Chlamydia pneumoniaeiggselisa medac Magyar 0123 430TMBVPU/010708
GYÁRTÓ medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Fehlandtstraße 3 D20354 Hamburg FORGALMAZÓ medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstraße 6 D22880 Wedel Tel.: ++49/ 4103 / 8006 348 Fax: ++49/ 4103 / 8006 359 RENDELÉSI CÍM Tel.: ++49/ 4103 / 8006 111 Fax: ++49/ 4103 / 8006 113 430TMBVPU/010708
Chlamydia pneumoniaeiggselisa medac Enzim immunoassay Chlamydia pneumoniae IgG antitestek kimutatására Katalógusszám: 430TMB IN VITRO DIAGNOSZTIKAI HASZNÁLATRA! BEVEZETÉS A Chlamydiae nemzetség Gramnegatív bakteriális patogénekből áll. Van egy obligát intracelluláris életciklusuk a nyálkahártyák felületén, a hámsejtekben, a simaizom sejtekben és a legújabb felismerések szerint a központi idegrendszer bizonyos szövet szerkezeteiben. A Chlamydiák a gazdasejtek nagy energia tartalmú foszfátjaitól függnek, ezért energia paraziták. A Chlamydia nemzetség négy fajból áll: C. pneumoniae, C. trachomatis, C. psittaci, és C. pecorum. A C. pneumoniae és a C. trachomatis obligát humán patogének. A C. psittaci emberre és néhány állatfajra patogén. A C. pecorumot eddig csak állatokból izolálták. A C. pneumoniae fertőzések világszerte előfordulnak. A betegség spektruma az influenzaszerű megbetegedéseken túl magában foglalja az alábbiakat: sinusitis, pharyngitis, bronchitis, krónikus obstruktív tüdőbetegségek, pneumonia, és reaktív arthritis. A C. pneumoniae okozati összefüggésbe hozása az alábbi betegségekkel: fertőző asztma, sarcoidosis, tüdőrák, atherosclerosis, acute myocardial infarction, brain stroke, multiple sclerosis, és az Alzheimer kór késői kifejlődése az aktuális kísérletek területe marad. Grayston és Saikku (1989) szerint, akik először írták le ezeket a fajokat, élete során szinte mindenki megfertőződik és újrafertőződik C. pneumoniaevel. A C.pneumoniae fertőzés gyakran gyenge és/vagy diffúz tünetei a kimutatást megnehezítik; a nem detektált fertőzés komoly következményekkel járó krónikus betegséghez vezethet. A C. pneumoniae fertőzés kimutatására használt módszerek: izoláció sejtkultúrákból, direkt antigén kimutatás, nukleinsav amplifikációs tesztek és szerológia. A sejttenyészetből történő izolálás rendszerint különböző egymást követő passzálást igényel, időigényes, speciális laborokra korlátozódik és csak kevés esetben sikeres. A direct immunfluoreszcens módszert (IFA) és az antigén enzim immunoassayt (EIA) csak szűk körben használják, alacsony érzékenységet és specificitást tulajdonítanak nekik. 430TMBVPU/010708 1
A fajspecifikus antitestek kimutatására a mikroimmunfluoreszcens (MIF) módszert tekintik arany standardnak". A MIF munkaigényes, szubjektív és nagy gyakorlatot igényel. Ezt a teszt rendszert nem standardizálták, a különböző antigének használata, a régi és jelen fertőzéshez alkalmazott eltérő cutoff kritériumok az eredmények jelentős laborok közötti variációját okozzák. A Chlamydia pneumoniaeselisa medac kitben nagytisztaságú és specifikus antigént használtak. Az IgM, IgA és IgG antitestek kimutatása lehetővé teszi a fertőzés állapotának megállapítását és a kezelés utáni nyomonkövetést. A Chlamydia pneumoniaeselisa medac eleget tesz a standardizálási, objektivitási, reprodukálhatósági és automatizálási követelményeknek a rutin laborokban. 430TMBVPU/010708 2
A TESZT ELVE A lemezt nagy tisztaságú C. pneumoniaespecifikus antigénnel vonták be. A mintában levő C. pneumoniaespecifikus antitestek kötődnek az antigénekhez. Peroxidázzal konjugált antihumán IgG antitestek kötődnek az IgG antitestekhez (P = peroxidáz). Inkubálás TMBszubsztráttal (*). A reakciót kénsav hozzáadásával állítjuk le. Az abszorbanciát fotometrikusan mérjük. A teszt előnyei Nagy érzékenység és specificitás. A törhető csíkok lehetővé teszik a teszt gazdaságos felhasználását. 430TMBVPU/010708 3
A KIT TARTALMA Kat. szám: 430TMB 1. MTP Mikroplate: 12 x 8 lyuk, rózsaszínű (kerettel és szárítószerrel, vákuumzárású alumínium zacskóban), törhető, Ualakú, Chlamydia pneumoniae specifikus antigénnel és FCSsel bevonva, felhasználásra kész. 2. CONTROL Negatív kontroll: 1 fiola, 1,5 ml, humán szérum, felhasználásra kész, kék színű, NBCS, fenol, ProClin TM 300 és gentamicinszulfát tartalmú. 3. CONTROL + Pozitív kontroll: 1 fiola, 1,5 ml, humán szérum, felhasználásra kész, kék színű, BSA, fenol, ProClin TM 300 és gentamicinszulfát tartalmú. 4. WB Mosó puffer: 1 flakon, 100 ml PBS/Tween (10x), ph 7,2 7,4, ProClin TM 300 tartalmú. 5. BACDIL Mintahígító: 1 flakon, 110 ml PBS/Tween/NBCS, ph 7,0 7,2, felhasználásra kész, kék színű, ProClin TM 300 tartalmú. 6. CON Konjugátum: 4 fiola, mindegyikben 4,5 ml, kecske antihumán IgG, HRPvel konjugált, felhasználásra kész, zöld színű, BSA, fenol, ProClin TM 300 és gentamicinszulfát tartalmú. 7. TMB TMB szubsztrát: 1 flakon, 10 ml, felhasználásra kész. 8. STOP Leállító oldat: 2 flakon, mindegyikben 11 ml, 0,5 M kénsav (H 2 SO 4 ), felhasználásra kész. 430TMBVPU/010708 4
1. TÁROLÁS ÉS STABILITÁS Anyag/reagens Állapot Tárolás Stabilitás Kit bontatlan 2...8 C lejárati időig Mikroplate bontott 2...8 C 12 hét szárítószeres zacskóban Kontrollok bontott 2...8 C 12 hét Mosó puffer hígított 2...8 C 12 hét Mintahígító bontott 2...8 C 12 hét Konjugátum bontott 2...8 C 12 hét TMB szubsztrát bontott 2...8 C 12 hét Leállító oldat bontott 2...8 C lejárati időig Ne használjuk a reagenseket a lejárati időn túl! 2. SZÜKSÉGES, DE A KITBEN NEM SZÁLLÍTOTT ANYAGOK ÉS REAGENSEK 2.1. Injekció tisztaságú víz (bidesztillált víz). Ioncserélt víz használata zavarhatja az eljárást. 2.2. Állítható mikropipetták. 2.3. Tiszta üveg, vagy műanyag edények a mosó puffer és a minták hígítására. 2.4. Mikroplatek mosására alkalmas mosó (vagyis többcsatornás pipetta, vagy ELISA mosó). 2.5. Inkubátor, 37 C. 2.6. Lemezleolvasó 450 és 620 650 nmes szűrőkkel. 3. A REAGENSEK ELŐKÉSZÍTÉSE Az eljárás megkezdése előtt az összes reagenst szobahőmérsékletűre kell hozni. Számoljuk ki a szükséges lyukakat. 3.1. Mikroplate A szükséges csíkok eltávolítása után a maradékot szorosan zárjuk vissza az alumínium zacskóba, a szárítószerrel együtt. A tárolást és stabilitást ld. 1. pont alatt. 430TMBVPU/010708 5
3.2. Mosó puffer Keverjünk össze egy térfogategység mosó puffer koncentrátumot (10x) kilenc térfogategység bidesztillált vízzel (pl. 50 ml mosó puffer koncentrátumot 450 ml vízzel). 10 ml hígított mosó puffer szükséges 8 lyukhoz. A mosó puffer koncentrátumban esetlegesen jelenlevő kristályok 37 Cra történő melegítéssel és/vagy szobahőmérsékleten történő keveréssel oldhatók fel. A specifikus reagenseket (mikroplate, kontrollok, konjugátum) ne keverjük a különböző gyártási számú kiteknél. Ezzel szemben, a mintahígító, a mosó puffer, a TMBszubsztrát és a leállító reagens általában felcserélhető az összes Chlamydiaés MycoplasmaELISA medac kitben. Más gyártók reagensei nem használhatók. Érvényes és reprodukálható eredmények csak az eljárás pontos követése esetén nyerhetők. 4. MINTÁK 4.1. A kit szérum minták vizsgálatára alkalmas, plazma nem használható. 4.2. A szérumok előkezelése (pl. inaktiválás) nem szükséges. Azonban, a minták ne legyenek baktériumokkal szennyezettek és ne tartalmazzanak vörösvérsejteket. 4.3. A szérumokat 1:50 arányban hígítani kell mintahígítóval. 5.A. AZ ELJÁRÁS MENETE 5.1. Vágjuk el az alumínium zacskót a simítózár felett és vegyük ki a szükséges számú csíkokat (ld. 3.1. pont). A csíkok felhasználásra készek, előmosás nem szükséges. 5.2. Pipettázzunk 50 μl mintahígítót az A1 lyukba, ez lesz a háttér (ld. 6.A.), a következő két lyukba 50 μl negatív kontrollt, az azt követő két lyukba 50 μl pozitív kontrollt, az utána következő lyukakba pedig egyenként 50 μl szérummintát. Ha szükséges, a csíkokat nedves kamrában tarthatjuk 30 percig szobahőmérsékleten a feldolgozás előtt. 430TMBVPU/010708 6
5.3. Inkubáljuk a csíkokat 60 percig (± 5 perc) 37 Con (± 1 C) nedves kamrában, vagy a fedőfóliával lezárva. 5.4. Az inkubáció után mossuk a lyukakat háromszor, lyukanként 200 μl hígított mosó pufferrel. Ügyeljünk arra, hogy az összes lyuk tele legyen. Mosás után óvatosan csapkodjuk a lemezt szűrőpapírra. Ne engedjük a lyukakat kiszáradni! Azonnal dolgozzuk fel! 5.5. Adjunk 50 μl konjugátumot (zöld színű) minden lyukba. 50 µl kjugátumot pipettázzunk a lyukakba, ha manuálisan végezzük a végezzük a vizsgálatot. Kérjük figyeljen: Ha automata készülékkel dolgozunk, 60 μl kjugátumot pipettázzunk minden lyukba, a készülék inkubációs kamrájában előforduló nagyobb párolgás miatt. A teszt automatán való alkalmazhatóságát a kiértékelés során megerősítették. Mindazonáltal javasoljuk, hogy a laborban működő automatával való kompatibilitást ellenőrizzük. 5.6. Inkubáljuk a csíkokat ismét 60 percig (± 5 perc) 37 Con (± 1 C) nedves kamrában, vagy a fedőfóliával lezárva. 5.7. Az inkubáció után ismét mossuk a lyukakat (ld. 5.4. pont). 5.8. Adjunk 50 μl TMB szubsztrátot minden lyukba és inkubáljuk sötétben 30 percig (± 2 perc) 37 Con (± 1 C) nedves kamrában, vagy fedőfóliával lezárva. A pozitív minták kék színűek lesznek. 5.9. Állítsuk le a reakciót 100 μl leállító oldattal minden lyukban. A pozitív minták sárgák lesznek. Leolvasás előtt tisztítsuk meg a lemezek alját és győződjünk meg, hogy nincsenek légbuborékok a lyukakban. A leolvasást a leállító reagens hozzáadása után 15 percen belül el kell végezni. 430TMBVPU/010708 7
5.B. AZ ELJÁRÁS MENETE TÁBLÁZATOSAN Mintahígító Negatív kontroll Pozitív kontroll Minta Háttér (A1) 50 µl Negatív kontroll 50 µl Pozitív kontroll 50 µl Minta 50 µl Inkubálás 60 percig 37 Con, mosás háromszor 200 μl mosó pufferrel Konjugátum 50/60 µl*) 50/60 µl*) 50/60 µl*) 50/60 µl*) Inkubálás 60 percig 37 Con, mosás háromszor 200 μl mosó pufferrel TMBszubsztrát 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl Inkubálás 30 percig 37 Con, sötétben Leállító oldat 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Leolvasás fotométerrel 450 nmen (620 650 nm referencia hullámhossz) *) manuális/automata eljárás (ld. 5.5.) 6.A. AZ EREDMÉNYEK SZÁMOLÁSA (VALIDÁLÁS) Mérjük meg az OD értékeket 450 nmen (620 650 nm referencia hullámhossz). A háttér (A1) OD értéket minden mért ODből vonjuk ki. A háttér OD értéke kisebb legyen, mint 0,100. A negatív kontrollok átlag OD értéke kisebb legyen, mint 0,100. A pozitív kontrollok átlag OD értéke nagyobb legyen, mint 0,800. Cutoff (küszöbérték) = negatív kontrollok átlaga + 0,380 Szürke zóna = Cutoff ± 10 % Ismételjük meg a vizsgálatot, ha az eredmények nem felelnek meg a specifikációnak. 430TMBVPU/010708 8
6.B. AZ EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE 6.B.1. KVALITATÍV Eredmény OD < szürke zóna Cut off ± 10 % OD > szürke zóna Értékelés negatív határérték pozitív 6.B.2. FÉLKVANTITATÍV CutoffIndex: OD minta OD Cutoff Értékelés < 0,9 negatív 0,9 1,1 határérték > 1,1 pozitív A szürke zónába eső mintákat újra kell vizsgálni együtt egy 14 nappal később vett mintával, hogy meg tudjuk határozni a titer változását. Az eredményeket mindig az IgA és IgM, illetve a klinikai adatokkal és egyéb diagnosztikai paraméterekkel együtt kell értékelni. Magas hemoglobin, bilirubin és lipidkoncentráció nem befolyásolja az eredményeket. Keresztreakciót antinukleáris antitestekkel, heterofil antitestekkel, C. psittaci és C. trachomatis antitestekkel bizonyos esetekben nem lehet kizárni. 430TMBVPU/010708 9
6.C. SPECIFIKUS IgG/IgA ÉRTELMEZÉS Lehetséges eredmény IgG IgA + + + + +/ +/ + +/ +/ + Értelmezés 1. IgG és IgA pozitív; fertőzést jelez. További következtetések a tünetek és a titer alakulásától függően. 2. Csak IgG pozitív; régi fertőzést jelez. Klinikai gyanú esetén határozzuk meg a titer négyszeres növekedését két minta között és vizsgáljunk IgAra. 3. IgG pozitív, IgA szürke zóna; lehetséges kezdődő, vagy múló fertőzés. Vizsgáljuk újra az IgAt 10 14 nap múlva. 4. Csak IgG szürke zóna; régi fertőzés nincs kizárva. Klinikai gyanú esetén vizsgáljuk újra IgGre és IgAra 10 14 nap múlva. 5. Csak IgA pozitív; lehetséges korai fertőzés, vagy perzisztáló IgA. Vizsgáljuk újra IgGre és IgAra 10 14 nap múlva. 6. Csak IgA szürke zóna; lehetséges korai fertőzés. Vizsgáljuk újra IgGre és IgAra 10 14 nap múlva. 7. IgG szürke zóna, IgA pozitív; lehetséges korai fertőzés. Vizsgáljuk újra IgGre és IgAra 10 14 nap múlva. 8. IgG és IgA negatív; nincs jele fertőzésnek. Igazolt klinikai gyanú esetén végezzünk direkt antigén vizsgálatot és vizsgáljuk újra IgGre és IgAra 10 14 nap múlva. Megjegyzés: Friss akut Chlamydia fertőzés esetén a szerológiai eredmények lehetnek negatívak, a klinikai tünetek és a pozitív antigén kimutatási eredmények ellenére. Ha a pozitív antigén eredmény szerológiai megerősítése, illetve a nyomon követés szükséges, javasolt a minták 10 14 nap múlva történő újra vizsgálata szerokonverzióra. 430TMBVPU/010708 10
7. A KIT TELJESÍTŐKÉPESSÉGE Az alábbi teljesítőképességi adatokat határoztuk meg a diagnosztikus kiértékelés során. 7.A. ÉRZÉKENYSÉG ÉS FAJLAGOSSÁG Légúti fertőzés tünetei nélküli paciensek szérumait vizsgálták a fajlagosság meghatározására. MIFfel nem mutattak ki C. pneumoniae elleni antitesteket. Légúti fertőzés gyanús betegek szérumait használták az érzékenység vizsgálatára. MIFfel minden szérumban C. pneumoniae antiteseket mutattak ki. Paciens csoport Fajlagosság IgA IgG Paciensek légúti fertőzés nélkül; MIFfel nincs C. pneumoniae antitest. 93% (n=86) 95% (n=42) Paciens csoport Érzékenység IgA IgG Paciensek légúti fertőzéssel; MIFfel minden szérum C. pneumoniae antitestet tartalmazott. 95% (n=74) 99% (n=117) 430TMBVPU/010708 11
7.B. PONTOSSÁG Minta Intraassay variáció Minta Interassay variáció (n = 11) átlag SD CV (%) n átlag OD SD CV (%) OD NC 0,032 0,009 28 21 NC 0,035 0,004 11 BC 0,772 0,038 5 21 BC 0,824 0,073 9 PC 1,990 0,062 3 21 PC 2,133 0,149 7 N 1 1,951 0,098 5 21 N 3 1,655 0,140 8 N 2 0,731 0,030 4 21 N 4 1,027 0,087 8 NC = negatív kontroll; BC = gyenge pozitív kontroll (a kit nem tartalmazza); PC = pozitív kontroll ÁLTALÁNOS KEZELÉSI TANÁCSOK A kereszt szennyeződések elkerülése érdekében ne cseréljük fel az edényeket és a kupakokat. A reagenseket használat után azonnal zárjuk le, a párolgás és a mikrobiológiai szennyeződés elkerülése érdekében. Használat után a reagenseket előírás szerint kell tárolni az eltarthatóság garantálása érdekében. Használat után az összes komponenst az eredeti edényében tároljuk, a más gyártási számú, illetve más gyártók reagenseivel történő keveredés elkerülése érdekében (ld. 3. pont). EGÉSZSÉGI ÉS BIZTONSÁGI INFORMÁCIÓK Vegyük figyelembe a helyi biztonsági és egészségügyi előírásokat. Az emberi eredetű reagenseket megvizsgálták és negatívnak találták HBsAgre, antihiv1/2re és antihcvre. Ennek ellenére, ezeket az anyagokat, illetve az állati eredetű reagenseket potenciálisan fertőzőnek kell tekinteni és minden szükséges előírást be kell tartani. MEGSEMMISÍTÉSI SZEMPONTOK A vegyi anyagok és preparátumok maradékai általánosságban veszélyes hulladéknak tekintendők. Az ilyen hulladékok megsemmisítése a nemzetközi és a helyi törvények és előírások szerint szabályozottak. Vegyük fel a kapcsolatot a helyi hatóságokkal, illetve hulladékkezelő cégekkel, melyek segítséget tudnak nyújtani a veszélyes hulladékok megsemmisítésében. Kibocsátás dátuma: 01.07.2008 430TMBVPU/010708 12
IRODALOM Balin, B.J., Gérard, H.C., Arking, E.J., Appelt, D.M., Branigan, P.J., Abrams, J.T., WhittumHudson, J.A., Hudson, A.P.: Identification and localization of Chlamydia pneumoniae in the Alzheimer s brain. Med. Microbiol. Immunol. 187, 2342 (1998). Christiansen, G., Boesen, T., Hjerno, K., Daugaard, L., Mygind, P., Madsen, A.S., Knudsen, K., Falk, E., Birkelund, S.: Molecular biology of Chlamydia pneumoniae surface proteins and their role in immunopathogenicity. Am. Heart J. 138, 491495 (1999). Danesh, J., Collins, R., Peto, R.: Chronic infections and coronary heart disease: is there a link? Lancet 350, 430436 (1997). Elkind, M.S., Lin, I.F., Grayston, J.T., Sacco, R.L.: Chlamydia pneumoniae and the risk of first ischemic stroke. The Northern Manhattan stroke study. Stroke 31, 15211525 (2000). Gérard, H.C., Schumacher, H.R., ElGabalawy, H., GoldbachManksy, R., Hudson, A.P.: Chlamydia pneumoniae present in the human synovium are viable and metabolically active. Microb. Pathog. 29, 1724 (2000). Grayston, J.T.: Epidemiology of Chlamydia pneumoniae (TWAR). In: Chlamydia Research. Angelika Stary (ed.). Proceedings of the Third Meeting of the European Society for Chlamydia Research, Vienna, Austria, 11.14. September, 211214 (1996). Grayston, J.T., Aldous, M.B., Easton, A., Wang, S.P., Kuo C.C., Campbell, L.A., Altman, J.: Evidence that Chlamydia pneumoniae causes pneumonia and bronchitis. J. Infect. Dis. 168, 12311235 (1993). Gupta, S., Leatham, E.W., Carrington, D., Mendall, M.A., Kaski, J.C., Camm, A.J.: Elevated Chlamydia pneumoniae antibodies, cardiovascular events, and azithromycin in male survivors of myocardial infarction. Circulation 96, 404407 (1997). Gurfinkel, E., Bozovich, G., Daroca, A., Beck, E., Mautner, B.: Randomised trial of roxithromycin in nonqwave coronary syndromes: ROXIS pilot study. Lancet 350, 404407 (1997). Hahn, D.L., Peeling, R.W., Dillon, E., McDonald, R., Saikku, P.: Serologic markers for C. pneumoniae in asthma. Ann. Allergy Asthma Immunol. 84, 227233 (2000). Hunter, S.F., Hafler, D.A.: Ubiquitous pathogens: Links between infection and autoimmunity in MS? Neurology 55, 164165 (2000). Kuo, C. C., Jackson, L.A., Campbell, L.A., Grayston, J.T.: Chlamydia pneumoniae(twar). Clin. Microbiol. Rev. 8, 451461 (1995). LayhSchmitt, G., Bendl, C., Hildt, U., DongSi, T., Jüttler, E., Schnitzler, P., GrondGinsbach, C., Grau, A.J.: Evidence for infection 430TMBVPU/010708 13
with Chlamydia pneumoniae in a subgroup of patients with multiple sclerosis. Ann. Neurol. 47, 652655 (2000). Maass, M., Bartels, C., Engel, P.M., Mamat, U., Sievers, H.H.: Endovascular presence of viable Chlamydia pneumoniae is a common phenomenon in coronary artery disease. J. Am. Coll. Cardiol. 31, 827 832 (1998). Muhlestein, J.B.: The link between Chlamydia pneumoniae and atherosclerosis. Infect. Med. 14, 380382, 392, 426 (1997). Saikku, P.: Chronic Chlamydia pneumoniae infections. In: Chlamydia Research. Angelika Stary (ed.). Proceedings of the Third Meeting of the European Society for Chlamydia Research, Vienna, Austria, 11.14. September. 215218 (1996). Saikku, P., Leinonen, M., Mattila, K., Ekman, M.R., Nieminen, M.S., Mäkela, P.H., Huttunen, J.K., Valtonen, V.: Serological evidence of an association of a novel Chlamydia, TWAR, with chronic coronary heart disease and acute myocardial infarction. Lancet 2, 983986 (1988). Saikku, P., Leinonen, M., Tenkanen, L., Linnanmäki, E., Ekman, M.R., Manninen, V., Manttari, M., Frick, M.H., Huttunen, J.K.: Chronic Chlamydia pneumoniae infection as a risk factor for coronary heart disease in the Helsinki Heart Study. Ann. Intern. Med. 116, 272278 (1992). Samra, Z., Soffer, Y.: IgA antichlamydial antibodies as a diagnostic tool for monitoring of active chlamydial infection. Eur. J. Epidemiol. 8, 882884 (1992). Schumacher, H.R.: Chlamydial Arthritis. In: Chlamydia Research. Pekka Saikku (ed.). Proceedings of the 4 th Meeting of the European Society for Chlamydia Research, Helsinki, Finland, 20.23. August. 229 (2000). Sriram, S., Stratton, C.W., Yao, S.: Chlamydia pneumoniae infection in the central nervous system in multiple sclerosis. Ann. Neurol. 46, 6 14 (1999). Stille, W., JustNübling, G.: Argumente für eine AntibiotikaTherapie der Arteriosklerose. Chemotherapie Journal 6, 15 (1997). 430TMBVPU/010708 14