A JÁRULÉKOS OPTICUS MAGOK: NUCLEUS BASALIS TRACTUS OPTICI (nbor) ÉS NUCLEUS LENTIFORMIS MESENCEPHALI MAGNOCELLULARIS (nlmmc) SZERKEZETE CSIRKÉBEN Doktori értekezés Dr. Zayats Natalya Semmelweis Egyetem Szentágothai János Idegtudományi Doktori Iskola 7pPDYH]HW Dr. Tömböl Teréz, Professor Emeritus Hivatalos bírálok: Dr. Lázár Gyula, egyetemi tanár Dr. Matesz Klára, egyetemi tanár Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Vigh Béla, Professor Emeritus Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Halasy Katalin, egyetemi tanár Dr. Takács József,WXGRPiQ\RVIPXQNDWiUV Budapest, 2006.
TARTALOMJEGYZÉK: A DOLGOZATBAN HASZNÁLT RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE.. 3 1. BEVEZETÉS.. 6 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS...... 9 $ NXWDWiVL WHU OHWHW N ]YHWOHQ O pulqw LURGDORP OHJIRQWRVDEE HUHGPpQ\HL D nucleus basalis tractus optici (nbor) funkcionális morfológiájáról...... 9 2.2 $ NXWDWiVL WHU OHWHW N ]YHWOHQ O pulqw LURGDORP OHJIRQWRVDEE HUHGPpQ\HL D nucleus lentiformis mesencephali magnocellularis (nlmmc) funkcionális morfológiájáról...... 12 2.3. A nucleus basalis tractus optici-re (nbor) és nucleus lentiformis mesencephali magnocellularis-ra (nlmmc) vonatkozó fiziológiai eredmények rövid összegzése. 13 3. Ce/.,7%=e6(.. 15 4. MÓDSZEREK. 17 4.1. Kísérleti állatok... 17 4.2. Altatás és perfúziós eljárás. 17 4.3. Rapid Golgi impregnáció... 18 4.4. EM Golgi impregnáció.......... 18 4.5. Prae-embedding GABA immunhisztokémia. 19 4.6. Post-embedding GABA-gold immunhisztokémia........ 20 4.7. Anterograd pályakövetéses vizsgálatok biotinilált dextran aminnal (BDA) 20 5. EREDMÉNYEK... 22 5.1. $QXFOHXVEDVDOLVWUDFWXVRSWLFLQ%25EHOVV]HUNH]HWH.... 22 5.1.1. $ QXFOHXV EDVDOLV WUDFWXV RSWLFL Q%25 EHOV V]HUNH]HWpW DODNtWy22 neuronális elemek jellemzése Golgi preparátumokon. 5.1.2. Projekciós neuronok jellemzése Golgi preparátumok alapján.. 23 5.1.3. Local circuit neuronok jellemzése Golgi preparátumok alapján... 24 5.1.4. GABA immunhisztokémia a nucleus basalis tractus optici-ben (nbor) 25 1
5.1.5. Az opticus rostok jelölése biotinilált dextran aminnal (BDA)... 26 5.1.6. Elektronmikroszkópos megfigyelések biotinilált dextran aminnal (BDA) és GABA immunogold-dal jelölt preparátumokon... 27 5.2. A nucleus lentiformis mesenfhskdol PDJQRFHOOXODULV Q/0PF EHOV szerkezete... 29 5.2.1. A nucleus lentiformis mesencephali magnocellularis (nlmmc) neuronális szerkezete Golgi preparátumokon....... 29 5.2.2. Post-embedding GABA immunhisztokémia eredménye a nucleus lentiformis mesencephali magnocellularis-ban (nlmmc).. 32 5.2.3. Biotinilált dextran aminnal (BDA) jelzett opticus rostok fénymikroszkópos vizsgálata nucleus lentiformis mesencephali magnocellularis-ban (nlmmc)... 32 5.2.4. Elektronmikroszkópos megfigyelések a biotinilált dextran aminnal (BDA) jelzett opticus rostok kapcsolatairól kombinálva az eljárást GABA-gold immunhisztokémiával a nucleus lentiformis mesencephali magnocellularis-ban (nlmmc)... 33 6. A KUTATÁSI EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE........ 35 6.1. A nucleus basalis tractus opticiben (nbor) kapott eredmények összefoglalása 37 6.2. A nucleus lentiformis mesencephali magnocellularis-ban (nlmmc) talált eredmények összefoglalása...... 39 7. KÖVETKEZTETÉSEK.. 42 8. MAGYAR ÉS ANGOL NYELV%g66=()2*/$/Ï.... 44 9. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS... 46 10. ÁBRÁK........ 48 11. IRODALOM...... 80 12. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE.... 90 2
A DOLGOZATBAN HASZNÁLT RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE: 5-HT: serotonin ABC: avidin-biotin complex AOS: járulékos opticus rendszer (accessory optic system) ax: axon0 BCP: brachium conjunctivum cerebellopetale BDA: biotinilált dextran amin BOR: basalis opticus köteg (basal optic root) CCK: cholecystokinin d: dendrit da: dendraxon DAB: 3,3 -diamino-benzidin DGC: kihelyezett ganglion sejtek (Dogiel sejtek) dp: dendrit nyúlvány dt: dendrit terminális f: rost GABA: gamma-amino-vajsav (gamma-amino butyric acid) GCL: stratum ganglionare retinae (ganglionar cell layer) Glu: glutamat H 2 O 2 : hidrogén peroxid HRP: torma-peroxidáz (horse radish peroxidase) INL: stratum granulosum internum retinae (inner nuclear layer) IPL: stratum plexiforme internum retinae (inner plexifor layer) IS: nucleus interstitialis (Cajal) L: lateralis 3
L-ENK: leucin-enkephalin ln: óriás projekciós neuron M: medialis mf: myelinhüvelyes rost mln: nagy projekciós neuron nbor: nucleus basalis tractus optici nbord: nucleus basalis tractus optici, pars dorsalis nborl: nucleus basalis tractus optici, pars lateralis NGS: normál kecskeszérum nem: nucleus ectomamillaris nlmmc: nucleus lentiformis mesencephali magnocellularis nlmpc: nucleus lentiformis mesencephali parvocellularis NOT: nucleus tractus optici NPY: neuropeptid Y nrot: nucleus rotundus nss: nucleus superficialis synencephali NT: neurotensin OF, of: opticus rost OKN: optokinetikus nystagmus OMdl: nucleus nervi oculomotorii, pars dorsolateralis OMv: nucleus nervi oculomotorii, pars ventralis ONL: stratum granulosum externum retinae (outer nuclear layer) OPL: stratum plexiforme externum retinae (outer plexiform layer) OT, ot: opticus terminális PB: foszfát puffer 4
PBS: foszfát pufferes sóoldat Pfl: paraflocculus prt d: preterminális dendrit RA: stratum neurofibrarum retinae (retinal axons) RL: stratum neuroepitheliale retinae (receptor layer) S: soma SP: substance P t: terminális TB: tris puffer t fs: lapos vesiculát tartalmazó terminális t ps: pleomorph vesiculát tartalmazó terminális TrO: tractus opticus V: ventralis VIP: vasoactiv intestinal polipeptid 5
1. BEVEZETÉS A folyamatosan változó környezet, vagy helyváltoztatás, illetve a fej és a nyak mozgásai ellenére a tekintet-u] PR]JiVRN PHJWDUWMiN D UHWLnára vetült képet, azaz fixáló tekintete van a madaraknak és a legtöbb gerinces állatnak. Két-két viselkedési válasz stabilizálja mind a szem, mind a fej mozgását: az optokineticus és a vestibuloocularis reflex a szemét, a fej stabilizálását pedig az optomotor és a vestibulocollicularis reflexek végzik. Bár a négy, tekintet stabilizáló reflex laboratóriumi körülmények között kísérletesen elválasztható egymástól, természetes körülmények között nem léteznek egymástól függetlenül. Valahányszor a test vagy a vizuális környezet mozdul, a fej és a szem kompenzatórikus -NLHJ\HQOtWNLHJpV]tW- mozgása lép közbe, aminek az eredménye a retinán keletkezett kép stabilizálása. A fej és a nyak NRPSHQ]DWyULNXVPR]JiVD N O Q VHQ MyO pu]pnhokhw D Ji]Oy PDGDUDN MHOOHJ]etes fejnyak mozgó tartásán, vadászat közben. A tekintetet, a retinán keletkezett képet megtartó, optomotor és az optokineticus válaszokban a látórendszer speciális központjai, - a járulékos opticus rendszer (AOS) -, vesznek részt, és ezekhez csatlakoznak a vestibulo-ocularis kapcsolatok, reflexek. A MiUXOpNRV RSWLFXV N ]SRQWRN pv SiO\iN NHYpVEp LVPHUWHN PLQW D] HOVGOHJHV pv másodlagos opticus pályák. Az optokineticus, optomotor, vestibulo-ocularis reflexeket kialakító rendszerben UpV]WYHY UHWLQDOLV rostok relé állomásai az úgynevezett accessorius opticus magok a diencephalon és mesencephalon határán találhatók a tractus opticushoz csatlakozva. Az DFFHVVRULXV RSWLFXV UHQGV]HUQHN QHYH]HWW OiWy UHQGV]HUL N ]SRQWRN NpVEE YiOWDN LVPHUWWp PLQW D] HOVGOHges (retino-geniculo-corticalis) vagy a másodlagos (retinocolliculo-whjphqwdolvyl]xiolvsio\ineiuplqghpov NEHQPLQGSHGLJPDGDUDNEDQ K OONEHQ NpWpOW&HNEHQ pv KDODNEDQ D]D] D JHULQFHVHNEHQ PHJWDOiOKDWyN %UHFKD pv PWVDL$]HOVWDQXOPiQ\ok anatómiai, hisztológiai vizsgálatok voltak. Gudden LVPHUWHWHWW HOVQHN HJ\ RSWLFXV URVWN WHJHW DPHO\ HPOV NEHQ pv emberben a tractus opticus ventralis felszínén harántul húzódik. Az elkülönült retinalis rostok, a meso-diencephalicus kapcsroygiv HOWW YiOQDN OH D WUDFWXV RSWLFXVEyO $] DFFHVVRULXVRSWLFXVPDJRNDWpVNDSFVRODWDLNDWHPOV NEHQ*LOOLODQ*LROOL 6
1963, 1965), Hayhow (1959, 1966), Hayhow és munkatársai (1960), Hoffmann és munkatársai (1976), Hoffmann és Shoppmann (1975, 1981), valamint Winfield és munkatársai (1978) vizsgáltak. Nyúlban és macskában az accessorius opticus rostok a QXFOHXV WHUPLQDOLV PHGLDOLV ODWHUDOLV pv GRUVDOLV PDJMiEDQ YpJ]GQHN PtJ IHPOV NEHQ D QXFOHXV WUDQVSHGXQFXODULVEDQ DPHO\ D Q\~O PHGLDOis terminális PDJMiKR] KDVRQOy HOKHO\H]NHGpV&. ]OHPpQ\HN MHOHQWHN PHJ D] HPOV N Q YpJ]HWW IL]LROyJLDL NtVpUOHWHN HUHGPpQ\HLEO LV 0DUJ :DOOH\ &ROOHZLMQ 1975; Maekawa és Kimura 1981). A járulékos opticus magok morfológiai vizsgálata epov NEHQ D QXFOHL terminalis medialis, lateralis illetve dorsalis elkülönítését eredményezte. Ezek a magok a pedunculus cerebri lateralis, illetve medialis végéhez csatlakozó kis sejtcsoportok, DPHO\HNHQDWUDFWXVRSWLFXVEDVDOLVDFFHVVRULXVURVWMDLYpJ]GQHN$]HOVWDOiOJDWiVRN pv D IL]LROyJLDL HUHGPpQ\HN XWiQ PHJiOODStWRWWiN KRJ\ HPOV NEHQ Q\~O PDMRP D terminalis magok az ellenoldalon a szemmozgások optokineticus reflexeinek kialakításában vesznek részt (Walley 1967; Westheimer és Blair 1974). Maekawa és Simpson (1972) a vestibulo-cerebellaris kapcsolatokat tanulmányozták, és bebizonyították, hogy az accessorius opticus magok közvetlen kapcsolatban állnak a FHUHEHOOXPPDO3DWNiQ\EDQ D]DFFHVVRULXVRSWLFXVPDJRNHJ\ WWP&N GpVpWDWHVWIHM elmozdulásával illetve a szemmozgásokkal mutatták ki Simpson és munkatársai (1978, 1979). Madarakban a járulékos optikus magok, a nuclei accessorii tractus optici kutatása, különösen gyakori területe lett - IOHJ JDODPEEDQ pv FVLUNpEHQ - az opticus rendszer tanulmányozásának. Békában Lázár (1973), galambban Fite és munkatársai (1977, 1979) illetve Fite (1985) bizonyították az accessorius magok részvételét az optomotor válaszokban és az optokinetikus nystagmusban. Burns és Wallman (1981), valamint Morgan és Frost (1981) az egyes sejteket tanulmányozva az AOS-ban megállapították azok hatását az elmozdulás irányára, sebességére, és megfigyelték, hogy folyamatos stimulálásukra sem alakul ki adaptáció. 0DGiUEDQ D] DFFHVVRULXV RSWLFXV PDJRN YL]VJiODWD D] HPOV N QXFOHXV WHUPLQiOLViYDOW UWpQ VV]HKDVRQOtWyWDQXOPiQ\R]iVVDOLQGXOW0DUEXUJ5HQGDKO 1924; Huber és Crosby 1929; Kuhlenbeck 1939; Ariens-Kappers és mtsai 1936; Cowan és mtsai 1961; RepéranW $] $26 UHWLQDOLV HUHGHW& UHQGNtY O YDVWDJ iwppum& 7
RSWLFXVURVWMDLNLHPHONHGHQYDVWDJN WHJHWNpSH]QHN%25DPHO\DQXFOHXVEDVDOLV tractus optici-ehq Q%25 YpJ]GLN &RZDQ pv PWVDL 0F.HQQD pv :DOOPDQ 1985). Az AOS-EDQ YpJ]G RSWLFXV Uostok pontos eredését a retinában Karten és munkatársai (1977) demonstrálták. A vastag opticus rostok az úgynevezett kihelyezett JDQJOLRQVHMWHNEOHUHGQHNDPHO\HNDVWUDWXPSOH[LIRUPHLQWHUQXPN OVUpV]pEHQD EHOVJUDQXOiULVUpWHJKDWiUiQWDOiOKDWyNA kihelyezett ganglion sejteket Dogiel (1891, 1895) és Ramon y Cajal (1893) írták le. $ MiUXOpNRV RSWLFXV PDJRN HIIHUHQV SURMHNFLyL N O QE ] VV]HN WWHWpVHNHW hoznak létre. Az AOS sejtjeinek az összeköttetését az oculomotorius komplexummal HOV] U +XEHU és Crosby (1929), Shanklin (1933), majd Herrick (1948) tették közzé. ÒMDEE WDQXOPiQ\RN %UHFKD pv PWVDL PHJHUVtWHWWpN D NRUiEEL PHJILJ\HOpVHNHW D]RFXORPRWRUYpJ]GpVHNUO%UHFKDpV.DUWHQ$FHUHEHOOXPPDOpVD]DJ\W U]V nevezetes magjaival, az oliva inferiorral és a vestibularis magokkal az AOS QHXURQMDLQDNMHOHQWV VV]HN WWHWpV NYDQ%UDXWK%UHFKDpVPWVDL%UHFKD és Karten 1979). Már Ramon (1898) felismert bizonyos összeköttetést a kétoldali járulékos opticus magok között, ezek pv KDVRQOy MHOOHJ& NDSFVRODWRN OHKHWVpJH bizonyítást nyert több járulékos mag esetében is. $] $26 D NXWDWRWW JHULQFHVHN N O QE ] RV]WiO\DLEDQ KDODNWyO D] HPOV NLJ PHJWDOiOKDWy $ PDGDUDN RV]WiO\iEDQ NpW PDJMD IHOHOV D V]HPPR]JiVRNKR] kapcsolódó, a rewlqdolv NpSHW U J]tW PHJWDUWy UHIOH[HNpUW D QXFOHXV EDVDOLV WUDFWXV optici (nbor) vagy nucleus ectomamillaris (nem), és a nucleus lentiformis mesencephali magnocellularis (nlmmc) vagy pretectalis nucleus superficialis synencephali (nss). 8
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS $NXWDWiVLWHU OHWHWN ]YHWOHQ OpULQWLURGDORPOHJIRQWRVDEEHUHGPpQ\HL a nucleus basalis tractus optici (nbor) funkcionális morfológiájáról A nbor a diencephalon ventralis felszínén, a tractus opticus medialis széléhez csatlakozik (1. ábra). Brecha és munkatársai (1980) megfigyelései alapján a nbor egy magkomlexumból áll: nbor-ból, nbor dorsalis-ból (nbord) és nbor lateralis-ból (nborl) (2. ábra). Ez utóbbi lateralis keskeny nyúlványával kissé a tractus opticus fölé kanyarodik.$q%25myohon O Q ODN UQ\H]HWpWOpVH]WDPDJN U OYpNRQ\UpWHJHW NpSH] URVWN WHJ WHV] OHKHWYp 5RVWUR-caudalis irányban, a diencephalon caudalis részében helyezkedik el az ovális alakú, a kutatások során több elnevezéssel szerepelt accessorius opticus mag, amely végül is a nucleus terminalis medialis elnevezést kapta HPOV NEHQ 5HW]LXV *LOOLODQ +D\KRZ pv PWVDL *LROOL Pasik és mtsai 1973; Tigges és mtsai 1977). Madarakban (Ramon 1898; Ariens-Kappers és mtsai 1936; CowDQpVPWVDLK OONEHQ%XWOHUpV1RUWKFXWW5HLQHUpV.DUWHQNpWpOW&HNEHQ+HUULFN5LVVpVPWVDL/i]iUpVKDODNEDQ (Cambell és Ebbesson 1969; Finger és Karten 1978) pedig nucleus basalis tractus (radicis) optici (nbor) elnevezéssel jelölték (Marburg 1903; Ariens-Kappers és mtsai 1936). Meg kell jegyeznünk, hogy a nucleus basalis tractus opticit gyakran nevezik még nucleus ectomamillarisnak is. 0DGDUDNEDQMHOHQWVN WHJDUHWLQDOLVD[RQRNEyO VV]HWHYGEDVDOLVDFFHVVRULus RSWLFXVURVWRNQ\DOiEMD%25DPHO\D]DFFHVVRULXVPDJEDQYpJ]GLN$N WHJHWQDJ\ iwppum&urvwrndonrwmin&rzdqpvpwvdl.duwhqpvpxqndwiuvdlohtuwin KRJ\ D URVWN WHJ D UHWLQD NLKHO\H]HWW JDQJOLRQ VHMWMHLEO HUHG pv D JDODPE MiUXOpNRV opticus rendszerének a magjában, a nbor-edq YpJ]GLN &VLUNpEHQ KDVRQOy VV]HN WWHWpVW 5HLQHU pv PXQNDWiUVDL WDOiOWDN $ PDGDUDN UHWLQiMiEDQ OpY kihelyezett ganglion sejteket Dogiel (1891, 1895), majd Ramon y Cajal (1893) ismertették. Ezek a gangllrqvhmwhnqdj\jd]gdjrqhoijd]yghqgulw&qhxurqrndvwudwxp SOH[LIRUPHLQWHUQXPN OVUpV]pEHQ$PHJILJ\HOpVHNV]HULQWIOHJDUHWLQDSHULIpULiMiQ KHO\H]NHGQHNHOPtJDJDODPEIRYHDMiEDQpVD]pOHVOiWiVKHO\pQUHGILHOGPH]NHYpV 9
kihelyezett ganglion sejt található (Karten és mtsai 1977). A nbor-ba projiciáló kihelyezett ganglion sejtek substance P (SP), cholecystokinin (CCK) és glutamat (Glu) tartalmúak (Britto és mtsai 1989; Britto és Hamassaki 1991; Pires és Britto 1997). Elektronmikroszkópos megilj\hopvlvel]rq\twrwwdrswlfxvurvwrnypj]gpvpwdq%25- ban (Rio 1979). A nagy, kerek synapticus vesiculat tartalmazó presynapticus WHUPLQiOLVRNIOHJGHQGULWHNHQYpJ]GQHNpVDV]LPPHWULNXVV\QDSVLVRNDWKR]QDNOpWUH A nbor összeköttetésben áll az ellenoldali nbor-ral és az azonos oldali nlmmc-vel (Gioanni és mtsai 1983). 6]iPRV NXWDWy IRJODONR]RWW D] $26 PDJMDLQDN VV]HN WWHWpVHLYHO pv MHOHQWV összeköttetést találtak köztük és a szem mozgásait irányító motoros magok (Huber és Crosby 1929; Shanklin 1933; Herrick 1948; Shute és Levis 1967; Graybiel és Hartweig 1974; Gacek 1977; Brecha és mtsai 1980), a vestibularis magok és az oliva inferior (Freedmann és mtsai 1977; Brecha és Karten 1978 a, b; Reiner és Karten 1978) valamint a vestibulo-cerebellum között (Carpenter és mtsai 1970, 1972; Kuypers és Maisky 1975; Brauth 1977; Brecha és mtsai 1977, 1980; Clarke 1977; Finger és Karten 1978; Fukushima és mtsai 1978; Reiner és Karten 1978; Winfield és mtsai 1978; Brecha és Karten 1979). Az efferens kapcsolatok kö] WW NLHPHONHG V]HUHSH YDQ D] RFXORPRWRULXV PDJRNNDO PHJOpY VV]HN WWHWpVQHN DPHO\HW V]iPRV NXWDWy YL]VJiOW PDGDUDNEDQ K OONEHQNpWpOW&HNEHQ6KDQNOLQ$OWPDQpV&DUSHQWHU&DUSHQWHUpVPWVDL &DUSHQWHU /i]iu pv HPOV NEHn (Garey és mtsai 1968; Garey és Powell 1968; Graybiel 1974; Swanson és mtsai 1974; Drager és Hubel 1976; Künzle és $FNHUW (GZDUGV pv +HQNHO 0HJOHS HUHGPpQ\ YROW D] HIIHUHQVHN kutatásában a közvetlen összeköttetés kimutatása galambban a nbor és az oculomotorius magok között (Brecha és mtsai 1980). A nuclei nervi oculomotorii négy PDJEyOiOO$OHJGRUVDOLVDEEDN ]psyrqdowyonlvvpodwhudolvhokho\h]nhgpv&d:hvwskdo- Edinger, parasympathicus motoros mag. A nucleus dorsalis medialis és lateralis egymás PHOOHWW D] HOEELWO YHQWUDOLV KHO\]HWEHQ WDOiOKDWyN NLVHEE PpUHW& PDJRN $] oculomotorius magok között a legnagyobb a nucleus ventralis az aquaeductustól ventralis helyzetben, a középvonal mellett helyezkedik el. A nbor-ba injiciált triciált leuflq pv SUROLQ NHYHUpNH XWiQ HUVMHO OpVWWDOiOWDN D] D]RQRVROGDOLYHQWUDOLV pvd] ellenoldali dorso-lateralis oculomotoros magban (Brecha és mtsai 1980) (3. ábra). Nem 10
találtak jelzést az ellenoldali dorso-medialis és a Westphal-Edinger magokban. Jelzés volt mind az azonos, mind az ellenoldali trochlearis magokban, az utóbbi jelzése gyengébb volt, mint az oculomotorius magokban. A nucleus nervi abducentis nem MHO OG WW$]RFXORPRWRULXVpVWURFKOHDULVPDJRNEDQDMHO]HWWV]HPFVpNN ]YHWOHQ OD soma közelében és a proximalis dendrit szakaszokon képeztek nagyobb csoportokat. Brecha és munkatársai (1980) feltételezték, hogy az afferens terminálisok ezeken a helyeken képeznek kapcsolatot a neuronokkal. Az egyik oldali nbor-ba történt tormaperoxidáz (HRP) beadivd XWiQ UHWURJUiG HUVHQ MHO OW WHUPLQiOLVRNDW WDOiOWDN D] oculomotorius magokban, és kevésbé jelölt rostkötegeket a trochlearis mindkét oldali PDJMiEDQ(UWHOMHVMHO OpVYROWDQXFOHXVQHUYLDEGXFHQWLVEHQpVDODWHUDOLVYHVWLEXODULV magban (Brecha és Karten 1978 a, b). Továbbá projekciót találtak az ellenoldali nborban és az azonos oldali nlmmc-ben, valamint mindkét oldalon a nucleus interstitialisban (Cajal). $ Q%25 NDSFVRODWDL N ] WW MHOHQWV D YHVWLEXOR-cerebellummal fennálló összeköttetés. MadarakbaQ NLHPHONHG YL]XiOLV NDSFVRODWRW ILJ\HOWHN PHJ morfológusok és fiziológusok a kisagy hátsó lebenyével és a vestibulo-cerebellummal (Whitlock 1952; Clarke 1973, 1974, 1976, 1977; Brauth és Karten 1975; Brauth 1977; Brecha és mtsai 1977; Brecha és Karten 1979). Clarke (1974) fiziológiai kísérlettel EL]RQ\tWRWWD D YL]XiOLV UHQGV]HUEO V]iUPD]y PRKDURVW-MHOOHJ& YpJ]GpVHN MHOHQOpWpW D cerebellumban. Brecha és munkatársai (1980) a nbor-eyo HUHG URVWRN YpJ]GpVpW találták a hátsó lebenyben és mindkét oldalon a folia IX c,d-ben (3. ábra). (]HNUOD rostokról feltételezték, hogy moharost-mhoohj& YpJ]GpVVHO NDSFVROyGQDN D szemcsesejtek dendritjeihez. Ez a kapcsolat hozzájárul a szem és nyak mozgásainak kontrolljához, a vestibulo-ocularis és vestibulo-spinalis reflexekhez (Ito és mtsai 1973, 1974; Takemori és Cohen 1974 a, b; Hassul és mtsai 1976). A mag immunhisztokémiai vizsgálata során substance P (SP), cholecystokinin (CCK), glutamat (Glu), serotonin (5-HT), neuropeptid Y (NPY) neurotensin (NT), leucin-enkephalin (L-ENK) és vasoactiv intestinal polipeptid (VIP) jelenlétét mutatták ki (Britto és mtsai 1989; Székely és mtsai 1992; Toledo és mtsai 1995; Pires és Britto 1997). 11
$NXWDWiVLWHU OHWHWN ]YHWOHQ OpULQWLURGDORPOHJIRQWRVDEEHUHGPpQ\HLD nucleus lentiformis mesencephali magnocellularis (nlmmc) funkcionális morfológiájáról A nlmmc a diencephalon és mesencephalon határán, a pretectum területén, lateralisan találkdwy PDJ DPHO\ NHYpVEpL]ROiOKDWy DN UQ\H]HWpWO PLQW D Q%25$ mesodiencephalicus régióban a tectum opticum (TO) szürke állományától és a nucleus lentiformis mesencephali parvocellularistól (nlmpc) medialisan, a nucleus rotundustól (nrot) lateralisan helyezkedik el (Ehrlich és Mark 1984; Gottlieb és McKenna 1986). (4. ábra) A Klüver-%DUUHUDPyGV]HUUHOYLV]RQ\ODJMyOIHVWGPDJVHMWMHLWDOX[RU-fastblue-YDOIHVWHWWDPDJKR]IXWyP\HOLQK YHO\HVRSWLFXVURVWRNN O QtWLNHODN UQ\H]HWWO (Gottlieb és McKenna 1986). Az opticus rostok ventralisan lépnek be a diencephalon és mesencephalon határán, dorsalis irányba húzódnak, és átfutva a határterületen többékevésbé körülhatárolják a magot. Nissl festéssel két sejttípust különítettek el a nlmmc-ben, nagy és kis sejteket, de további analízissel Gottlieb és McKenna (1986) arra a következtetésre jutottak, hogy D NLV VHMWHNQHN W EE FVRSRUWMD IRUGXO HO D PDJEDQ (OHNWURQPLNURV]NySRV PHJILJ\HOpVHLNLVDUUDPXWDWWDNKRJ\DNLVVHMWHNHOIRUGXOiVDMyYDOJ\DNRULEEmint a nagy sejteké. Fénymikroszkópos méréseik szerint a nagy neuronok 25x30 µm, a kis neuronok 13x9 µm nagyságúak, és mindkét neuron ovális alakú. Elektronmikroszkóposan a neuropilben a kerek vesiculat tartalmazó, aszimmetrikus synapsisokat kialakító termlqiolvrndw5whuplqiolvuhwlqdolvhuhghw&qhnwduwminplyhod nervus opticus átvágása után degenerálódtak és torma-peroxidáz (HRP) szembe történt EHDGiVD XWiQ MHO OGWHN *RWWOLHE pvpwvdl $ QHXURSLOEHQ WDOiOW ODSRV YHVLFXODW tartalmazó terminálisok (F terminális) szimmetrikus synapsisokat létesítettek, synapsisaiknak nagy százaléka axo-somaticus volt. Kevés axo-dendriticus synapsis is HOIRUGXOW $Q/0PFIDIIHUHQWiFLyMiWDUHWLQDOLVURVWRNNpSH]LN5HSpUDQW(KUOLFK és Mark 1984; Gottlieb és mtsai 1984; Bodnarenko és mtsai 1985; Gamlin és Cohen 7RYiEELMHOHQWVQDJ\ViJ~DIIHUHQVURVWN WHJpUNH]LNDPDJEDDYL]XiOLV:XOVWból is (Karten és mtsai 1973; Miceli és mtsai 1979, 1985; Bodnarenko és McKenna (]HNUODURVWRNUyOD] D YpOemény alakult ki, hogy gátló/moduláló feladatokat 12
hajtanak végre a nlmmc-ben (McKenna és Wallman 1981, 1985). Az azonos oldali nbor-ból kisebb afferens rostköteg éri el a nlmmc-t (Brecha és mtsai 1980; Wylie 2001), továbbá összeköttetése van a tectum opticummal és az ellenoldali nlmmc-vel (Hunt és Künzle 1976; Brecha 1978). A nlmmc efferens kapcsolatai a cerebellummal (vestibulocerebellum és folia VI, VII, VIII), nucleus pontis lateralissal és az oliva LQIHULRUUDO MHOHQWVHN D V]HPPR]JDWy PRWRURV PDJRNNDO és a vestibularis magokkal viszont nincs összeköttetése (Clarke 1977; Brecha és mtsai 1980; McKenna és Wallman 1985). Ezen kívül a nlmmc küld rostokat a tectum opticumba és az ellenoldali nborba. A cerebellummal való összeköttetés lehet direkt, és indirekt a nuclei pontison és az oliva inferioron keresztül. A direkt összeköttetés esetében a nlmmc efferens rostjai feltételezetten moharost terminálisokkal kapcsolódnak a cerebellum szemcsesejtjeinek NDURPV]HU&HQ YpJ]G GHQGULWMHLKH] $] LQGLUHNW VV]HN WWHWpVHVHWpEHQ YDOyV]tQ&OHJ ROLYDULV HUHGHW& URVWRN N~V]yURVWRNNDO YpJ]GQHN D3XUNLQMHQHXURQRNRQ $ Q/0PF IOHJ D] ROLYD PHGLDOLV FROXPQiMD FDXGDOLV UpV]pEH D]RQRV ROGDOUD D Q%25 SHGLJ D] oliva medialis columnája rostralis részébe, mindkét oldalra projiciál. A nbor ellenoldali összeköttetése nagyon diszkrét. A nlmmc-qhnd]hoohqrogdol/0pfpdjjdojiwoivwhuhgppq\h] VV]HN WWHWpVH van, hasonlóan a nbor-hoz, viszont az azonos oldali nbor-udovhunhqwndsfvrodwdioo fenn (Wylie 2001). 2.3. A nucleus basalis tractus optici-re (nbor) és nucleus lentiformis mesencephali magnocellularis-ra (nlmmc) vonatkozó fiziológiai eredmények rövid összegzése $ MiUXOpNRV RSWLFXV PDJRN DODSYHW IHODGDWD D] RSWRNLQHWLNXV Q\VWDJPXV generálása, amely a retinán stabilizálja a látott képet a szem kompenzáló mozgásaival. A kép rögzítése egy lassú fázisú (tapogató) és egy gyors beállító mozgásból (gyors Ii]LVWHYGLN VV]H$MiUXOpNRVRSWLFXVPDJRNOp]LyMDXWiQD]RSWRNLQHWLFXVQ\VWDJPXV komoly sérülését tapasztalták békában (Montgomery és mtsai 1982; Lázár és mtsai 1983), galambban és csirkében (Frost és mtsai 1980; McKenna és Wallman 1981). %pniedq D Q%25 PLQGNpW ROGDOL Op]LyMD XWiQ WHOMHVHQ HOW&QW D YHUWLNiOLV Q\VWDJPXV 13
viszont egyoldali nbor lézió után egyirányú kiesését tapasztalták (Lázár és mtsai *DODPEEDQ pv FVLUNpEHQ YpJ]HWW NtVpUOHWHNEHQ HOWpU HUHGPpQ\W NDSWDN DPLW egy-vhmw HOYH]HWpVVHO LV EL]RQ\tWRWWDN (]HNEO D YL]VJiODWRNEyO NLGHU OW KRJ\ D FVLUNpEHQ D QDJ\ UHFHSWtY PH]YHO UHQGHONH] Q%25 VHMWHN D] ~J\QHvezett irány- IHOHOVVHMWHNiOWDOiEDQDYHUWLNiOLVHOPR]GXOiVpUWIHOHOVHN%XUQVpV:DOOPDQQ Rey és mtsai 1982). A galamb nbor-miedq OpY VHMWHN SHGLJ D Q\VWDJPXVKR] NDSFVROyGyULWPLNXVDNWLYLWiVpUWIHOHOVHN)URVW pvpwvdl%ulwwrpvpwvdl981; 0RUJDQ pv )URVW $ Q/0PF IHOHOV D KRUL]RQWiOLV RSWRNLQHWLFXV Q\VWDJPXV létrehozásáért. A mag léziója után szinte teljesen kiesik a temporo-nasalis irányban J\RUVIi]LVLUiQ\W UWpQHOPR]GXOiVpVUHGXNiOyGLNQDVR-temporalis irányban (lassú fázis irány) a horizontális nystagmus. Ugyanezen lézió esetén az azonos oldali szem stimulálása növeli a lassú fázist temporo-nasalis irányban, a naso-temporalis elmozdulás is kissé növekedik. Ez utóbbi jelenséget homolateralis synergizmusnak nevezik, amely a homolateralis nbor és nlmmc között jön létre. Gioanni és munkatársai (1983) azt is mutatták ki, hogy a nbor sejtjeinek egy része nem a vertikális, hanem a horizontális Q\VWDJPXVEDQ YHV] UpV]W ÒJ\ WDOiOWiN KRJ\ D Q%25 NLHJpV]tW V]HUHSHW MiWV]LN D nlmmfkrul]rqwiolvq\vwdjpxvwopwuhkr]yp&n GpVpEHQDPHQQ\LEHQQpON O ]KHWHWOHQ a naso-temporalis irányú elmozdulásban (Gioanni és mtsai 1983). $ NpW Q%25 pv D NpW Q/0PF N ] WWL N OFV QKDWiVRN MHOOHP]MH KRJ\ D] HOOHQROGDOLPDJRNN ] WWJiWOiVILJ\HOKHWPHJ, amely nyílván azon az összeköttetésen alapszik, amelyet Brecha és munkatársai (1980) azonosítottak a nbor-ban. Ez a gátlás NRQWUROOiOMD D] HOOHQNH] LUiQ\~ RSWRNLQHWLNXV Q\VWDJPXVW $ NpWROGDOL Q%25 N ] WWL HUV UHFLSURN VV]HN WWHWpV GLUHNW SURMHNFLyW Eiztosít a gátló kontroll számára. 8J\DQDNNRU D NpW UHQGV]HU N ] WWL HUV V\QHUJL]PXV YLV]RQW D] D]RQRV LUiQ\~ nystagmust szabályozza. Zhang és munkatársai (1999), Wang és munkatársai (2000) és Wylie (2001) a két mag neuronjainak a szerepét vizsgálták a szemmozgások stabilizálásában, és a szem-nyak mozgások koordinálásában, és több sejttípust különítettek el funkcionális adottságaik alapján. A nbor sejtjei 97%-ban szelektíven reagálnak az irányra, és ezek a sejtek további csoportokat képeznek a dorso-ventralis (35%), naso-temporalis (34%), ventro-dorsalis és/vagy temporo-nasalis (8%) irány preferálásával. A nlmmc-ben a neuronok szintén nagy része (90%) irány szelektív. 14
3. Ce/.,7%=e6(. A járulékos opticus magokkal foglalkozó morfológiai, fiziológiai és viselkedést YL]VJiOy NtVpUOHWHN HUHGPpQ\HL KDQJV~O\R]WiN D PDJRN MHOHQWVpJpW $ V]iPWDODQ eredményes kutatás ellenére a járulékos opticus magok morfológiájának több olyan részlete maradt még ismeretlen, amelyek - ~J\ W&QLN - szükségesek ahhoz, hogy PDJ\DUi]DWRW DGMDQDN EL]RQ\RV P&N GpVL MHOHQVpJHNUH pv HJ\~WWDO NLHJpV]tWVpN morfológiai ismereteinket. A madarak látó rendszerének a tanulmányozása során jelen munkánkban célul W&]W QNNLD]DODSYHWEHOVQHXURQiOLVRUJDQL]iFLyPHJLVPHUpVpWDQHXURQiOLVHOHPHN immunhisztokémiai vizsgálatát elektron mikroszkópos szinten és végül a magok finom szerkezeti és kapcsolat rendszeri elemzését. A csirke két accessorius opticus magjának, a nucleus basalis tractus optici-nek (nbor) és a nucleus lentiformis mesencephali magnocellularis-nak (nlmmc), fény- és elektronmikroszkópos elemzésével foglalkoztunk. A munkát Golgi preparátumok WDQXOPiQ\R]iViYDONH]GW NPDMGH]WN YHWHQELRWLQLOiOW dextran amin (BDA) pályajelöléssel vizsgáltuk az opticus rostok és terminálisaik kapcsolatait. Az elektronmikroszkópos immunhisztokémiai jelölések felhasználásával kerestük a lokális, EHOVV]HUNH]HWLNDSFVRODWUHQGV]HUWDMHO]HWWRSWLFXVURVWRNDORNiOLs neuronok axonja pvydj\diihuhqvurvwrnypj]gpvhln ] WWDQ%25-ban és a nlmmc-ben. $NpWPDJEHOVV]HUNH]HWLHOHP]pVHDN YHWNH]OpSpVHNEHQW UWpQW 1. A nbor neuronális szerkezetének vizsgálata Golgi módszerrel. Neuron típusok elkülönítése projekciós és local circuit neuronokra. Rostok és terminálisok elemzése, majd összehasonlítása biotinilált dextran aminnal (BDA) jelzett opticus rostokkal és terminálisokkal. 2. GABA immunhisztokémiával jelöltük a GABA immuno-pozitív sejteket, rostokat és terminálisokat. Az eredményeket a Golgi elemzés eredményeivel összehasonlítva értékeltük. 3. Biotinilált dextran aminnal (BDA) jelzett retinalis rostok és a terminálisok YpJ]GpVpQHNpVNDSFVRODWDLQDNDNLGROJR]iVDN YHWNH]HWW$MHO]HWWRSWLFXV 15
rostok terminálisainak és GABA immunogold jelöléssel pozitív terminálisok synapticus kapcsolatait és ezhnhouhqgh]gpvpwyl]vjiowxn 4. Tanulmányoztuk a nlmmc sejt és rost struktúráját Golgi készítményeken, elkülönítettük és jellemeztük a neuronok típusait. 5. Megfigyeltük a BDA-val jelzett retinalis rostok lefutását és terminálisaik elhelyezkedését fénymikroszkópos vizsgálattal. Elektronmikroszkóppal kiértékeltük a terminálisok kapcsolatait, majd GABA immunogold jelöléssel elemeztük a terminálisokat és synapticus kapcsolataikat. 6. Az AOS két magjában összehasonlítottuk az intrinsic neuronális HOUHQGH]GpVW pv D V\QDSWLFXV NDSFVRODWRNDW D EHOV VWUXNWXUiOLV elrendezettséget funkcionális szempontból elemeztük, és ezzel VV]HI JJpVEHQ KDQJV~O\R]WXN D PDJRN EHOV VWUXNWXUiOLV YLV]RQ\DLQDN MHOHQWVpJpWDIHODGDWRNYpJUHKDMWiViEDQ 16
4. MÓDSZEREK 4.1. Kísérleti állatok A vizsgálatainkhoz két, három, illetve négy hetes, mindkét nembeli csirkéket *DOOXVGRPHVWLFXVKDV]QiOWXQN$]iOODWRNEiEROQDLNHOWHWpVEOV]iUPD]WDNpVD3,3,- TÉR BT, Bábolnai Naposcsibe és Takarmány Márkaboltban (1107 Budapest, Mázsa tér 3-YiViUROWXNNHW$*ROJLLPSUHJQiFLyKR]D*$%$LPPXQKLV]WRNpPLiKR] és a biotinilált dextran aminnal (BDA) végzett pályakövetéses vizsgálatokhoz 50 darab csirkét használtuk fel. A kísérleteinket a budapesti Semmelweis Egyetem Anatómia, Szövet-pV)HMOGpVWDQL,QWp]HWpEHQYpJH]W NDUiMXNYRQDWNR]yHWLNDLNyGH[D0DJ\DU Állatvédelmi Törvény (243/1998) és a Semmelweis Egyetem állatkísérletekre vonatkozó szabályainak betartásával. A Semmelweis Egyetem Anatómia, Szövet- és )HMOGpVWDQL,QWézet állatkísérleti engedélyének száma: 33/1999. 4.2. Altatás és perfúziós eljárás $ P&WpWHNHW pv D SHUI~]LyNDW PLQGLJ PpO\ DOWDWiVEDQ YpJH]W N $] DOWDWiVQiO ketamin alapú (50 mg/ml) altató (Calypsol) és xylazinhydrochlorid tartalmú izomlazító (Rompun DUiQ\~ NHYHUpNpW KDV]QiOWXN $] ioodwrn D P&WpWHW LOOHWYH D SHUI~]LyW PHJHO] yuiedq QHP NDSWDN HQQL KRJ\ D] DOWDWiV SUREOpPDPHQWHV OHJ\HQ $ SHUI~]Ly V]tYHQ NHUHV]W O W UWpQW LQI~]LyV NpV] OpN VHJtWVpJpYHO (OV] U IL]LROyJLiV sóoldattal (50 ml) az érrendszert alaposan átmostuk, majd fixáló folyadékkal fixáltuk az DJ\DW$IRO\DGpND]DONDOPD]RWWPyGV]HUWOI JJHQPiV-PiV VV]HWpWHO&YROW$IL[iOW FVLUNH DJ\YHONHW *ROJL LPSUHJQiFLyV pv *$%$ LPPXQKLV]WRNpPLDL PyGV]HUHN segítségével dolgoztuk IHOYDODPLQWDQWHURJUDGSiO\DN YHWDQ\DJRWELRWLQLOiOWGH[WUDQ amint, BDA) is alkalmaztunk. Rapid Golgi impregnáció esetén 4 % paraformaldehydet és 2 % glutáraldehydet tartalmazó 0,1 M-os foszfát puffer (PB; ph=7,4) alapú fixáló oldatot használtunk. EM Golgi impregnáció, prae- és post-embedding GABA 17
immunhisztokémia esetén 2 % paraformaldehydet és 2 % glutáraldehydet tartalmazó 0,1 M-os foszfát puffer (PB; ph=7,4) alapú oldattal fixáltunk. A biotinilált dextran aminnal (BDA) történt anterograd pályakövetéses vizsgálatok során viszont 4 % paraformaldehydet, 0,2 % pikrinsavat és 1 % glutáraldehydet tartalmazó 0,1 M-os foszfát puffer (PB; ph=7,4) alapú fixáló folyadékot használtunk. Fixálás után Luer FVRQWFVtS VHJtWVpJpYHO yydwrvdq OHV]HGW N D NRSRQ\DFVRQWRNDW PpJ LQ VLWX iránymetszést ejtettünk, és a kivett agyat 2-3 órára utófixáló folyadékba (fixálóval D]RQRV VV]HWpWHO&IRO\DGpNJOXWDUDOGHK\GQpON OWettük. Ezután az anyag feldolgozása történt. 4.3. Rapid Golgi impregnáció A fixált agyból 0,5 cm-nél nem vastagabb blokkokat készítettünk, majd 2 %-os ozmium-tetroxid és 2,5 %-os kálium-bichromat 1:4 arányú keverékébe helyeztük. A keverékbe belehelyezewweornnrndwv WpW YHJEHQV]REDKPpUVpNOHWHQQDSLJWiUROWXN Ezután a blokkokat 0,75 %-RV H] VWQLWUiWED WHWW N yuiud. YHWNH] OpSpVEHQ D blokkok ismételten 1:4 arányú ozmiumos bikromátba kerültek 4 napra, majd 0,75 %-os ezüstnitrátba 2 napra. Az aq\djrwd] YHJEONLYpYH SDUDIILQ EORNNUD UDJDV]WRWWXN pv 80-100 µm-es metszeteket készítettünk szánkás mikrotommal. A lemetszett metszeteket HOV] UDEV]RO~WDONRKROEDWHWW NSHUFUHPDMGSHUFUHV]HJI&V]HJRODMEDYpJ O percre xilolba. A xilolból a metszeteket tárgylemezre húztuk fel és DePeX-el (Serva) fedtük le. 4.4. EM Golgi impregnáció A fixált agyból 0,5 cm-nél nem vastagabb blokkokat készítettük, majd 2 %-os ozmium-tetroxid és 2,5 %-os kálium-bichromat 1:4 arányú keverékébe helyeztük. A NHYHUpNEH EHOHKHO\H]HWW EORNNRNDW V WpW YHJEHQ V]REDKPpUVpNOHWHQ QDSLJ tároltunk. Ezután a blokkokat 0,75 %-RV H] VWQLWUiWED WHWW N yuiud. YHWNH] lépésben a blokkok ismételten 1:4 arányú ozmiumos bikromátba kerültek 4 napra, majd 0,75 %-os ezüstqlwuiwed QDSUD $ EORNNRNDW D] YHJEO NLYpYH SDUDIILQ EORNNUD 18
ragasztottuk és 80-100 µm-es metszeteket készítettünk szánkás mikrotommal. A metszeteket 98 %-RV JOLFHULQHV WiUJ\OHPH]UH WHWW N PDMG IHGOHPH]]HO OHIHGW N Minden tárgylemezt fénymikroszkóp alatt 20-SHUFLJPHJYLOiJtWRWWXN] OGIpQ\V]&U DODWW ÈWYLOiJtWiV XWiQ D PHWV]HWHNHW GHV]WLOOiOW Yt]EHQ OH~V]WDWWXN D WiUJ\OHPH]UO pv 0,07 %-os aranyklorid oldatba tettük 10-15 percre. Ezután háromszor desztillált vízzel öblítettük és 0,2 %-os oxálsavba helyeztük 2 percre. Ismételt háromszoros desztillált vizes öblítetés után 1 %-os natrium-tioszulfátban tartottuk a metszeteket háromszor 10- SHUFLJ +iurpv]rurv GHV]WLOOiOW Yt]]HO YDOy EOtWpV XWiQ IHOPHQ DONRKROVRUEDQ dehidráltuk és Durcupan-ba (ACM, Fluka) ágyaztuk. Ultravékony metszeteket készítettünk, amelyeket Jeol 1200 EMX elektronmikroszkóppal tanulmányoztuk. 4.5. Prae-embedding GABA immunhisztokémia $] DJ\YHOW FU\RSURWHFWLR FpOMiEyO HOEE -os cukoroldatba (egy órára), majd 20 %-os cukoroldatba (egy éjszakára) raktuk. Ezután folyékony nitrogénben átfagyasztottuk az agyat, és vibratome segítségével 60-70 µm-es coronalis metszeteket készítettünk 0,1 M-os foszfát pufferben (PB; ph=7,4). A metszeteket többször 0,1 M-os foszfát pufferben (PB; ph=7,4) mostuk, utána az endogén peroxidáz aktivitás kimerítésére az elektronmikroszkópos feldolgozásra szánt metszeteket 1 %-os nátriumborohidráttal kezeltük, a fénymikroszkópos metszeteket viszont 1 %-os hidrogénperoxiddal. 0,1 M-os foszfát pufferben (PB; ph=7,4) és foszfát pufferes sóoldatban (PBS; ph=7,2) történt többszöri mosás után 1 órára 20 %-os normál NHFVNHV]pUXP 1*6 +XPDQ * G OO ROGDWiED KHO\H]W N D QHP VSHFLILNXV immunreakció kiküszöbölésére. 1 %-os normál kecskeszérumban (NGS, Human GödölOYDOyPRViVXWiQDPHWV]HWHNHWDSULPHUV]pUXPPDOQ\~ODQWL-GABA, Sigma, LQNXEiOWXN yuilj (]W N YHWHQ D PHWV]HWHN ELRWLQLOiOW NHFVNH DQWL-nyúl IgG-be (Vector, 1:250) kerültek 24 órára. Ezután avidin-biotin complex (ABC, Vector, 1:200) oldatába tettük a metszeteket 18 órára. A foszfát pufferes sóoldatban (PBS; ph=7,2) való többszöri mosás után az immuno-peroxidáz végproduktumát 3,3 - diamino-benzidin (DAB, Sigma) 0,025 %-os és 0,001 %-os H 2 O 2 oldatában 6-8 percig tartva nyertük. 0,1 M-os foszfát pufferes (PB; ph=7,4) mosás után a metszeteket 19
IHOPHQDONRKROVRUEDQYt]WHOHQtWHWW NWiUJ\OHPH]UHIHOK~]WXNpV'XUFXSiQ-nal (ACM, Fluca) lefedtük. Azon metszeteket, amelyek további elektronmikroszkópos feldolgozásra kerültek 1 %-os ozmium-tetroxiddal (Sigma) 10 percig utánfixáltuk, majd IHOPHQDONRKROVRUEDQYDOyGHK\GUiOiVXWiQ'XUFXSiQ-ba (ACM, Fluca) ágyaztuk, és ultravékony metszeteket készítettünk, amelyeket Jeol 1200 EMX elektronmikroszkóppal tanulmányoztunk. 4.6. Post-embedding GABA-gold immunhisztokémia Az ultravékony metszeteket hártyás nikkel-gridekre helyeztük. A grideket HOV] U-os nátrium-perjodát oldattal (10 perc), majd alapos és többszöri desztillált vizes mosás után 1 %-os nátrium-metaperjodát oldattal kezeltük (10 perc). Újabb ELGHV]WLOOiOW YL]HV PRViVW N YHWHQ -os normál kecskeszérummal (NGS, Human * G OO PRViVW YpJH]W QN [ SHUF D QHP-specifikus immunreakció elnyomása érdekében. Utána a metszeteket 1 %-os ovalbuminnal (Sigma) kezeltük (30 perc). Ismételt többszöri 1 %-RVQRUPiONHFVNHV]pUXPPDO1*6+XPDQ* G OOYDOyPRViV után a metszeteket GABA antiszérumban (1:1000, Sigma) inkubáltuk (2 óra). Az inkubálás után a metszeteket 3x10 percig 1 %-os normál kecskeszérumban (NGS, +XPDQ* G OOWDUWRWWXNPDMG-os bovin albumint (Sigma) és 0,5 % Tween 20-at (Sigma) tartalmazó Tris puffer (TB; ph=7,4) oldatba kerültek 5 percre. Ezután a metszeteket arany-konjugátumban (kecske anti-nyúl IgG, 15 nm, British Biocell) inkubáltuk 1:10 hígításban 2 óráig, majd mosás következett desztillált vízben. Utána uranylacetáttal és ólomnitráttal 20, illetve 10 percig kontrasztoztuk a metszeteket. Az DUDQ\V]HPFVpNV&U&VpJHD*$%$-SR]LWtYKHO\HNUHMHOOHP] 4.7. Anterograd pályakövetéses vizsgálatok biotinilált dextran aminnal (BDA) A biotinilált dextran amint (BDA 10000; Molecular Probes) fiziológiás sóoldatban 20 % koncentrációra hígítottuk, majd iontoforézissel adtuk be a csirke QHUYXVRSWLFXViEDN ]YHWOHQ OUHWUREXOEDULVDQ$QHUYXVRSWLFXVHOpUpVHFpOMiEyOP&WpWHW 20
végeztünk, mély altatásban. Stereotaxiás készülék segítségével 45 fokos szögben rögzítettük a csirke fejét. Az orbitát fúrógép segítségével nyitottuk meg, és operációs PLNURV]NyS VHJtWVpJpYHO NLSUHSDUiOWXN D QHUYXV RSWLFXVW (]XWiQ PP iwppum& kapillárison keresztül, iontoforézissel, impulzusos, 6-7 µa-hv IHV] OWVpJ& iudppdo adagoltuk a BDA-t 30-40 percig. Az állatokat egy hetes túlélés után szíven keresztül SHUIXQGiOWXNPpO\ DOWDWiVEDQ$IL[iOWDJ\YHOWFU\RSURWHFWLRFpOMiEyOHOEE-os cukoroldatba (egy órára), majd 20 %-os cukoroldatba (egy éjszakára) raktuk. Ezután folyékony nitrogénben átfagyasztottuk, és a chiasma opticumot, tectum opticumot, illetve nucleus rotundust tartalmazó blokkból vibratom segítségével 50 µm-es coronalis metszeteket készítettünk 0,1 M-os foszfát pufferben (PB; ph=7,4). A metszeteket többször mostuk Tris pufferben (TB; ph=7,4), mosások közben rázógépen tartva. Ezután avidin-biotin komplexszel (1:100 ABC, Vector Labs.) reagáltattuk a metszeteket yuiq iw K&WEHQ WiUROYD ÒMDEE DODSRV pv többszöri mosást (TBS ph=7,4; TB S+ N YHWHQ D SHUR[LGi] UHDNFLyKR] V]XEV]WUiWXPNpQW -os nikkelammónium-szulfáttal intenzifikált 0,025 % koncentrációjú 3,3 -diamino-benzidint (DAB, Sigma) adtunk, a komplexet 0,001 %-os hidrogénperoxiddal jelenítettük meg. TB-ben való mosás után a fénymikroszkópos metszeteket zselatinos tárgylemezre húztuk fel, neutrálvörössel festettük meg és DePeX-el (Serva) fedtük le. Az elektronmikroszkópos metszeteket 1 %-os ozmium-tetroxiddal (Sigma) 10 percig utánfixáltuk PDMG IHOPHQ DONRKROVRUEDQ YDOy GHK\GUiOiV XWiQ 'XUFXSDQ-ba (ACM, Fluca) ágyaztuk, és ultravékony metszeteket készítettünk, amelyeket Jeol 1200 EMX elektronmikroszkóppal tanulmányoztuk. 21
5. EREDMÉNYEK 5.1. A nucleus basalis tractus optici (nbo5ehovv]hunh]hwh $ QXFOHXV EDVDOLV WUDFWXV RSWLFL Q%25 EHOV V]HUNH]HWpW DODNtWy neuronalis elemek jellemzése Golgi preparátumokon A nbor hasonlóan az egész diencephalonhoz, nagyon ritkán impregnálódik Golgi módszerrel, ezért gyakorlatilag nem ismert a mag neuronjainak és afferens rostjainak Golgi architektúrája madárban. Rapid Golgi impregnációval készült metszeteken tanulmányoztunk a nbor neuronjainak és rostjait és afferens rostjaiból származó terminális ágak lefutását. A nbor felszínét rostokból kialakult perinuclearis kapszula veszi körül. A NDSV]XOiW NpSH] URVWRN YDOyV]tQ&OHJ D PDJED EHOpS DIIHUHQVHNEO pv NLOpS HIIHUHQVHNEO V]iUPD]QDN DPHO\HN HJ\ V]DNDV]RQ FVDWODNR]QDN D PDJ IHOV]tQpKH] $ mag belsejében vastag és közepes vastagságú rostok és terminálisaik láthatók. A vastag rostok terminálisai varicosusak. A nbor-ban talált neuronokat sejttestük nagysága, dendritjeik elágazódásának a mintázata alapján négy sejtcsoportra osztottuk: nagy, közép-nagy, kis ovoid és kis fusiformis neuronokra (5. ábra). Bár a közép-nagy sejtek esetében is van némi különbség a sejt alakja szerint, de sem elhelyezkedésük, sem dendrit-elágazódásuk mintázata nem indokolta további elkülönítésüket. A nbor neuronjait Golgi impregnációs készítményeken tanulmányozva úgy találtuk, hogy a neuronok impregnálódott axonjuk alapján két nagy csoportba oszthatók: projekciós neuronok és local circuit neuronok. Ez azt jelenti, hogy a neuronok egyik csoportja hosszú, a magot elhagyó axonnal rendelkezik, és a távoli összeköttetésekért IHOHOV(]HNQHNDQHXURQRNQDNQDJ\YDJ\N ]ps-nagy sejtteste van. A másik csoport neuronjainak axonja a magban ágazódik el, ami a lokális kapcsolatok létesítését jelenti. (EEHDFVRSRUWED D NLV RYRLG pv D SHULIpULiVDQ HOKHO\H]NHG NLVIXVLIRUPLV QHXURQRk tartoznak (5. ábra). 22
5.1.2. Projekciós neuronok jellemzése Golgi preparátumok alapján Nagy neuronokiohjdq%25shulipulimiqghdpdjehovhmpehqlvhoirugxoqdn A perikaryonjuk legtöbbször nagy, körte alakú, de található köztük ovoid és angularis VHMWWHVW&LV$SHULNDU\RQKRVV]~iWPpUMHDSHULIpULiQDIHOV]tQQHOV]LQWHSiUKX]DPRVDQ helyezkedik el. A mag belsejében többnyire ventro-dorsalis irányban található a sejt hossztengelye, amelyet 45-55 µp KRVV]~ViJ~QDN PpUW QN D U YLG iwppu µm (6. ábud.pw KiURP QpKD QpJ\SULQFLSiOLV GHQGULW HUHG D VHMWEO GH HJ\ N ] O NMyYDO YDVWDJDEE PLQW D W EEL 5HQGV]HULQWH] D IGHQGULWDPHO\ D] ijuhqgv]hupyhon YHWLD PDJ IHOV]tQpW $ SULQFLSiOLV GHQGULW PHJOHKHWVHQ YDVWDJ -15 µp iwppum& pv hosszúsága 80-120 µm-w WHV] NL $ IGHQGULW pv D WRYiEEL GHQGULW V]DNDV]RN LV ELIXUNiFLyYDO RV]ODQDN $ W EEV] U V RV]OiV XWiQ D PHJOHKHWVHQ YpNRQ\ SUHWHUPLQiOLVQDNQHYH]KHWGHQGULWV]DNDV]-5 terminális ágra válik szét egy oszlási pontból (6., 7., 8. ábra). A vékony preterminális és különösen a terminális dendrit szakaszok kis nyúlványokat és dendrittüskéket bocsátanak ki (7. ábra). Egyebütt a N O QE ]UHQG&GHQGULWHNHQFVXSiQHJ\-HJ\Q\~OYiQ\pVW VNHIRUGXOHO. O Q VHQ sima a principális dendrit felszíqh$q%25ihov]tqhdodwwhokho\h]nhgqdj\qhxurqrn dendritjei a preterminális és terminális végágaikat a mag belseje felé küldik, így a W VNpNNHO pv Q\~OYiQ\RNNDO ERUtWRWW GHQGULWHN D PDJ EHOV UpJLyLEDQ HOKHO\H]NHG hasonló képletek közé kerülhetnek. AFHQWUiOLVUpJLyEDQHOKHO\H]NHGQDJ\pVN ]psnagy neuronok hasonló dendrit elágazódásaiból kialakuló preterminális és terminális V]DNDV]DLN D SHULIpULiV QHXURQRN WHUPLQiOLV V]DNDV]DLYDO V]iPRV V&U& GHQGULW szigeteket, dendritikus fészkeket hoznak létre. (]HN D NpS]GPpQ\HN D QDJ\ perikaryonok között, a kis, vékony és tüskés dendrit terminális ágak szövevényével IHOWpWHOH]KHWHQ IRQWRV NDSFVROyGiVL KHO\HL D] HOiJD]yGy RSWLFXV URVWRNQDN $ centrálisan található nagy és közép-nagy neuronok dendritjeinek elágazódása, a hozzájuk csatlakozó rostok kötegével mintegy kettéválasztják a magot, egy medialis és egy lateralis részre. A nagy neuronok axonja nagyon ritkán impregnálódott, és minden esetben. kifejezett axon-kúppal eredt a perikaryonból. Rövid lefutás után az axonok belépnek a PDJN U OLURVWN WHJEHDPHO\EON O QE ]LUiQ\EDOpSQHNNL$]D[RQRNYDVWDJRNpV YDOyV]tQ&OHJ U YLGGHO HUHGpV N XWiQ P\HOLQK YHOO\HO UHQGHONH]QHN. )HOWHKHWHQ H] D] 23
oka annak, hogy axoncollateralist nem sikerült megfigyelnünk. A perikaryon és a dendritfa nagysága, az axonok magon belüli lefutása, és a csatlakozásuk a perinuclearis rostköteghez arra utal, hogy a nagy neuronok a mag projekciós neuron típusához tartoznak. A közép-nagy neuronok D PDJ PLQGHQ UpV]pEHQ HOIRUGXOQDN D FHQWUális UpJLyEDQ pv D IHOV]tQHQ LV GH IOHJ D YHQWUDOLV DUHDEDQ ieud (]HNQHN D neuronoknak elongált, ovoid perikaryonjuk van, egy hosszabb (30 µm) és egy rövidebb (20 µpiwppuyho3ulqflsiolvghqgulwmhlnuhqgv]hulqwdshulndu\rqnpwypjpeohuhgqek. Ezek eredése határozza meg az elongált formát, és hangsúlyozza a dendritek vastag eredését. Eredhet egy-hj\ SULQFLSiOLV GHQGULW D VHMWIHOV]tQ HJ\pE UpV]pUO LV GH H]HN UHQGV]HULQW YpNRQ\DEEDN D NpW SROiULVDQ HUHG SULQFLSiOLV GHQGULWQpO $ N ]ps-nagy neuronok között elvétve lehetett multiangularis neuront is találni. A közép-nagy neuronok dendritjei a perikaryon körül alakítják ki a dendritfát, amely viszonylag nagy területre terjed ki. A principális dendritek 2-3-szor ágazódnak el és végül vékony terminális ágakra oszlanak. A terminális ágak nyúlványokat és tüskéket bocsátanak ki, QpKD SUR[LPDOLV GHQGULW IHOV]tQHNHQ LV HOIRUGXOW VNH YDJ\ Q\~OYiQ\ $N ]ps-nagy neuronok terminális dendrit ágai interdigitálnak a nagy sejtek hasonló terminális dendrit szakaszaival és dendrit fészkeket alakítanak ki (7., 8. ábra). A közép-nagy neuronok axonja nagyon kevés alkalommal impregnálódott és ilyen alkalmakkor is csak rövid szakaszon. Eredésénél axon-kúp található. Az axon rendszerint a perikaryonból ered, de kiiqgxokdwdsulqflsiolvghqgulweolvpvohixwivdd nagy sejt axonjáéhoz hasonló. 5.1.3. Local circuit neuronok jellemzése Golgi preparátumok alapján Kis, ovoid neuronok gyakran impregnálódtak a nbor centrális régiójában (5., 6. ábra), de a periférián is HOIRUGXOWDN3HULNDU\RQMXNKRVV]DEEiWPpUMH-18 µm, rövid iwppumh-11µm. Ezeknek a neuronoknak kevés, kanyargós dendritjuk van, amelyek a VHMW N U O UHQGH]GQHN HJ\V]HU-kétszer elágazódva. A dendritek ritkán tüskések. Axonjuk röviddel az eredés után elágazódik a dendritfa területén, túlhaladva rajta, de WHOMHV D[RQ HOiJD]yGiVW QHP VLNHU OW WDOiOQXQN D] DQ\DJXQNEDQ (OVVRUEDQ D] D[RQ 24
elágazódása, de a dendritfa mintázata is arra utal, hogy a kis ovoid neuronok nagy YDOyV]tQ&VpJJHOORFDOFLUFXLWQHXUonok. Elongált vagy kis fusiformis neuronok csak a perinuclearis kapszula mentén, YDJ\ URVWMDL N ] WW IRUGXOWDN HO D *ROJL SUHSDUiWXPRNEDQ /HJW EEV] U D SHULIpULiV KHO\]HW&QDJ\SURMHNFLyVQHXURQRNpVDNDSV]XODN ] WWKHO\H]NHGQHNHODQ%25-ban (5. ábrd$qhxurqrnkrvv]deeiwppumh-20 µpu YLGiWPpUMHµm. Principális GHQGULWMHLDVHMWNpWSyOXViEyOLQGXOQDNNLHJ\HQHVOHIXWiV~DNVLPDIHOV]tQ&HNpVDPDJ felszínéhez igazodva haladnak, majd további ágakra válnak. Néhány alkalommal a nbor perifériás és centrális régiójában elágazódó axonjuk is impregnálódott. A kis fusiformis neuronokat axonjuk elágazódása alapján local circuit neuronoknak tekintjük. A Golgi preparátumok elemzése alapján megállapítható, hogy a nbor-ban a morfológiai adottságuk szhulqwixqnflrqiolvv]hpsrqwrndwwhnlqwyhnpwdodsyhwqhxurq WtSXVN O QtWKHWHO$QHXURQRNHJ\LNFVRSRUWMDDKRVV]~D[RQ~WiYRODEELN ]SRQWRNED eljutó, projekciós neuronok, míg a másik csoport a local circuit neuronok. A local circuit neuronok axonja lokálisan, a nbor-ban ágazódik el. 5.1.4. GABA immunhisztokémia a nucleus basalis tractus optici-ben (nbor) Fénymikroszkópos értékelésre alkalmas GABA immunhisztokémia után tanulmányoztuk a nbor-ban található GABA-pozitív neuronalis elemeket (9. ábra). Rostro-caudalis irányban készült metszeteken vizsgáltuk a GABA immuno-pozitív VHMWHNHOIRUGXOiViW0HJiOODStWRWWXNKRJ\D*$%$LPPXQR-jelzett perikaryonok egy része megfelel a kis ovoid local circuit neuronoknak, alakjukat és nagyságukat figyelembe véve. Ezek a GABA-SR]LWtY VHMWHN IOHJ D PDJ FHQWUiOLV UpV]pEHQ helyezkedtek el, hasonlóan a Golgi preparátumokon talált sejtekhez. A kis fusiformis neuronok is GABA-pozitív neuronoknak bizonyultak a mag perifériáján. A GABA immuno-pozitív sejtek között GABA-pozitív dendrit profilokat és rostokat figyeltünk PHJV&U&HOUHQGH]GpVEHQ$QDJ\REEiWPpUM&*$%$-pozitív profilok a pozitív sejtek N UQ\H]HWpEHQYROWDNLQNiEEOiWKDWyNYDOyV]tQ&OHJD*$%$-pozitív sejtek dendritjeit jelentették. A kisebb, finom GABA-poziWtY V]HPFVpNHW IOHJ D *$%$-negatív, nagy 25
VHMWHN N UQ\pNpQ WDOiOWXN pv YDOyV]tQ&OHJ D YpNRQ\ D[RQ ijdndw SUHWHUPLQiOLV ijdndw illetve ág fragmentumokat jelölték. 5.1.5. Az opticus rostok jelölése biotinilált dextran aminnal (BDA) A nervus opticusba történt BDA beadása után jelölt rostokat lehetett megfigyelni D WUDFWXV RSWLFXV YHQWUDOLV UpV]pQ D EHDGiVVDO HOOHQNH] ROGDORQ $ MHO OW URVWRN D nbor-t lateralis és dorso-lateralis irányból érik el, és lépnek be a magba. A fénymikroszkópos megfigyelések azt is láttatják, hogy a jelölt rostok a mag minden UpV]pQPHJWDOiOKDWyN ieudn O Q VHQQDJ\V&U&VpJJHODPDJN ]psvwhu OHWpQ (]HQ D UpV]HQ D URVWRN V&U&VpJHPLDWW D UpV]OHWHN PHJILJ\HOpVH QHKp]NHV YROW $ PDJ NHYpVEp V&U&Q EHKiOy]RWW WHU OHWHL YLV]ont az opticus rostok részletes megfigyelését WHWWpNOHKHWYp$PDJEDEHOpSMHO OWRSWLFXVURVWRNYDVWDJViJiW-3 µm-nak mértük. $] iwyijrww RSWLFXV URVWRN YpJH NLVVp PHJYDVWDJRGRWWQDN OiWV]RWW IHOWHKHWHQ D beavatkozás (metszés) következtében. A lateraolvdq EHOpS URVWRN D PDJ ODWHUDOLV felében, a dorso-odwhudolvdq EHOpSN SHGLJ D PHGLDOLV UpV]pEHQ ijd]ygwdn HO 6]iPRV jelölt opticus rost csatlakozott a perinuclearis rostköteghez a mag felszínén és innen lépett be a magba, ahol többnyire bifurkációval ájd]ygrww HO YpJ O V&U& KiOy]DWRW NpSH]YH WHUPLQiOLV ijdlydo $ WHUPLQiOLV ijdn N O QE ] KRVV]~ViJ~ -30 µm YDULFRVXViJDFVNiNDPHO\HNV&U&V] YHYpQ\WDONRWQDN$WHUPLQiOLViJDNYDULFRVLWiVDL 1-2 µpiwppum&hndn ]W NOpYLQWHUYDULFRVXVV]DNDV]RNQDJ\RQYpNRQ\DN$V&U& WHUPLQiOLV IRQDW YDOyV]tQ&OHJ PHJIHOHO D *ROJL LPSUHJQiFLyYDO NDSRWW PLQGNpW projekciós neuron típus terminális dendrit ágaival kialakított interdigitalis dendrit- IpV]HNQHN ieud $ V&U& WHUPLQiOLV RSWLFXV URVW-hálózat nem jelent mást, mint kölcsönös alkalmazkodást a terminális dendrit ágakhoz, létrehozva a neuronalis hálózat HOUHQGH]GpVpQHNVSHFLiOLVNLHPHOWKHO\HLW(]HNEHQDGHQGULW-fészkekben ugyanaz az RSWLFXV URVW iwdgkdwmd D YL]XiOLV LQJHU OHWHW D N O QE ] KHO\HNHW ellátó projekciós QHXURQRNQDN NLDODNtWYD D V\QDSWLFXV PH]NHW(] D VWUXNWXUiOLV HOUHQGH]GpVIRUUiVD lehet ugyanazon vizuális információ divergenciájának. 26
5.1.6. Elektronmikroszkópos megfigyelések biotinilált dextran aminnal (BDA) és GABA immunogold-dal jelölt preparátumokon (OHNWURQPLNURV]NySRV PHWV]HWHNHQ VLNHU OW PHJILJ\HOQ QN D N O QE ] nagyságú sejtek metszet-surilomdlw$qdj\vhmwhniwppumh-50 26-30 µm, a közép- QDJ\VHMWiWPpUL-35 21-23 µm és a kis sejteké 16-18 10-12 µm. Az adatok olyan sejtekre vonatkoznak, amelyek a vizsgált metszeten magot és magvacskát is tartalmaztak. A mért adatok csak jelentéktelen mértékben különböztek a Golgi metszeteken mért adatoktól. A nagy és közép-nagy sejtek perikaryonja gazdag volt organellumokban mindkét sejttípusban, az endoplasmas reticulum (Nissl granulumok) FVRSRUWRNED UHQGH]G WW $ SHULNDU\RQKR] -20 synapsist kialakító terminális NDSFVROyGRWW(]HNDYpJ]GpVHNV]LPPHWULNXVV\QDSVLVRNDWDODNtWRWWDNNLDQDJ\VHMWHN perikaryonján, és kétfélék voltak: hosszú, keskeny terminálisok, amelyek lapos, vagy ovoid vesiculát tartalmaztak, illetve hosszú, széles terminálisok pleomorph synapticus vesicula tartalommal (11. ábra). A közép-nagy sejtek perikaryonján is hasonló terminálisok alkottak synapsisokat. Ezen utóbbi neuronokon 1-2 jelzett opticus WHUPLQiOLV pv DV]LPPHWULNXV V\QDSVLV LV PHJILJ\HOKHW YROW $ QDJ\ pv N ]ps-nagy sejtek proximalis és további dendrit szakaszai kevés sejtorganellumot (tubulust, mitochondriumot) tartalmaztak. A dendritek eredését lapos synapticus vesiculát tartalmazó terminálisok borították, és létesítettek szimmetrikus synapsisokat (12. a ieud $ GHQGULW IHOV]tQHNHQ YHJ\HVHQ IRUGXOWDN HO SOHRPRUSK pv ODSRV YHVLFXOiW tartalmazó terminálisok, szimmetrikus synapsisokat létesítve a dendritekkel. A másodlagos és toyieel GHQGULW V]DNDV]RNRQ HOIRUGXOWDN DV]LPPHWULNXV V\QDSVLVRNDW OpWHVtW WHUPLQiOLVRN N ]W N %'$-val jelzettek is (12. b ábra). Ezek a terminálisok közepes nagyságú, kerek vesiculát tartalmaztak és opticus terminálisoknak bizonyultak. Az opticus termináolvrn HJ\UH Q YHNY V]iPEDQ OpWHVtWHWWHN DV]LPPHWULNXV synapsisokat a distalisabb dendritekkel. A szimmetrikus synapsisok száma viszont FV NNHQWpVLQNiEEFVDNDGHQGULWHNHOiJD]yGiVDLQiOMHOHQWHNPHJ$GHQGULWHNYpJV terminális szakaszán csak jelölt, YDJ\MHO OHWOHQRSWLFXVWHUPLQiOLVRNVRUDNR]QDNV&U&Q egymás mellett, betakarva a teljes dendrit felszínt (13. a, b ábra). Csupán a terminális GHQGULWV]DNDV]UDW UWpQHOiJD]yGiVRNHOWWWDOiOKDWyNV]LPPHWULNXVV\QDSVLVRN 27
A kis neuronok elektronmikroszkópos metszetein látszik, hogy viszonylag nagy magjuk van, és rendszerint két magvacskát tartalmaznak (14. ábra). Citoplazmájuk organellumokban szegény. A perikaryon membránján számos szimmetrikus és aszimmetrikus synapsis található. Az aszimmetrikus synapsisok opticus terminálisok NDSFVRODWDLW MHO]LN D NLV QHXURQRNNDO $] RSWLFXV WHUPLQiOLVRNDW D MHO]HWWYpJ]GpVHN bizonyítják (14. ábra). A kis neuronok GABA-pozitívnak bizonyultak GABA immunogold módszerrel jelzett elektronmikroszkópos metszeteken is. Ezek a neuronok az elektronmikroszkópos eljárással kiegészítve, tipikus local circuit neuron tulajdonságait mutatják. A kis neuronok dendritjeiben több mikrotubulus található, mint a nagy és közép-nagy neuronokéban. Felszínüket jelzett és nem-jelzett opticus terminálisok borítják, csak egy-egy GABA-SR]LWtYWHUPLQiOLVIRUGXOHON ]W NDE ábra). A sejtek, a nagy és közepesen nagy dendritek között kiterjedt neuropil, kis profilokból és terminálisokból álló hálózat, helyezkedik el a nbor-edq (] D PH] magában foglalja az opticus rostok elágazódásainak és terminálisainak nagy részét is. A NLV QHXURQRN D[RQMiQDN D] HOiJD]yGiVDL LV LWWWDOiOKDWyN (]HNHW D PH]NHWiOWDOiEDQ nagy dendritek, myelin hüvelyes rostok, perikaryon részletek veszik körül. GABA immunogold eljárással készített metszeteken GABA-pozitív, lapos vagy pleomorph synapticus vesiculát tartalmazó terminálisok is jelen vannak a jelzett és nemjelzett opticus terminálisok mellett. A két típusú GABA-pozitív terminális szimmetrikus synapsisokat létesít a magban (16. a, b ábra), és általában egyforma gyakorisággal jelenik meg a mag minden részében, kivéve a principális dendritek eredési helyét. Az HJ\LNWtSXVYDOyV]tQ&OHJDNLVQHXURQORFDOFLUFXLWQHXURQD[RQWHUPLQiOLVD$PiVLN GABA-pozitív termiqiolviruuivdydoyv]tq&ohjd]d*$%$-pozitív myelinhüvelyes rost (17. ábra), amely dorso-lateralisan lép be a nbor-ba, ahol el is ágazódik. A P\HOLQK YHO\HVURVWRNQDNW EEIRUUiVDOHKHW(J\LNOHKHWVpJD]HOOHQROGDOLQ%25GH érkezhetnek a vizuális Wulst-EyO LV PLYHO H]HNUO D WHU OHWHNUO punh]qhn myelinhüvelyes afferens rostok a magba. 28
$ QXFOHXV OHQWLIRUPLV PHVHQFHSKDOL PDJQRFHOOXODULV Q/0PF EHOV szerkezete 5.2.1. A nucleus lentiformis mesencephali magnocellularis (nlmmc) neuronalis szerkezete Golgi preparátumokon *ROJL SUHSDUiWXPRNEDQ D Q/0PF QHKH]HQ IHGH]KHW IHO $ PDJYDOyEDQULWND impregnációja talán az elhelyezkedésével magyarázható, ugyanis a diencephalon és a mesencephalon határán, a rostkötegek között rosszabbak a szöveti adottságok a sikeres impregnációhoz. A legszebb Golgi-impregnált neuront olyan területen találtuk, ahol az puv&u&vvpj PDJDVDEE YROW PLQW HJ\HE WW (]puw LV V]RNiV PRQGDQL KRJ\ D *ROJL LPSUHJQiFLyYpOHWOHQV]HU&HQVLNHU O A nlmmc a diencephalon és mesencephalon határán vertikális irányban KHO\H]NHGLNHOGRUVDOLVKHO\]HW&NLVPHJYDVWDJRGiVVDO(]XWyEELWyOQ\HUWHDOHQWLIRUPLV nevet. Az opticus rostok is ebben az irányban futnak, és itt érik el bizonyos helyeken PHJOHKHWVHQV]yUWDQPiVXWWYLV]RQWW P UHEEHQHOKHO\H]NHGVHMWHNHW A nlmmc-ban az említett nehézségek ellenére sikerült Golgi impregnációval W EE VHMWWtSXVW HON O QtWHQ QN HOVVRUEDQ D NpW DODSYHWHQ PHJKDWiUR]y QHXURQW D Golgi II. típusú local circuit neuront, és projekciós neuronokat. A projekciós QHXURQRNQDNWRYiEELDOWtSXVDLLVHOIRUGXOQDNEiUPHJJ\]HON O QtWpV NQHPPLQGHQ esetben sikeres az axonjuk hiányos impregnációja miatt. Legtöbbször csupán a sejt QDJ\ViJDNHYpVEpD]DODNMDVRNNDOLQNiEEDGHQGULWHNPRUIROyJLDLMHOOHP]LVXJDOOMiN purmhnwtymhoohj NHW$]HUHGIGHQGULWHQpVDVHFXQGHUGHQGULWHNHQQLQFVW VNH A projekciós neuronokkiurpfvrsruwmdn O QtWKHWHOQDJ\ViJXNDODSMiQyULiV nagy és közép-nagy projekciós neuronok. Az óriás és nagy projekciós neuronok IHOWHKHWHQ D OHJWiYRODEEL VV]HN WWHWpVHNUH V]HUYH]GWHN D N ]ps-nagy projekciós QHXURQRNSHGLJYDOyV]tQ&OHJN ]HOHEELN ]SRQWRNHIIHUHQVQHXURQMDL$]yULiVLVHMWWHVW& QHXURQSHULNDU\RQMiQDND]iWPpUL-65 30-40 µpdqdj\vhmwiwppul-35 18-25 µp pv D N ]ps PpUHW& PXOWLDQJXODULV QHXURQ VHMWWHVWpQHN iwppumh -26 µm, az HORQJiOWDODN~VHMWHNiWPpUMHSHGLJîµP$MHOHQWVQDJ\ViJEHOLN O QEVpJHNLV indokolják a projektív neuronok elkülönítését. 29
Az óriás neuront lehet giganto-cellulának is nevezni, mérete az emberi motoros cortexben található óriás pyramis neuronok sejttestének a nagyságával vetekszik. A neuron különlegességét mégsem a sejt nagysága, hanem a dendritfájának jellegzetes, VSHFLILNXV HOUHQGH]GpVH KDWiUR]]D PHJ $ QDJ\ vonalakban ovoidnak mondható VHMWWHVW FVDN HJ\LN ROGDOL IHOV]tQpUO HUHGQHN GHQGULWHN$IGHQGULWHNNLLQGXOy W U]VHL rendkívül vastagok, 8-10 µpiwppum&hn$ghqgulwhnohixwivdglyhujioyluiq\wyhv]iho pv HEEHQ D] LUiQ\EDQ IXWQDN WRYiEE D IGHQGULWHNEO HUHG PiVRGODJRV pv WRYiEEL dendrit ágak is. A neuron dendrit elágazódási mezeje így szokatlan alakú térséget zár EHpVOHJLQNiEEQDJ\RYRLGDODS~W OFVpUV]HU&WpUVpJKH]KDVRQOtWKDWyDiEUD$] yulivqhxurqvhmwwhvwpeoxj\dqlvdkrvv]whqjho\hluiq\iqdnphjihohohqlqgxoqdn ki a dendritek, viszont a hossztengely - rendszerint - dorso-ventralis irányban helyezkedik el. $ GHQGULW ijdn D VHMWWHVWWO W EEQ\LUH ROGDOW DODNtWMiN NL D] HOiJD]yGiVL WpUVpJHW $ GHQGULWIDHOiJD]yGiVLWpUVpJpQHND]DODSMDLVRYRLGDODN~$]iWPpUMHKRsszirányban 4-500 µm-w LV NLWHV] $ GHQGULW HOiJD]yGiV U YLGHEE iwppumpw DPL D PHWV]HWHN YDVWDJViJiUDHVLNFVDNPHJN ]HOtWOHJOHKHWHWWPHJPpUQL*\DNUDEEDQLPSUHJQiOyGWDN illetve kerültek egy-hj\ PHWV]HWEH HJ\HV GHQGULWHN (]HN My OHKHWVpJHW Q\~MWRWWak a dendritek elágazódásának és a dendrit ágaknak a megfigyelésére. Általában a dendritek felszínét kisebb-nagyobb kiemelkedések teszik egyenetlenné, sok nyúlvány, és ritkán W VNpNLVWDOiOKDWyNUDMWXN$SULPHUGHQGULWHNN O QE ]KRVV]~ViJ~DN$YDVWDJDbb másodlagos és harmadlagos dendritek lefutása egyenes, de a vékonyabb dendritek számos, kisebb-nagyobb görbületet is kialakíthatnak, miközben az elágazódásra MHOOHP] I LUiQ\W PHJWDUWMiN $ GHQGULW Q\~OYiQ\RN pv W VNpN D PiVRGODJRV GHQGULWHNWO NH]GGHQ IRUGXOQDN HO PpUVpNHOW J\DNRULViJJDOGH D NLVHEE ijdnrqd GHQGULWID SHULIpULiMiQ HJ\UH QDJ\REE V&U&VpJJHO WDOiOKDWyN $ GHQGULWHN KRVV]D D] eredés és a végág egyenes távolságát mérve 300-400 µm-ig is kiterjedhet. A neuron axonjának az eredését és a proximalis szakaszát néhány esetben sikerült megfigyelnünk. $]D[RQDVHMWWHVWEOMyONLIHMOHWWHUHGpVL-kúppal ered. Az eredési-kúpon és az axon igen rövid proximalis szakaszán kis kiemelkedések és tüske-v]hu&nps]gppq\hnwdoiokdwyn (19. b ábra). Nagy neuronok képezik a projekciós neuronok másik csoportját. A nagy méret HOVVRUEDQ D VHMWWHVW KRVV]~ iwppumpuh pv D QHXURQ GHQGULWMHLQHN D] HOiJD]yGiViUD YRQDWNR]LN$VHMWKRVV]~HORQJiOWVHMWWHVWWHOUHQGHONH]LNDKRVV]~iWPpUMH 35 µm, 30
a rövid jóval kevesebb, 18 20 µp3ulqflsdolvghqgulwmhldvhmwwhvwhonhvnhq\hgypjh felé eltoltak. Dendritfája az óriás sejtéhez hasonlóan alakul ki, dendritjei szinte azonosan ágazódnak el. Principalis, secunder és további dendritjeinek a lefutása, eloszlása adja a nagyqhxurqmhoohp]pruiroyjldlphjmhohqpvpw8j\dqfvdnmhoohp]d neuronra az elhelyezkedése, amit a Golgi preparátumokban viszonylag ritkán sikerült megfigyelnünk: sejtteste az óriás neuronok sejtteste alatt, vagy szorosan mellette helyezkedik el. Dendritjei többé-kevésbé párhuzamosak az óriás sejt dendritjeivel. A QDJ\QHXURQGHQGULWiJDLQLVWDOiOKDWyNU YLGHEEpVKRVV]DEEQ\HO&W VNpNpVN O Q V konfigurációkat kialakító nyúlványok (18. a, b, c ábra). A két neuron típus párhuzamos elhelyezkedése - amelyben a dendritek szinte átfedik egymást tüskéikkel és nyúlványaikkal - rendkívül fontos, speciális topográfiai viszonyt teremt az opticus rostok terminálisainak a fogadására (20. d ábra). A közép-nagy neuronok multiangularis vagy elongált sejttesttel rendelkeznek és mindenütt megtalálhatók a nlmmc-ehq GH IOHJ D QDJ\ VHMWHN N UQ\H]HWpEHQ $ PXOWLDQJXODULV VHMWWHVW& QHXURQQDN PLQGHQ LUiQ\EDQ KDVRQOy PpUHW& iwppumh YDQ amely 25-26 µp KRVV]~ViJ~ $]HORQJiOW QHXURQRNQDN D KRVV]~ iwppumh -24 µm, rövid átppumh -16 µm. A neuronok kevés (3-4) dendritet bocsátanak ki. A primer dendrit törzsek között vastagabb és vékonyabb dendritek is találhatók (3-5 µm). A dendritek bifurcatioval oszlanak, felszínük egyenetlen, kevés nyúlvány található rajtuk. Dendritjeik általában a mag hossztengelyében helyezkednek el. Axonjuk csak ritkán LPSUHJQiOyGRWWpVV]LQWHNLYpWHOQpON OD]HJ\LNSULPHUGHQGULWEOLQGXOWNLUHQGV]HULQW dorsalis irányba futott. A local circuit neuronokfvrsruwmiedwduwr]qdndnlvvhmwwhvw&ryrld neuronok, amelyek viszonylag jobban impregnálódtak. Sejttestük 12-17 µp iwppum& pv -4 GHQGULW HUHG EHOOH $ GHQGULWHN KRVV]DVDQ OHJW EEV] U YpJ]GpV NLJ N YHWKHWN hullámos lefutásúak, itt-ott varicositások találhatók rajtuk. Kevés bifurcatioval töuwpq elágazódás látható a dendriteken, viszont több nagyon vékony mellékágat bocsátanak ki, amelyek tüskések. Egyéb helyeken a dendritek ritkán tüskések, ezek a tüskék különösen KRVV]~Q\HO&HN$VHMWD[RQMDD]HJ\LNGHQGULWEOHUHGpVU YLGV]DNDV]XWiQ elágazódik (21. ábra). Az axon lokális elágazódása alapján sorolható a neuron a local circuit neuron csoportba. 31
5.2.2. Post-embedding GABA immunhisztokémia eredménye a nucleus lentiformis mesencephali magnocellularis-ban (nlmmc) GABA-pozitív sejtek fén\plnurv]nysrv WDQXOPiQ\R]iViUD HONpV]tWHWW metszeteken GABA immuno-jelzett és GABA-negatív sejteket lehetett találni a nlmmc-ben. A GABA immuno-mho]hwwvhmwhndpdjhjpv]whu OHWpQHOIRUGXOWDN(]HN a sejtek kis és közép-qdj\ PpUHW&HNYROWDN(EEO D]WD következtetést lehet levonni, hogy a kis GABA-SR]LWtY VHMWHN D]RQRVDN D NLV PpUHW& ORFDO FLUFXLW QHXURQRNNDO $ közép-nagy sejtek közül az elongált projekciós neuronok szintén GABA-pozitív sejtek. A közép-nagy GABA pozitív sejtek között található volt olyan alakú is, amelyik hasonlít a multiangularis neuronhoz. Ebben az esetben a közép-nagy sejtek mindkét csoportja GABA-pozitívnak bizonyul. A GABA immuno-jelzett metszetekben GABApozitív dendritek részletei és kisebb GABA-pozitív szemcsék, rostok illetve thuplqiolvrnlvhoirugxowdndeieud 5.2.3. Biotinilált dextran aminnal (BDA) jelzett opticus rostok fénymikroszkópos vizsgálata nucleus lentiformis mesencephali magnocellularis-ban (nlmmc) A nervus opticusba történt BDA beadása után, a diencephalon-mesencephalon határán felszálló jelölt opticus rostok jelentek meg, amelyek a tractus opticusból kilépve, a mesodiencephalicus határon felszálltak a nucleus lentiformis mesencephali magnocellularisba. A jelölt opticus rostok kötegeket képezve, egymással párhuzamosan haladva futottak ventro-dorsalis irányba. Már a rostkötegek között megjelentek kisebbnagyobb varicosus preterminális és terminális ágak, amelyek az opticus rostokból a ventralis régióban léptek ki (23. ábra). A magba belépve rostok, preterminális szakaszok, terminálisok és terminális bulbusok helyezkedtek el csoportokban. A WHUPLQiOLVRN MyO OiWKDWy I UWV]HU& DODN]DWEDQ LV PHJMHOHQWHN -5 terminális bulbusból kialakulva. Az opticus rostok, preterminálisok és a terminális bulbusok csoportjai szinte körülírták, kirajzolták a nlmmc-t. 32
5.2.4. Elektronmikroszkópos megfigyelések a biotinilált dextran aminnal (BDA) jelzett opticus rostok kapcsolatairól kiegészítve az eljárást GABA-gold immunhisztokémiával a nucleus lentiformis mesencephali magnocellularis-ban (nlmmc) A jelzett opticus rostok ventro-dorsalis lefutása bizonyos tájékozódási OHKHWVpJHW Q\~MWRWW D] HOHNWURQPLNURV]NySRV PHJILJ\HOpVHNQpO 1HPFVDN D URVWRN OHIXWiVDKDQHPDEHOO NOHiJD]yGySUHWHUPLQiOLVRNpVWHUPLQiOLVRNIpQ\PLNURV]NySRV ismerete is megkönnyítette a tájékozódást, a rendezettség felismerését. A rostok az HOHNWURQPLNURV]NySRVSUHSDUiWXPRNEDQN O QE ]KRVV]~ViJ~V]DNDVV]DOMHOHQWHNPHJ (24. ábra). A magba belépve mind a jelzett mind a nem-jelzett rostokon megjelentek az RUVyV]HU&PHJYDVWDJRGiVok, varicositások, amelyek synapticus vesiculát tartalmaztak. A kerek synapticus vesicula tartalmú varicositások aszimmetrikus synapsisokat képeztek kis és nagy dendrit-profilokkal, dendrit-nyúlványokkal és dendrittüskékkel. A rostok intervaricosus szakaszán a neurofilamentek hosszában synapticus vesicula VRUR]DWWDOiOKDWy0LQGHQ WWDPDJEDQGHOHJV&U&EEHQDFHQWUDOLVUpV]HQMHOHQQHNPHJ csoportosan az opticus rostok terminális bulbusai. Hasonlóan a fénymikroszkópban megfigyelt csoportosuláshoz, 3-5 bulbus kapcsolódik egy-egy csoportba. A mag HOHNWURQPLNURV]NySEDQ PHJILJ\HOKHW V]HUNH]HWH PHJOHKHWVHQ V]DEiO\WDODQ PH]NUH szigetekre oszlik. Myelinhüvelyes rostok átfutó kötegei, nagy dendrit profilok, soma részletek, és kisebb dendrit szakaszok együtt határolják ezeket a viszonylag nagy PH]NHWDPHO\HNWRYiEELNLVHEEPH]NUHV\QDSWLFXVDUHDN-ra tagolódnak (25. ábra). A kis synapticus areak területén többnyire jelzett és nem-jelzett opticus terminálisok (nagy, kerek synapticus vesicula tartalmú terminálisok) találhatók, amelyek aszimmetrikus synapsisokat képeznek dendrit profilokkal, tüskékkel és processusokkal (26. ábra). Az opticus terminálisokon kívül lapos, vagy pleomorph YHVLFXOiW WDUWDOPD]y WHUPLQiOLVRN LV HOIRUGXOQDN NLVHEE V]iPEDQ DPHO\HN szimmetrlnxvv\qdsvlvrndwnpsh]qhnn O QE ]NLVGHQGULWSURILORNNDOiEUD A synapticus areak perifériás részén több szimmetrikus synapsis látható. Ezek a SHULIpULiQ HOKHO\H]NHG V\QDSVLVRN N ]ps-nagy és nagyobb dendritek profiljaihoz is kapcsolódnak, és többnyire opticus terminálisok synapsisai mellett találhatók. Ezeket a V\QDSWLFXVNDSFVRODWRNDWQHPIHGLJOLDQ\~OYiQ\$SRVWV\QDSWLFXVNpSOHWHNIHOWHKHWHQ 33
a nagy és közép-qdj\ VHMWHN GHQGULWMHL GHQGULW SURFHVVXVDL pv W VNpL (]HN MHOOHP] tulajdonsága, mind a nagy, mind a kisebb dendrit profilok esetén, hogy általában YLOiJRVDNNHYpVPLWRFKRQGULXPRWpVPLFURWXEXOXVWWDUWDOPD]QDN9LV]RQWHOIRUGXOQDN kis, vékony dendrit profilok, néha hosszabb szakaszokkal, amelyekben több mitochondrium és sok microtubulus látható. Ezek a dendritek bizonyos szakaszokon pleomorph synapticus vesicula tartalmúak, amelyek a tubulusok hosszában, azok között helyezkednek el. Ezeket a dendriteket dendraxonnak tartjuk, és szimmetrikus synapsisokat létesítenek dendrit profilokkal (28. ábra). GABA immunogold módszerrel kezelt preparátumokban a vékony, sötétebb plazmájú dendrit profilok GABA-pozitívnak bizonyultak, csakúgy, mint a pleomorph YHVLFXOD WDUWDOP~ GHQGUD[RQRN 0LQGNHWWUO IHOWpWHOH]] N KRJ\ D *$%$-pozitív, Golgi II. típusú neuron deqgulwmhl(]hndghqgulwhniohjdv\qdswlfxvph]nshulipuliv részén helyezkednek el. A lapos synapticus vesiculát tartalmazó GABA-pozitív WHUPLQiOLVRN QHPFVDN D PH]N SHULIpULiMiQ KDQHP FHQWUiOLVDEE KHO\]HWEHQ LV HOIRUGXOQDN pv V]LPPHWULNXV NDSFVRODWRt létesítenek mind GABA-pozitív mind GABA-negatív somákkal és dendritekkel is (29., 30. ábra). A nlmmc-ban GABA-pozitív myelinhüvelyes rostokat (31. ábra) is sikerült megfigyelnünk. A rostok elágazódása a magban ugyan nem volt látható, de tekintettel az övv]hn WWHWpVHNVRNUpW&VpJpUHpVDIL]LROyJLDLHUHGPpQ\HNUHIHOWpWHOH]] NKRJ\H]HN DP\HOLQK YHO\HVURVWRNLVDPDJEDQYpJ]GQHN 34
6. A KUTATÁSI EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE 0XQNiQNFpONLW&]pVHDPDGDUDNMiUXOpNRVRSWLFXVPDJMDLQDNEHOVV]HUNH]etét NLDODNtWy QHXURQiOLV HOUHQGH]GpV pv HKKH] V]RURVDQ NDSFVROyGy RSWLFXV URVWRN YpJ]GpVHLQHN D WDQXOPiQ\R]iVDYROW0DGiUEDQ NpW QHYH]HWHV MiUXOpNRV RSWLFXV PDJ YDQ D GLHQFHSKDORQEDQ HOKHO\H]NHG QXFOHXV EDVDOLV WUDFWXV RSWLFL Q%25 LOOHWYH D diencephalon és mesencephalon latero-rostralis összenövésénél, a pretectumban HOKHO\H]NHG QXFOHXV OHQWLIRUPLV PHVHQFHSKDOL PDJQRFHOOXODULV Q/0PF (]HN D PDJRN D] RSWRNLQHWLFXV Q\VWDJPXV YpJUHKDMWiViEDQ MiWV]DQDN DODSYHW V]HUHSHW $ PDJRNEHOVV]HUNH]HWpQHND]HOHP]pVHHOVVRUEDQDUUDLUiQ\XOWKRJ\PHJLVPHUM ND magok szerkezetét alapjában létrehozó neuronális elemeket és afferensük (az opticus URVWWHUPLQiOLVYpJ]GpVpW0DMGNHUHVW ND]RNDWDQHXURQiOLVNDSFVRODWRNDWDPHO\HN mindkét magot képessé teszik D]RQRV RSWLFXV LQIRUPiFLy WRYiEEtWiViUD N O QE ] N ]HOLpVWiYROLHIIHUHQVUpJLyNEDIHOWpWHOH]KHWHQFROODWHUDOLVRNYDJ\N O QE ]WtSXV~ SURMHNFLyV QHXURQRN D[RQMD VHJtWVpJpYHO $ EHOV V]HUNH]HW YL]VJiODWD D]W D FpOW LV szolgálta, hogy feltárjuk, milyhqpruiroyjldlohkhwvpjhndodnxowdnnljiwoyndsfvrodwrn létrehozására az ellenoldali BOR és LMmc magok között. A madárban végzett fiziológiai kísérletekben ugyanis ismertté váltak az ellenoldali azonos maggal való gátló és az azonos oldali két mag közöttl VHUNHQW NDSFVRODWRN $ EHOV V]HUNH]HW tanulmányozása kiterjedt az opticus ingerület-átvitel modulációját szolgáló neuronális elemekre és kapcsolataik elemzésére is. $ YL]VJiODWRN HOV OpSpVHNpQW D *ROJL LPSUHJQiFLy N O QE ] YDULiFLyLW alkalmaztuk, a OHKHWOHJMREEOHJDONDOPDVDEESUHSDUiWXPHOQ\HUpVHFpOMiEyO$KRJ\D] HUHGPpQ\HNEO LVNLW&QLN D *ROJL SUHSDUiWXPRN WDQXOPiQ\R]iVD DODSYHW IRQWRVViJ~ YROW H]HNEHQ D PDJRNEDQ LV $ I DIIHUHQWiFLyW NpSH] RSWLFXVURVWRN HOiJD]yGiViW D magokban, valamint az opticus terminálisok jellegzetes formáit, elhelyezkedését BDA axonkövetéses módszerrel készült anyagon tanulmányoztunk. A neuronok funkcionális típusainak elkülönítésére GABA immunhisztokémiát is alkalmaztunk, amely a GABApozitív és GABA-negatív neuronrn HON O QtWpVpW WHWWH OHKHWYp $ IpQ\PLNURV]NySRV eredményeket elektronmikroszkópos preparátumok tanulmányozásával egészítettük ki. A preparátumokat GABA immunogold eljárással is kezeltük. 35
.RUiEEL WXGRPiQ\RV HUHGPpQ\HNEO LVPHUHWHV D] RSWLFXV URVWRN YpJ]GpVH D járulékos opticus magokban (Brecha és mtsai 1978; Brecha és Karten 1980; Britto és mtsai 1981; Gioanni és mtsai 1983; Wylie 2001). Számos tanulmány eredményei igazolták a nbor és a nlmmc efferens összeköttetéseit a szem mozgásait irányító motoros központokkal és a vestibulo-fhuhehooxppdo $]RQEDQ D PDJRN EHOV VWUXNWXUiOLV HOUHQGH]GpVH fény- és elektronmikroszkópos szinten is - teljesen LVPHUHWOHQPDUDGWDNHYpVVHMWIHVWpVLHOMiUiVVDONpV] OWSUHSDUiWXPQ\~MWRWWDLVPHUHWWO eltekintve. Madárban a magok Golgi architecturájáról alig jelent meg egy egy közlemény, valójában ezek is jelentéktelen eredményt mutató próbálkozások. Erre magyarázatul V]ROJiOKDWD]LPSUHJQiFLyNLV]iPtWKDWDWODQViJiEyOHUHGEL]RQ\WDODQViJ0DJ\DUi]KDWy még azzal is, hogy a magok régiói impregnáció szempontjából különösen nehezen KR]]iIpUKHWN YDOyV]tQ&OHJ D J\HQJpEE YpUHOOiWiVXN PLDWW 6DMiW NpV]tWPpQ\HLQN VHP az ideális Golgi impregnációs eredményt demonstrálják, de talán sikerült megtalálnunk a legfontosabb strukturális V]HUNH]HWL HOUHQGH]GpVW D] DQ\DJDLQNEDQ 9DOyV]tQ&OHJ további sikeres - sikeresebb - LPSUHJQiFLyN PpJ NLHJpV]tW DGDWRNDWV]ROJiOWDWKDWQDN ezen a területen is. A Golgi impregnáció eredményei az említett nehézségek ellenére - rendkívül fontos informáclywq\~mwrwwdndq%25pvq/0pfvwuxnwxuiolvhouhqgh]gpvpuon O Q V tekintettel a további morfológiai kísérletek eredményeinek funkcionális értékelése V]HPSRQWMiEyO$SURMHNFLyVQHXURQRNW EEWtSXVDEL]WRVtWMDDOHKHWVpJHWDN O QE ] régiókkal létesíthqg NDSFVRODWRNKR] $ N O QE ] WtSXV~ SURMHNFLyV QHXURQRN HJ\PiVKR] YLV]RQ\tWRWW HOKHO\H]NHGpVH SHGLJ OHKHWYp WHV]L KRJ\ PLQGHJ\LN WtSXV ugyanazoktól a terminálisoktól kapjon az opticus információt. (18. ábra) Nagyon YDOyV]tQ& KRJ\ H]HN D PRUIROyJLDL DGRWWViJRN WHV]LN OHKHWYp D V]HP pv D IHM-nyak HJ\ WWHVP&N GpVpWD]D]QDJ\EDQKR]]iMiUXOQDNDNRRUGLQiOWV]HPpVIHMPR]JiVRNKR] Mindkét járulékos opticus mag rostokkal izoláltan található a környezetében. A nbor-ban a nagy és közép-nagy projekciós neuronok distalis, tüskés dendritjeiken keresztül kerülnek egymással szoros topográfiai kapcsolatba. Ezt a területet hálózzák be az opticus rostok terminálisai, ahogy ez az elektronmikroszkópos vizsgálatokból HJ\pUWHOP&HQ EL]RQ\tWiVW Q\HUW $] LVOiWKDWy D] ultrastruktúra tanulmányozása során, hogy az opticus terminálisok szinte teljesen beborítják az egymás mellett szorosan 36
HOKHO\H]NHG GHQGULW ijdndw *$%$-pozitív terminálisok nem találhatók közéjük pnhogyh tj\ D GLVWDOLV GHQGULW V]DNDV]RN PLQGHQIpOH PRGXláció nélkül összegezni képesek a befutó opticus információt. A proximalis dendrit szakaszok feladata a nbor- EDQIHOWpWHOH]KHWHQDPRGXOiFLyD*$%$-SR]LWtYV\QDSVLVRNN ]UHP&N GpVpYHO A nlmmc-ehqeiupivwrsrjuiildlhouhqgh]gpvehqghv]lqwpqphjwdoioható a nagy projekciós neuronok dendritjeinek szoros topográfiai elhelyezkedése és együttes NDSFVRODWL OHKHWVpJH D] RSWLFXV URVWRNNDO ieud $ NpW PDJ EHOV NDSFVRODWUHQGV]HUpW PpJ WRYiEEERQ\ROtWMD D MyYDO NLVHEE PpUHW&SURMHNFLyVQHXURQRN jelenléte a magokat alkotó neuronok dendritfáinak területén, és az a tény, hogy ezek között GABA-pozitív neuronok is találhatók. Ezek a neuronok biztosítják a közvetlen ellenoldali gátlást. A fiziológiai eredmények bizonyítják, hogy a horizontális és a vertikális n\vwdjpxv OHERQ\ROtWiViEDQ NRPSOH[ HJ\ WWP&N GpV YDQ D NpW PDJ N ] WW DPLKH] KR]]iMiUXO D] D]RQRV ROGDOL PDJRN N ]WL VHUNHQW pvd] HOOHQROGDOL PDJJDO IHQQiOOy JiWOy NDSFVRODW *LRDQQL pv PWVDL $ UHQGNtY O ERQ\ROXOWQDN W&Q kapcsolatrendszer kialakxoivikr]ntvpuohwlhuhgppq\hlqneon YHWNH]HQDPRUIROyJLDL HOUHQGH]GpVNHOODODSRWQ\~MW 6.1. A nucleus basalis tractus opticiben (nbor) kapott eredmények összefoglalása A nbor QDN MHOHQWV V]HUHSH YDQ D V]HPPR]JiVRNKR] NDSFVROyGy optokinetikus nyvwdjpxvypjuhkdmwiviedqd]hj\lnhd]~j\qhyh]hwwmiuxopnrvrswlnxv PDJRNQDNDPHO\DEHpUNH]RSWLFXVLQJHUHNIHOGROJR]iVDDODSMiQWXGEHNDSFVROyGQLD NLHJpV]tWV]HPPR]JiVRNEDDV]HPSRQWRVEHiOOtWiViED)URVWpVPWVDL%ULWWRpV mtsai 1981; Burns és Wallman 1981; McKenna és Wallman 1981; Wylie és mtsai $ PDJ I DIIHUHQWiFLyMD D UHWLQD NLKHO\H]HWW JDQJOLRQ VHMWMHLEO V]iUPD]LN $ nbor közvetlen összeköttetésben van a vestibulo-cerebellummal és ezen keresztül a vestibulo-ocularis és vestibulo-spinalis reflexekkel (Ito és mtsai 1973). Ahhoz, hogy a PDJ WHYpNHQ\VpJpW MREEDQ PHJpUWV N D WiYROL NDSFVRODWRN PHOOHWW D EHpUNH] DIIHUHQVHN pv D NLPHQ DYpJUHKDMWy HIIHUHQVHN PDJRQEHO OLNDSFVRODWUHQGV]HUpWLV 37
V] NVpJHV PHJLVPHUQL )HOWHKHWHQ D PDJ EHOV VWUXNWXUiOLV HOUHQGH]GpVH MHOHQWV szerepet játszik az opticus információ feldolgozásában. $ PDJ EHOV V]HUNH]HWpQHN WDQXOPiQ\R]iVD VRUiQ D N YHWNH] MHOHQWV eredményeket találtuk: 1. Golgi preparátumok elemzése után a nbor-ban projekciós és local circuit QHXURQRNDW N O QtWHWW QN HO $ NpW DODSYHW QHXURQ WtSXV HON O QtWpVH D] axonok elágazódási helye alapján történt lokálisan elágazódó axonú local circuit neuronokra, és távoli összeköttetéseket létrehozó projekciós neuronokra. 2. A projekciós neuronok perikaryonjának a nagysága, valamint dendritfájuk NLWHUMHGpVHDODSMiQWRYiEELNpWFVRSRUWUDN O QtWKHWNHOQDJ\pVN ]ps-nagy neuronokra. Ezek a neuronok a mag ismert összeköttetései alapján IHOWHKHWHQ N O QE ] N ]SRQWRNNDO V]HPPR]JDWy PDJRN YHVWLEulocerebellum, nlmmc, ellenoldali nbor) állnak kapcsolatban. 3. A két projekciós neuron dendrit terminálisai azonos területen ágazódnak el és interdigitálnak egymással kialakítva a dendritikus fészkeket. Így a N O QE ] WtSXV~ SURMHNFLyV QHXURQRN XJ\DQD]RQ opticus rostoktól NDSKDWQDN YL]XiOLV LQIRUPiFLyW GHQGULWMHLN YpJV HOiJD]yGiVDLQDN KHO\]HWH alapján. Ez a morfológiai tény biztosíthatja ugyanazon opticus ingerület HJ\LGHM&WRYiEEtWiViWDN O QE ]N ]SRQWRNEDiEUD 4. $SURMHNFLyVQHXURQRNYpJVGHQGULWHOiJD]yGiVDLQDNDODSYHWMHOHQWVpJpW D]DGMDKRJ\IHOV]tQ NHWV]LQWHWHOMHVPpUWpNEHQRSWLFXVURVWRNYpJ]GpVHL ERUtWMiN(]DIXQGDPHQWiOLVMHOHQWVpJ&NDSFVRODWUHQGV]HUD%'$-val jelzett opticus terminálisok és a terminális dendrit szakaszok synapticus kapcsolataiból derül ki, elektronmikroszkópos metszeteken. 5. $ORFDOFLUFXLWQHXURQRNV]LQWpQNpWWtSXVUDN O QtWKHWNHOPRUIROyJLiMXNpV elhelyezkedésük tekintetében: kis, ovoid és elongalt, illetve kis fusiformis neuronokra. Mindkét típus GABA-pozitívnak bizonyult. Axon terminálisaik D SURMHNFLyV QHXURQRN GHQGULWMHLQ YpJ]GQHN V]LPPHWULNXV V\QDSVLVRNDW képezve. 38
6. Myelinhüvelyes GABA-pozitív afferens rostok találhatók a magban, amelyek a nbor-edq HOiJD]yGYD YDOyV]tQ&OHJ D SURMHNFLyV QHXURQRN dendritjein vpj]gqhn 7. A lokális, illetve az afferens GABA-pozitív rostok terminálisai kétfélék: lapos illetve pleomorph vesicula tartalmú GABA-pozitív terminálisok, DPHO\HNDSURMHNFLyVQHXURQRNGHQGULWMHLQYpJ]GQHN(]HNDWHUPLQiOLVRN legtöbbször a dendritelágazódásoknál találhatók meg. A principális dendritek eredésénél csak lapos vesicula tartalmú, GABA-pozitív terminális található. 6.2. A nucleus lentiformis mesencephali magnocellularis-ban (nlmmc) talált eredmények összefoglalása A nlmmc fiziológiai eredményekkel igazoltan a horizontális nystagmusért IHOHOV MiUXOpNRV RSWLFXV PDJ $ Q%25-UDO HJ\ WWP&N GYH D V]HP SRQWRV EHiOOtWiViW KDMWMiN YpJUH )DIIHUHQWiFLyMiWN ]YHWOHQ ORSWLFXVURVWRNYpJ]GpVHNpSH]L(]HND URVWRNDUHWLQDJDQJOLRQVHMWMHLEOLQGXOQDNki (Brecha és mtsai 1980; Simpson 1984; McKenna és Wallman 1985). A mag több irányú összeköttetését - funkciójának PHJIHOHOHQ - számos efferens pálya biztosítja. Kapcsolata van a vestibulocerebellummal, VI., VII., VIII. kisagyi foliummal, nucleus pontis lateralissal, tectum opticummal és az ellenoldali nbor-ral (Clarke 1977; Brecha és mtsai 1980; 0F.HQQDpV:DOOPDQ$N O QE ]LUiQ\~ VV]HN WWHWpVHNPHJYDOyVtWiViWDPDJ EHOV VWUXNWXUiOLV V]HUYH]GpVH NpSHV RO\ PyGRQ EL]WRVtWDQL KRJ\ D PDJEyO NLIXWó HIIHUHQVHN D]RQRV LQIRUPiFLyW V]iOOtWVDQDN D N O QE ] WHU OHWHNHQ HOKHO\H]NHG HIIHFWRU N ]SRQWRNED $ EHOV VWUXNWXUiOLV V]HUYH]GpVQHN H]W D OHKHWVpJHW EL]WRVtWy WpQ\H]LWD*ROJLDUFKLWHFWXUDLVMHO]LpVDWRYiEELV]HUNH]HWLV]LQWHNWHOMHVHQYLOiJRssá teszik. $ Q/0PF EHOV V]HUNH]HWpQHN WDQXOPiQ\R]iVD VRUiQ D N YHWNH] ~M eredményeket találtuk: 1. A nucleus lentiformis mesencephali-ban (nlmmc) a Golgi preparátumok tanulmányozása során projekciós és local circuit neuronokat különítettünk el. 39
A projekciós neuronok távoli összeköttetéseket, a local circuit neuronok magon belüli kapcsolatokat hoznak létre. 2. A nlmmc-ben a továbbiakban óriás (giganto-cellularis), nagy és közép-nagy projekciós neuronokat sikerült elkülönítenünk a Golgi készítmények alapján. 3. Az óriás és a nagy projekciós neuronok szoros topográfiai kapcsolatban helyezkednek el: a nagy projekciós neuronok sejtteste az óriás neuronok sejtteste alatt, vagy szorosan mellette helyezkedik el, dendritjei többé-kevésbé párhuzamosak az óriás sejt dendritjeivel, szinte fedve, érintkezve velük. Ez a topográfiai viszony az afferens opticus rostok lehetséges kapcsolatai V]HPSRQWMiEyO MHOHQWV PHUW tj\ OHKHWVpJ Q\tOLN DUUD KRJ\ NpW SURMHNFLyV neuron ugyanazt a vizuális információt kapjon. (32. ábra) 4. A közép-nagy projekciós neuronok között további két altípus található: PXOWLDQJXODULV pv HORQJiOW VHMWWHVWWHO UHQGHONH] QHXURQRN $] HORQJiOW projekciós neuronok között GABA-pozitív sejteklvhoirugxoqdndpho\hnpiv központokban (például az ellenoldali nlmmc-ben) gátlást hozhatnak létre, ezt a kapcsolatot fiziológia kísérletek eredményei bizonyították. 5. A Golgi preparátumokban kerek vagy ovoid alakú local circuit neuronok is láthatóak voltak, amelyek GABA-pozitívnak bizonyultak. Feltételezzük, hogy a rövid axonú, GABA-pozitív neuronok a magban, lokálisan modulálják az ingerület átvitelt. 6. %'$ SiO\DN YHW DQ\DJJDO MHO OW N D] RSWLFXV URVWRNDW 0HJILJ\HOW N D rostok lefutását, elágazódását és terminálisaikat. Az opticus rostok kis N WHJHL FVRSRUWRVDQ W P U O WHUPLQiOLV EXOEXVRNDW KR]QDN OpWUH A WHUPLQiOLVRN MyO OiWKDWy I UWV]HU& DODN]DWEDQ is megjelentek 3-5 terminális bulbusból kialakulva. Egy-egy opticus rosthoz számos terminális együttes tartozik. 7. Elektronmikroszkópos vizsgálatok kimutatták, hogy a jelzett és nem-jelzett opticus rostok terminálisai, valamint GABA-erg terminálisok synapticus szigeteket képeznek, GABA-pozitív dendritekkel, vastag, GABA-negatív dendritekkel és rostokkal határolva. A GABA-pozitív dendritek között synapticus vesicula tartalmú dendrit, azaz dendraxon is található. Az opticus rostok aszimmetrikus synapsisokat képeznek a dendritekkel, dendrit- 40
nyúlványokkal és tüskékkel. Gyakran csatlakozik hozzájuk GABA-pozitív terminális szimmetrikus synapsissal. ASHULIpULiQ HOKHO\H]NHGSOHRPRUSK synapticus vesicula tartalmú dendraxon, ugyancsak szimmetrikus synapsisokat képez GABA-negatív dendritekkel. 41
7. KÖVETKEZTETÉSEK Fiziológiai kutatások bizonyították, hogy a nbor és a nlmmc aodsyhwihodgdwd az optokinetikus nystagmus generálása, amely a szem kompenzáló mozgásaival VWDELOL]iOMDDOiWRWWNpSHW DUHWLQiQ(]WDIXQNFLyWHJ\UpV]WDPDJRNEHOVPRUIROyJLDL szerkezete (amit jelen munkánkban vizsgáltuk fény és elektron mikroszkópos szinten), PiVUpV]W D N O QE ] LUiQ\~ VV]HN WWHWpVHLN WHV]LN OHKHWYp *ROJL NpV]tWPpQ\HNHW tanulmányozva kimutattuk, hogy mindkét magban a projekciós neuronok két típusa V]RURV WRSRJUiILDL YLV]RQ\EDQ YDQ HJ\PiVVDO (] D WRSRJUiILDL NDSFVRODW OHKHWVpJHW biztosit ugyanazon terminálisok fogadására. Az opticus rostok lefutása és terminális bulbusaik elhelyezkedése következtében, ahogy ezt a BDA-val végzett megfigyeléseink mutatják: azonos opticus rostok, azonos terminálisai jutnak el a projekciós neuronok két WtSXViKR] $] HOHNWURQPLNURV]NySRV V]LQW& YL]VJiODWRN PHJHUVtWLN D NDSFVRODWRN OpWUHM WWpW (]DWRSRJUiILDLYLV]RQ\ IXQNFLRQiOLVMHOHQWVpJ& XJ\DQLV tj\ XJ\DQD] D] RSWLFXV LQIRUPiFLy MXWKDW HO D V]HP PR]JiVDLW LUiQ\tWy N O QE ] KHO\HNHQ WDOiOKDWy idejuhqgv]huln ]SRQWRNEDpViEUD$]HGGLJLNXWDWiVLHUHGPpQ\HNEOWXGMXN KRJ\ D Q%25 D N YHWNH] KHO\HNUH N OGL D] HIIHUHQVHLW D] RFXORPRWRULXV PDJRN D trochlearis magok, a cerebellum hátsó lebenye (folia IX c, d, X, paraflocculus, flocculus), az oliva inferior, a vestibularis magok, a nucleus interstitialis (Cajal), az ellenoldali nbor, az azonos oldali nlmmc. A nlmmc pedig a cerebellumhoz (vestibulocerebellum és folia VI, VII, VIII.), a nuclei pontoshoz, az oliva inferiorhoz, az azonos oldali nbor-hoz és az ellenoldali nlmmc-hez küld rostokat. A nlmmc-nek az HOOHQROGDOL/0PFPDJJDOJiWOiVWHUHGPpQ\H] VV]HN WWHWpVHYDQKDVRQOyDQDQ%25 PDJMiKR] YLV]RQW D] D]RQRV ROGDOL Q%25 PDJJDO VHUNHQW NDSFVRODWD ioo IHQQ Fiziológiai kísérletek eredményeit morfológiai adatokkal támasztják alá azok az eredményeink is, amelyek a GABA-pozitív projekciós neuronok jelenlétét mutatják ki, IHOWHKHWHQD]HOOHQROGDORQNLDODNXOyJiWOiVRNOpWUHKR]iViUD(]DJiWOiVNRQWUROOiOMDD] HOOHQNH]LUiQ\~RSWRNLQHWLNXVQ\stagmust. 0RVW KRJ\ MHOHQ PXQNiQNEDQ PHJLVPHUW N D Q%25 pv D Q/0PF EHOV szerkezetét, ami alkalmassá teszi a magokat azokra a funkciókra, amelyeket a fiziológusok írtak le, a továbbiakban szeretnénk részletesen kivizsgálni a magok és az 42
említett központrn N ] WWL VV]HN WWHWpVHNHW 7HUYH]HWW PXQNiQN VRUiQ D N YHWNH] kérdésekkel foglalkoznánk: 1. A nbor és a nlmmc egymással való kapcsolata. 2. Mindkét mag kapcsolata a motoros agyideg magokkal. 3. A nbor és a nlmmc kapcsolata a cerebellummal és az oliva inferiorral. 4. Mindkét mag kapcsolata a vestibularis magokkal. $ NLW&] WW NpUGpVHN WLV]Wi]iViUD D NLHPHOW N ]SRQWRN N O QE ] *ROJL NpV]tWPpQ\HLW WDQXOPiQ\R]QiQNSiO\DN YHWYL]VJiODWRNDWYpJH]QpQNpV*$%$LPPXQKLV]WRNpPLiW alkalmaznánk fény és elektron mikroszkópos szinten. 43
8. MAGYAR ÉS ANGOL NYELV%g66=()2*/$/Ï A járulékos opticus magok szerkezete csirkében A járulékos opticus rendszer (AOS) könnyen azonosítható a gerincesek minden RV]WiO\iEDQN O Q VHQRWWDKRONLHPHONHGDOiWyUHQGV]HU. Az AOS egy jól elkülönült RSWLFXV N WHJJHO pv D MiUXOpNRV RSWLNXV PDJRNNDO MHOOHPH]KHW 0DGDUDNEDQ D] $26- hoz két mag tartozik: nucleus basalis tractus optici (nbor) és a nucleus lentiformis mesencephali magnocellularis (nlmmc). Fiziológiai kísérletek kimutatták, hogy a nbor és a nlmmc szerepet játszanak az optokinetikus nystagmusban (OKN), ami stabilizálja a szemmozgásokat illetve összehangolja a szem és a nyak mozgásait. A számtalan eredményes kutatás ellenére kevés adat van a madarak nbor és nlmmc belvv]hunh]hwpuodpho\hnv] NVpJHVHNDKKR]KRJ\PDJ\DUi]DWRWDGMDQDNEL]RQ\RV P&N GpVLMHOHQVpJHNUH pv HJ\~WWDONLHJpV]tWVpNPRUIROyJLDLLVPHUHWHLQNHW(]pUWMHOHQ PXQNiQNEDQDNpWPDJEHOVV]HUNH]HWpWDQHXURQRNPRUIROyJLDLMHOOHP]LWWtSXVDLWpV kapcsolataikat az opticus rostokkal) tanulmányoztunk csirkékben (Gallus Domesticus) IpQ\ pv HOHNWURQ PLNURV]NySRV V]LQWHQ D N YHWNH] PyGV]HUHN VHJtWVpJpYHO *ROJL LPSUHJQiFLy *$%$ LPPXQKLV]WRNpPLDSiO\DN YHWELRWLQLOiOWGH[WUDQDPLQ%'$ A nbor Golgi impregnációs készítményeit elemezve megfigyeltük a két, IHOWpWHOH]KHWHQSURMHNFLyVQHXURQVDMiWViJRVGHQGULWIiMiW$NpWIpOpSURMHNFLyVQHXURQ GHQGULWMHLQHN D YpJV HOiJD]yGiVDL D]RQRV WHU OHWHQ M QQHN OpWUH pv LWW LQWHUGLJLWiOYD egymással dendritikus fév]nhnhwdodntwdqdnnl$ghqgulwwhuplqiolvrndudmwxnypj]g RSWLFXV URVWRNNDO V\QDSWLFXV PH]NHW NpSH]QHN $ V\QDSWLFXV PH]N P&N GpVpW GABA-SR]LWtYWHUPLQiOLVRNV]DEiO\R]]iNDPHO\HNQHNNHWWVHUHGpV NYDQHJ\UpV]WD local circuit neuronok axonjaiból, másrészt az afferens myelinhüvelyes rostokból származnak. A nlmmc Golgi impregnációs készítmények vizsgálata során: óriás, nagy, közép-qdj\pvnlvppuhw&qhxurqrndwn O QE ]WHWW NPHJ$]yULiVpVQDJ\SURMHNFLyV neuronok szoros topográfiai viszonyban helyezkednek el, dendritjeik többé-kevésbé párhuzamos lefutásúak, szinte fedik egymást. Köztük találjuk az opticus rostok HOiJD]yGiVDLWpVWHUPLQiOLVDLW$VHMWHNP&N GpVpW*$%$LPPXQR-pozitív terminálisok V]DEiO\R]]iN DPHO\HN N O QE ] ORFDO FLUFXLW QHXURQRkból, illetve GABA-erg myelinhüvelyes rostokból erednek. A GABA-erg myelinhüvelyes rostok IHOWpWHOH]KHWHQD]HOOHQROGDOLQ/0PF-ból és/vagy a vizuális Wulst-ból származhatnak. 44
The structure of the accessory optic nuclei in the chick The accessory optic system (AOS) is readily identifiable in all classes of vertebrates with prominent visual systems. The AOS is characterized by a distinct retinal projection and a group neurons, the accessory optic nuclei. In birds, the AOS includes two nuclei: the nucleus of the basal optic root (nbor), and nucleus lentiformis mesencephali magnocellularis (nlmmc). Physiological studies indicated a role for nbor and nlmmc in the optokinetic nystagmus (OKN) that is the stabilization of eye movements, and the coordination of eye and neck movements. Despite numerous advances, however, many details of the morphology of accessory optic nuclei, which seem to be important in the understanding of certain functions and in completing our knowledge of morphology are still unknown. Therefore, in this study the intrinsic organization (the morphology of the different types of neurons, and their relationship with the optic fibers) of two nuclei was investigated in chick (Gallus Domesticus) by light and electron microscopy with different methods: Golgi impregnation, GABA immunostaining, biotinylated dextranamine (BDA) tracing. In the Golgi analysis of nbor a characteristic dendritic ramification pattern of two types of putative projection neurons was observed. The projection neurons form with their overlapping dendritic terminal sections dendritic nests that develop synaptic fields with the optic fiber terminals. GABA-immunopositive terminals which derives from small and/or elongated local circuit neurons, and from myelinated afferent fibers synapse with distinct loci of the dendritic trees of projection neurons; they may therefore play an important role in the inhibitory-modulatory system of the nbor. In the nlmmc Golgi preparations neurons of large, medium-large, medium and small sizes were distinguished. The large and medium-large projection neurons are located in a tight topographical relationship. The dendrites of the large and medium-large cells are also observed to be in close proximity with each other, and also with retinal fiber terminals. The function of these cells modulated by the GABAimmunopositive terminals from various local circuit neurons, and most probably from GABAergic myelinated fibers as well, which may originate from the contralateral nlmmc and/or the visual Wulst. 45
9. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Munkám során számtalan segítséget kaptam, amit ezúttal szeretném megköszönni.. V] QHWHW V]HUHWQpN PRQGDQL WpPDYH]HWPQHN 'U 7 PE O 7HUp] 3URIHVVRU Emeritusnak, aki bevezetett a kutatómunka rejtelmeibe. Még tudományos diákkörös hallgatóként kerültem a laboratóriumába, azóta nagy tudásával, tapasztalatával, fáradhatatlan munkájával és számtalan tanáccsal vezeti, és folyamatosan segíti a PXQNiPDW $ EHOOH iudgy HQHUJLD D PXQND LUiQWLDOi]DW pv ioodqgy PRWLYiFLy QDJ\ KDWiVVDOYROWUiPpVPLQGLJHUWDGRWWDPLNRUHJ\-egy sikertelen kísérlet után kezdtem elkeseredni és feladni az egészet. Hálás vagyok Németh Andreának, a laboratóriumunk szakasszisztensének, aki bevezetett a laboratóriumi munka rejtelmeibe. Megtanított a precíz és tiszta labormunkára, az ábrák szerkesztésére és mindvégig mindenben készségesen segített. Köszönöm Dr. Alpár Alánnak, a laboratóriumunk munkatársának a sok szakmai segítségét. Dr. Eyre Marknak köszönöm a cikkek angolságának javításában nyújtott segítségéért. 1DJ\RQVRN Q]HWOHQVHJtWVpJHWNDSWDP+RUYiWK3pWHUQp7HULNpWODPLWH]~WWDO is köszönöm. 'HiN6]LOYLiQDNN V] Q PDNLYiOyP&WpWLDVV]LV]WHQFLiWpVVRN-sok segítséget a perfúzióknál. Köszönöm Kiss József intézeti fotósnak az igényes fotók elkészítését. Prof. Dr. Réthelyi Miklósnak, a Szentágothai János Idegtudományi Doktori,VNRODYH]HWMpQHNpVD]$QDWyPLD6] YHW-pV)HMOGpVWDQL,QWp]HWYROWLJD]JDWyMiQDN köszönöm a mindenkori támogatást és biztatást. Köszönöm Prof. Csillag Andrásnak az Anatómia, Szövet- pv )HMOGpVWDQL Intézet igazgatójának és az Összehasonlító neurohisztológiai és neurocitokémiai ODERUDWyULXP YH]HWMpQHN D WiPRJDWiViW pv D ODERUDWyULXP PXQNDWiUVDLQDN ÈGiP Ágotának, Bálint Eszternek, Dr. Mezey Szilviának, Dr. Montagnese Catherinenak, Dr. 6]pNHO\ $QGUHiQDN 6]iV],VWYiQQp 0DUFVLQDN =DFKDU *HUJQHN D VRN EDMWiUVL segítséget a madáragy kutatásában. 46
'U 3DONRYLWV 0LNOyV 3URIHVVRU (PHULWXVQDN D 3K' SURJUDP YH]HWMpQHN N V] Q PDVRNpUGHNHVpVKDV]QRV3K'HODGiVWDPHO\HNEOUHngeteget tanultam. Köszönöm Bárány Annának, intézeti könyvtárosának, a sok segítségét. Szabó Istvánné Marikának és Tóth Ferencné Kánai Juditnak szeretném megköszönni a sok segítséget a hivatalos ügyek intézésében. Köszönöm az Anatómia, Szövet- pv )HMOGpVWani Intézet valamennyi dolgozójának a sok segítséget, támogatást és azt a barátságos és családias légkört, amelyben öröm dolgozni. És végül, de nem utolsó sorban köszönöm a családomnak: Szüleimnek és Testvéreimnek a türelmüket, támogatásukat és azt a sok-srnv]huhwhwdpho\eoqdsplqw QDSHUWPHUtWKHWHN 47
10. Á B R Á K 48
1. ábra: A nucleus basalis tractus optici (nbor) helyzetét bemutató ábra (Kuenzel WJ 2002). A mag a diencephalon ventralis felszínén, a tractus opticus medialis széléhez csatlakozik. 2. ábra: A nbor részeit bemutató sémás rajz. (Brecha és mtsai 1980). TrO: tractus opticus; nbor: nucleus basalis tractus optici; nbord: nucleus basalis tractus optici, pars dorsalis; nborl: nucleus basalis tractus optici, pars lateralis 49
3. ábra:6ppivudm]dq%25 VV]HN WWHWpVHLUO%UHFKDpVPWVDL BCP: brachium conjunctivum cerebellopetale; BOR: basal optic root; DGC: kihelyezett ganglion sejtek; GCL: stratum ganglionare; INL: stratum granulosum internum; IPL: stratum plexiforme internum; IS: nucleus interstitialis (Cajal); nbor: nucleus basalis tractus optici; ONL: stratum granulosum externum; OPL: stratum plexiforme externum; OMdl: nucleus nervi oculomotorii, pars dorsolateralis; OMv: nucleus nervi oculomotorii, pars ventralis; Pfl: paraflocculus; RA: stratum neurofibrare; RL: stratum neuroepitheliale 50
4. ábra: A nucleus lentiformis mesencephali magnocellularis (nlmmc) helyzetét bemutató ábra (Kuenzel WJ 2002). A mag a mesodiencephalicus régióban található a tectum opticum szürke állományától és a nucleus lentiformis mesencephali parvocellularistól (nlmpc) medialisan és a nucleus rotundustól (nrot) lateralisan. 51
5. ábra: Sémás rajz a nbor-ban található négy neuron-típusról, Golgi készítmény alapján. 1 = nagy projekciós neuron; 2 = közép-nagy projekciós neuron; 3 = kis local circuit neuron; 4 = kis ovoid/fusiformis neuron. $MREEIHOVVDURNEDQDQ%25IpQ\PLNURV]NySRVIHOYpWHOHOiWKDWy M = medialis; L = lateralis; V = ventralis 52
6. ábra: A nbor Golgi struktúrája, camera lucida rajz. 1 = nagy projekciós neuronok; 2 = közép-nagy projekciós neuronok; 3 = kis local circuit QHXURQRN $ SURMHNFLyV QHXURQRN GHQGULWMHLQ GHQGULWW VNpN pvw VNHV]HU& Q\~OYiQ\RN láthatók. A dendrittüskék a dendrit terminális részén (dtv&u&qkho\h]nhgqhnho$nlv local circuit neuronok (3) dendritjei ritkán tüskések. ax = axon 53
7. ábra: Camera lucida rajz egy nagy projekciós neuron terminális dendrit szakaszáról (Golgi készítmény). Az ábra bal oldalán a dendritek terminális részei ( ) láthatók, PHO\HNDSUHWHUPLQiOLVGHQGULWEOprt d) ágazódnak el. Az ábra jobb oldalán nagyobb nagyítással a nyúlványok és tüskék (Î) láthatóak a terminális dendriteken. dt = dendrit terminális A fénymikroszkópos felvételen két dendrit terminális elágazódása (Î) látható egymás mellett. 54
8. ábra: Golgi impregnált nbor készítmény fénymikroszkópos felvétele. Az a és b képen a nagy (1) és közép-nagy (2) projekciós neuronok láthatók. A cnpshqv&u&ghqgulwlnxvkioyî) látható a nbor lateralis részében. 55
9. ábra: GABA immunhisztokémiával készült nbor preparátum fénymikroszkópos felvétele. a: GABA immuno-negatív neuron (Î) látható. b: GABA immuno-pozitív dendrit profilok (d) és kis, kerek axon terminálisok (t) láthatók. 56
10. ábra: Camera lucida rajz a nbor-edqypj]g%'$-jelölt opticus rostokról (OF) és opticus rostok terminálisairól (t). M = medialis; L = lateralis; D = dorsalis 57
11. ábra: Elektronmikroszkópos felvétel egy nagy projekciós neuron somajáról (S). A képen két fajta terminális látható: t fs = lapos vesiculát tartalmazó terminális; t ps = pleomorph vesiculát tartalmazó terminális. Mind a két típusú terminális szimmetrikus szinapszist (Î) alkot a nagy projekciós neuron somajával. 58
12. ábra: Elektronmikroszkópos felvétel a nbor-ról. a: NDJ\ SURMHNFLyV QHXURQ HOVGOHJHV GHQGULWMH OiWKDWy $ ODSRVYHVLFXOiWWDUWDOPD]y terminális (t fs) szimmetrikus synapsist (Ö) létesít egy dendrit eredésével (d). = gap junction b: BDA-jelzett opticus terminális (OT) aszimmetrikus synapsist (Î) képez egy kis local circuit neuron GABA immuno-pozitív dendritjével. y LPPXQRJROGV]HPFVpN 59
13. Ábra: Elektronmikroszkópos felvételen (a, b V\QDSWLFXV PH]N OiWKDWyN GHQGULW terminálisokkal (dt), dendrit nyúlványokkal (dp), valamint BDA-jelölt és jelöletlen opticus terminálisokkal (OT). Számtalan aszimmetrikus synapsis (Î) látható. d = dendrit 60
14. ábra: Elektronmikroszkópos felvételen a BDA-jelölt opticus terminálisok és egy kis local circuit neuron somája (S) közötti aszimmetrikus synapsisok (Î) láthatók. 61
15. ábra: Elektronmikroszkópos felvétel a nbor-ról. a: A nagy és közép-nagy dendritek (d) körül opticus terminális (OT) és több GABA immuno-pozitív (d 2 ) dendrit (terminális) van jelen. y *$%$LPPXQR-pozitív terminálisok synapsisai b: Kis dendrit (d) látható több opticus terminálissal (OT) és GABA immuno-pozitív terminálissal (y 62
16. ábra: Elektronmikroszkópos felvétel a nbor-ról. a: Pleomorph vesicula tartalmú terminális (t ps) szimmetrikus synapsist (Ö) képez egy kis dendrittel (d), illetve a BDA-jelölt opticus terminális (OT) és a kis dendrit közötti synapsis(î) is látható. b: Lapos vesiculát tartalmazó terminális (t fs) látható kis dendriten (d). Itt is látszanak az opticus terminális (OT) és a kis dendritek (d) közötti synapsisok (Î). 63
17. Ábra: Elektronmikroszkópos felvétel egy GABA immuno-pozitív myelinhüvelyes rostról (mf) a nbor-ban. 64
18. Ábra: Magyarázó sémás rajz a nbor-ban található synapticus kapcsolatokról. a: Sémás rajz a nagy (1) és a közép-nagy (2) projekciós neuronokról és a ritkán tüskés GHQGULW&NLVORFDOFLUFXLWQHXURQUyO3). Az opticus rostok (OF) elágazódása piros, a kis local circuit neuronok axon elágazódása (ax) kék, a GABA immuno-pozitív Ö myelinhüvelyes rost (mf) elágazódása zöld. Számos opticus terminális ( ) synapsist DONRWDSURMHNFLyVQHXURQRNGHQGULWMHLYHOpVGHQGULWWHUPLQiOLVDLYDOV\QDSWLFXVPH]NHW hozva létre (Î; ). Ugyanaz az opticus terminális még a kis local circuit QHXURQRNVRPDMiQpVGHQGULWMHLQLVYpJ]GLN ¾ = a myelinhüvelyes rostok terminálisai; Î = a kis local circuit neuron axon terminálisai b: A projekciós neuron distalis preterminális és terminális dendritszakaszát mutatja be. Az opticus terminálisok (OT), a pleomorph vesicula tartalmú terminálisok ( ) és lapos vesiculát tartalmazó terminálisok (x) synaptizálnak a dendrit szakaszokkal. A színkód megegyezik az a. ábráéval. 65
19. ábra: Golgi impregnált nlmmc készítmény fénymikroszkópos felvétele. a: Egy óriás projekciós neuron (ln) látható szinte teljesen impregnálódott dendritfával. A dendritek lefutása divergáló. Jól látható a dendritek elágazódása, amely követi a IGHQGULWHN OHIXWiVL LUiQ\iW (]iowdo D] yuliv SURMHNFLyV QHXURQ GHQGULW HOiJD]yGiVL mezeje nagy, ovoid alapú, tölcséuv]hu&wpuvpjhw]iuehsn = kis neuron b: Egy óriás projekciós neuron (ln) nagyobb nagyítással, axonja (axdvhmwwhvweomyo kifejlett eredési-n~ssdolqgxonl3ur[lpdolvv]dndv]iqnlvnlhphonhgpvhnpvw VNHV]HU& NpS]GPpQ\HN WDOiOKDWyN $ SULPHU GHQGULWek (d) proximalis szakaszai is láthatók. A dendritek felszínén kisebb-qdj\reeq\~oyiq\rnpvulwniqw VNHV]HU&NpS]GPpQ\HNLV HOIRUGXOQDN D = dorsal, V = ventral 66
20. ábra: Golgi impregnált nlmmc készítmény fénymikroszkópos felvétele. a: Egy óriás (1) és egy nagy (2) projekciós neuron közti topográfiai viszony látható. A nagy projekciós neuron az óriás neuron mellett helyezkedik el. Dendritjei többé-kevésbé párhuzamosak az óriás sejt dendritjeivel, szinte fedik egymást. D = dorsalis, V = ventralis b, c: Az óriás (1) és nagy (2) projekciós neuronok nagyobb nagyítással. A dendritjeiken (d) kisebb-nagyobb nyúlványok, tüskék egyaránt találhatók. d: Az óriás és nagy projekciós neuronok dendritjei (d 1, d 2 ) nagyobb nagyítással. A dendritek szinte átfedik HJ\PiVW(]]HOOHKHWYpYiOLND]KRJ\XJ\DQD]D]RSWLFXVURVW YpJ]GM QUDMWXN d 1 = óriás projekciós neuron dendritje, d 2 = nagy projekciós neuron dendritje, = a dendritek átfedik egymást 67
21. ábra: Camera lucida rajz a nlmmc-ben található közép-nagy és kis neuronokról. A közép-nagy neuronok multiangularis (1) és elongált (2 VHMWWHVW&HN $[RQMXN ax) FVDNULWNiQLPSUHJQiOyGLNiOWDOiEDQDSULPHUGHQGULWEOd) indul ki és rövid távolságon N YHWKHW$NLVORFDOFLUFXLWQHXURQRN3) dendritjei (d) tüskések. A sejt axonja (ax) az HJ\LNGHQGULWEOHUHGpVDVHMWWHVWN ]HOpEHQiJD]yGLNHO 68
22. ábra: GABA immunhisztokémiával készült nlmmc preparátum fénymikroszkópos felvétele. a, b: A felvételen elongált közép-nagy ( ) és kis ovoid local circuit (Î) GABA immuno-pozitív neuronok láthatók. Ö GABA immuno-negatív sejt 69
23. ábra: A nlmmc-ehq YpJ]G %'$-val jelölt opticus rostok fénymikroszkópos felvétele. Jól láthatók a jelölt opticus rostok (of) és terminálisaik (ot). 70
24. ábra: nlmmc elektronmikroszkópos felvétele. A két nyíl (Î) között BDA-val jelölt opticus rostok lefutása látható. Az elektronmikroszkópos preparátumon az opticus rostok mint N O QE ] KRVV]~ViJ~ profil szakaszok jelennek meg. Az opticus rostoktól oldalt egy nagy dendrit (d) látható. 71
25. ábra: A nlmmc elektronmikroszkópos felvételén BDA-val jelölt opticus terminálisok (œ) által kialdntwrwwv\qdswlfxvph]oiwkdwydnpwq\toî) között. d = dendrit 72
26. ábra: A BDA-YDO MHO OW RSWLFXV URVWRN iowdo NLDODNtWRWW V\QDSWLFXV PH] HJ\ részének elektronmikroszkópos felvétele. A BDA-val jelölt (t 1 ) és jelöletlen (t 1* ) opticus terminálisok aszimmetrikus synapsisokat (Î) képeznek. GABA immuno-pozitív, gátló terminálisok (t 2 ) szimmetrikus synapsisokat ( KR]QDN OpWUH $ V\QDSWLFXV PH]W *$%$ LPPXQR-pozitív dendraxonok (da) veszik körül. A dendraxonok lapos synapticus vesiculat tartalmaznak. 73
27. ábra: A nlmmc elektronmikroszkópos felvételén a BDA-val jelölt opticus terminálisok láthatók (t 1 ), amelyek aszimmetrikus synapsisokat (Î) képeznek kis dendritekkel (d). 74
28. ábra: A nlmmc elektronmikroszkópos felvételén BDA-val jelölt opticus terminális (t 1 ) aszimmetrikus synapsist (Î) képez egy dendraxonnal (da). Egy GABA immunopozitív terminális (t 2 ) pedig szimmetrikus synapsist ( ) hoz létre egy kis dendrittel (d). 75
29. ábra: A nlmmc elektronmikroszkópos felvételén GABA immuno-pozitív terminális (t 2 ) látható, amely lapos synapticus vesiculát tartalmaz, és egy óriás neuron sejttestével (ln) szimmetrikus synapsist ( ) képez. 76
30. ábra: A nlmmc elektronmikroszkópos felvételén egy GABA immuno-pozitív terminális (t 2 ) látható, amely szimmetrikus synapsist ( ) képez egy nagy GABA immuno-negatív dendrittel (d). 77
31. ábra: A nlmmc elektron mikroszkópos felvételén ferdén áthalad egy GABA immuno-pozitív myelinhüvelyes rost (mf). Ezen kívül egy kis GABA immuno-pozitív terminális (t 2 ) is látható, amely lapos synapticus vesiculát tartalmaz. 78
32. ábra: Sémás rajz az óriás (fekete, ln) és a nagy (zöld, mln) projekciós neuronok illetve opticus rostok (piros, OF) és ezek terminálisai (ot) közti topográfiai viszonyról. A nagy projekciós neuron (mln) az óriás sejt (ln) alatt helyezkedik el. Dendritjei többékevésbé párhuzamosak az óriás sejt dendritjeivel, szinte fedik egymást. A két projekciós QHXURQ V]RURV YLV]RQ\D OHKHWVpJHW Q\~MW XJ\DQD]RQ RSWLFXV WHUPLQiOLVok (ot) IRJDGiViUD (] D WRSRJUiILDL YLV]RQ\ IXQNFLRQiOLV MHOHQWVpJ& XJ\DQD] D] RSWLFXV LQIRUPiFLy MXWKDW HO D V]HP PR]JiVDLW LUiQ\tWy N O QE ] KHO\HNHQ WDOiOKDWy idegrendszeri központokba a két projekciós neuron axonjain keresztül. 79