-696 nm-nél mutat fluoreszcencia emissziós maximumot. Ez a maximum sötétben, szobahőmérsékleten 20-40 perc alatt 680 nm-re tolódik el. A jelenséget először Shibata írta le abszorpciós spektroszkópiával (Shibata 1957), ezért a szakirodalomban Shibata-shift -nek, vagyis Shibata-féle eltolódásnak nevezik. (A megfelelő abszorpciós maximum 684 nm-ről 672 nm-re tolódik.). A spektrális változás pontos molekuláris háttere tisztázatlan, de biztosra vehetjük, hogy több, párhuzamosan zajló folyamat okozza (Rassadina et al. 2004). A spektroszkópiai mérések a pigmentek molekulaszerkezetének változását mutatják, ebben az esetben főleg azt, hogy a porfirin vázas vegyületek dezaggregálódnak (Butler and Briggs 1966, Artus et al. 1992, Böddi et al. 1990, Wiktorsson et al. 1993). Ezt többféle hatás okozhatja: a POR konformációváltozása (Wiktorsson et al. 1993), a PLT szerkezetének megbomlása, a klid kiszabadulása a POR aktív központjából, a klid észterifikációja (Rassadina et al. 2004) és a kl-a ELIP (early light induced proteins = zöldülés kezdetekor expresszálódó fehérjék) fehérjékhez való kötődése (Adamska 1997). A PLT lebomlásával a korábbi köbös struktúra lamelláris szerkezetet vesz fel. A membrán háromdimenziós lipidszerkezetének megváltozása fontos szerepet játszik a spektrális eltolódásban, mivel hatással van a POR konformációváltozásaira (Smeller et al. 2003). Újabb eredmények alapján a fluoreszcencia sáv kék felé történő eltolódásának kiváltásához elegendő a makrodomén minimális térbeli változása (Solymosi et al. 2007). A pklid655 klid686 klid696 kl680 átalakulási út lineáris reakciósorozatot ír le. Mint a fentiekben láttuk, emellett párhuzamosan a pklid 644 nm-es formája is flashfotoaktív, 682-684 nm-nél emittáló klid komplexszé alakul. A két párhuzamos reakcióút aránya a megvilágító fény intenzitásától függ (Böddi et al. 1991). A telítésinél kisebb fényintenzitást alkalmazva csak részleges fototranszformáció megy végbe. Kis intenzitású, ms-os időtartamú megvilágítás mellett 1 2 %-os fototranszformációnál a 644 nm-es pklid forma átalakulása dominál, (e fölött pedig a 655 nm-es formáé). Az alacsony fényintenzitás hatására a PLT-ek felszínén a 644 nm-es forma fototranszformációja megy végbe (miközben csak kevés 655 nm-es forma alakul át). Ezután sötétben a klidet tartalmazó membránpartikulumok ledisszociálnak az etioplasztisz felszínéről. Emiatt a PLT felszínének egy újabb rétege fellazul, és regenerálódik a 644 nm-es forma, ami egy újabb reakcióban ismét átalakulhat. Tehát alacsony fényintenzitás mellett a 644 nm-es forma aktívabb a 20

fototranszformációban, mint a 655 nm-es. Ezt mutatta a fototranszformáció kinetikájának a tanulmányozása is: az átalakulás kezdeti szakaszában a 644 nm-es forma átalakulása gyorsabb (Böddi 1994). A NADPH:protoklorofillid oxidoreduktáz szerveződése etiolált borsó csíranövény epikotiljában A protoklorofillid natív komplexeinek szerkezete és spektrális tulajdonságai borsó epikotilban A kl szintézis irodalmában található adatok szinte kizárólag levelekkel foglalkoznak (Masuda and Takamiya 2004, Belyaeva and Litvin 2009). Klorenchima szövet viszont megtalálható fiatal, zöld szárakban, vagy szár-eredetű szervekben (módosult szár, epikotil, hipokotil, levélnyél) is. A száraknak tehát jelentős lehet a szerepe a fotoszintézisben (Valladares et al. 2003). Psorothamnus spinosus szár fotoszintetikus aktivitása a teljes növény asszimilációjának 40 75%-a lehet (Nilsen et al. 1989). A zöld szárral rendelkező növényfajok esetén a levél és a szár eltérő mértékben vesz részt a szén megkötésében. Például egy pillangós cserje, a Retama sphaerocarpa esetében, aminek a levelei rövid életűek, a széndioxid fixáció majdnem teljes mértékben a szárban megy végbe (Haase et al. 1999). Vastagodott, fás szárak parenchima sejtjeiben is előfordulhatnak kloroplasztiszok (Szujkó- Lacza et al. 1971), amelyek aktivitása révén a szár fotoszintézise jellegzetes évszakos változást mutat. A szárak fotoszintetikus aktivitása miatt is indokolt a zöldülésük vizsgálata. Etiolált borsó csíranövényeknek megnyúlt, fehéres színű epikotilja van (I5A. ábra), ami alacsony fényintenzitáson megzöldül (I5B. ábra). Ha a borsó rügyecskéje a csírázás kezdetétől fényen fejlődik, az epikotil helyett nóduszokkal tagolt, zöld hajtás alakul ki (I5C. ábra). 21

A B C I5. ábra: Sötétben és fényen csíráztatott borsó csíranövények zöldülése. A: 8 napos, 10 cm-es etiolált borsó csíranövény. B: 4 napig sötétben nevelt, majd alacsony (20 µmol m -2 s -1 ) fényintenzitáson 6 napig zöldített kb. 8 cm-es borsónövény. C: 4 napos, csíráztatásától természetes (200 µmol m -2 s -1 ) fényen nevelt 3 cm-es borsó csíranövény. Etiolált borsó epikotilokból kivont pigmentek abszorpciós és fluoreszcencia emissziós spektrumai azt mutatják, hogy bennük a fő pigment a pklid és/vagy a pkl. Az extraktumok HPLC-vel (high pressure/performance liquid chromatography = nagy nyomású/felbontású folyadékkromatográfia) való vizsgálatából kiderült, hogy a pklid van túlsúlyban, mellette kis mennyiségben a pkl is kimutatható. A pklid tartalom friss tömegre vonatkoztatva a levélének 3 10%-a (vagyis 0.17 0.56 µg/g friss tömeg). A pklid mennyisége nemcsak fajfüggő, hanem változik az epikotil különböző szakaszaiban is. A legalacsonyabb az epikotil alsó régiójában, felfelé fokozatosan növekszik (Böddi et al. 1994). Az epikotilban a levélétől eltérő spektrális tulajdonságú pklid formákat mutattak ki, ezek fluoreszcencia emissziós maximumai rövidebb hullámhosszaknál vannak (I6. ábra). 77 K fluoreszcencia spektroszkópiával mért spektrumok (440 vagy 460 nm-es gerjesztéssel) Gaussbontásával sávokat különítettek el, amelyek maximuma 629; 636 illetve 649 nm-nél voltak (Böddi et al. 1994). 10 K-en mért fluoreszcencia emissziós spektrumok analíziséből kiderült, hogy a 649 nm-es maximumú sáv összetett, két különböző pklid komplexnek felel meg. Az egyik 644-646, a másik 656 nm-nél emittál (Böddi et al. 1998). A fő fluoreszcencia sáv 440 nm-es gerjesztésnél 632 nm-en, 460 nm-es gerjesztésnél 636 nm-en van, tehát a levelekkel szemben borsó epikotilban a rövid hullámhossznál emittáló formák vannak túlsúlyban. Ez a dominancia valamennyi általunk vizsgált borsó epikotil jellemzője, kisebb eltérések a 644 és 22

655 nm-nél emittáló formák arányaiban vannak, melyek mértéke főleg a növény korától függ. Az epikotilra meglepően magas fluoreszcencia hozam jellemző: középső szakaszában 13- szoros értéket mértek a levélhez képest, pedig a pklid tartalom a levélének csak tizede volt (Böddi et al. 1994). I6. ábra: Sötétben nevelt 6.5 napos etiolált borsó csíranövény epikotilja középső szegmensének (folytonos vonal) és levelének (szaggatott vonal) fluoreszcencia emissziós spektruma. A spektrumokat 77 K-en regisztrálták 440 nm-es gerjesztéssel. (Böddi et al. 1994) Sötétben nevelt bab (Phaseolus vulgaris L.) csíranövények hipokotiljában szintén túlsúlyban vannak a monomer pklidet tartalmazó formák (Mc Ewen et al. 1994). Fás növények sötétben hajtatott szárában is általánosak a rövid hullámhosszon emittáló formák, ezek túlsúlya esetén alacsony pigmenttartalom jellemző (Skribanek et al. 2000). A borsó epikotil 629 és 636 nm-nél emittáló formáiról konvencionális 10 K-en mért, és lézer spektroszkópiai mérésekkel (FLN, fluorescence line narrowing - fluoreszcencia sávkiélesedés) is bizonyították, hogy kétféle spektrális tulajdonságú, monomer állapotú pklidet tartalmaznak (Böddi et al. 1998). Dezaggregációt okozó hatásokra nem változnak ezek a sávok, ami szintén bizonyítja, hogy monomer pigmenthez tartoznak (Böddi et al. 1994). A 628 630 nm-es pklid forma általánosan elterjedt sötétben nőtt szárakban és szár-eredetű szervekben, mellette változó mennyiségben lehet a többi pklid forma. A 636-638 nm-es forma 23

is rendszeresen előfordul szárakban, de az előző formáénál kisebb mennyiségben (Skribanek et al. 2000). A borsó epikotil 645 és 656 nm-es formáiról feltételezik, hogy aggregátumok lehetnek, szerkezetük pedig megegyezik a levélben található közel azonos hullámhosszaknál emittáló komplexekével (Böddi et al. 1998). A 652 654 nm-es forma általános szárakban, mennyisége változó, sávjának intenzitása általában a főcsúcsénak harmada, de lehet ugyanakkora is (Skribanek et al. 2000). (Túlsúlya esetén magasabb pklid-tartalom, és a levelekéhez hasonló zöldülés jellemző.) Érdekes megemlíteni, hogy szárakban nem fordul elő 657 nm-nél emittáló komplex. Ennek az lehet az oka, hogy a szárak klorenchima szöveteiben a PLT belső membránrendszere, ahol ez a komplex lokalizált, eltér a levelekétől (Skribanek and Böddi 2000). Borsó epikotilban az etioplasztiszok szerkezete proplasztiszéhoz hasonló (többségében egyszerű belső membránokat tartalmaznak), csak a plasztiszok 6-11%-a tartalmaz kezdetleges PLT-eket, míg levelekben 31% ez az érték. Az epikotilban az etioplasztiszok száma is kisebb, 15-44%-a a levélének (Böddi et al. 1994). A protoklorofillid natív komplexeinek fotoaktivitása borsó epikotilban Mivel a pklid formák aránya szárakban és levelekben eltérő, a zöldülési folyamataik is különböznek. Az irodalomban közölt eddigi adatok azt mutatják, hogy a túlsúlyban levő rövid hullámhosszú pklid formák nem flash fotoaktívak. A kisebb arányban jelenlévő oligomer komplexek viszont felvillanásos megvilágításra átalakulnak, lezajlik bennük a pklidek fotoredukciója, aminek következtében új sáv jelenik meg 680 690 nm-nél (Böddi et al. 1996). Folytonos intenzív megvilágítás (500-600 µmol m -2 s -1 ) a száraknál 10 perc alatt pigment degradációt, fél óra alatt turgorvesztést és a szár görbülését, további megvilágítás esetén pedig barnulást és a növény pusztulását okozza (Erdei et al. 2005). (Gyorsan fásodó száraknál csak pigmentdegradáció történik (Skribanek and Böddi 2000).) Ennek okaként azt jelölték meg, hogy a monomerek érzékenyek fényre, megvilágításukkor fotooxidáció zajlik fotoredukció helyett (ld. később). 24

A 629 és 636 nm-es sávok néhány órás, kis fényintenzitású (15 µmol m -2 s -1 ) megvilágítással átalakíthatók, ekkor egy 680 nm-es maximumú sáv jelenik meg a fluoreszcencia spektrumban (Skribanek and Böddi 2001). Ez a folyamat 0 C alatt nem megy végbe epikotilban, (levélben ilyen körülmények között csaknem 100%-os a fototranszformáció) (Böddi et al 1996). A fotokémiai reakció 0 ºC körül nem hőmérsékletfüggő (Smith and Benitez 1954, Sironval and Brouers 1970), tehát a fototranszformációban szerepet játszó más hőmérsékletfüggő folyamatok válnak sebesség-meghatározóvá. Ilyen lehet a klid diffúzióval történő eltávozása az aktív helyről, és a pklid enzimhez történő diffúziója. Ezt a hipotézist alátámasztja az a tény is, hogy etiolált epikotilban kevesebb POR enzim van, mint levélben, de megvilágítás után hat órával alig csökken a mennyisége, miközben levelekben a POR nagyrésze ennyi idő alatt lebomlik (Böddi et al. 1996). A folyamat az alábbi séma szerint képzelhető el (Böddi 1994): I7. ábra: Sötétben nevelt borsó csíranövény epikotiljában alacsony fényintenzitáson végbemenő zöldülési folyamat javasolt sémája (Böddi 1994 alapján). Pklid pool= protoklorofillid raktár, E= NADPH: protoklorofillid oxidoreduktáz enzim, Klid= klorofillid, a számok a komplexek fluoreszcencia emissziós maximumát jelölik nm-ben. A modell szerint a 629 nm-es forma olyan pklid molekulákat tartalmaz, melyek nem enzimhez kapcsolódnak. A 636 nm-es formában a POR enzim monomer vagy dimer egységeihez úgy kapcsolódnak pklidek, hogy nincs a pigmentmolekulák között exciton kölcsönhatás, tehát monomer állapotúak. Ilyen szerkezet alapján feltételezhető, hogy a 636-os forma pklid-je megvilágításra 680 nm-nél emittáló kliddé alakul, ami azután elhagyja az aktív centrumot. Ezt követően a 629 nm-es formából (mint pklid raktárból) egy újabb pklid juthat el diffúzióval a POR enzimhez, ami így újabb reakciót katalizál. A fenti hipotézis elfogadásához kísérletes bizonyítékokra van szükség. 25