AZ sirns TERÁPIÁS ALKALMAZÁSÁBAN REJLŐ LEHETŐSÉGEK ÉS KIHÍVÁSOK DOJCSÁKNÉ KISS-TÓTH ÉVA 1

Egészségtudományi Közlemények, 3. kötet, 2. szám (2013), pp. 39 48. AZ sirns TERÁPIÁS ALKALMAZÁSÁBAN REJLŐ LEHETŐSÉGEK ÉS KIHÍVÁSOK DOJCSÁKNÉ KISS-TÓTH ÉVA 1 Összefoglalás: Napjainkban egyre gyakrabban találkozhatunk az RNS interferencia mechanizmusát közvetítő dupla szálú kis RNS-ek terápiás alkalmazására való törekvésekkel. A géncsendesítés alkalmazása megoldást hozhat számos súlyos megbetegedés gyógyításában, mint például antivirális, degeneratív neurológiai problémák, dominánsan öröklődő genetikai rendellenességek, fájdalomterápiás és rákterápiás eljárásokban. A kis RNS-ek célzott alkalmazása azonban számos problémát vet fel, melyre ma már különféle szállító rendszerek kifejlesztésével próbálnak megoldást találni a kutatók. A kis RNS-ek célzott sejtbe juttatására talán leginkább alkalmasak a lipoid rendszerek, melyekkel kiküszöbölhető a rövid keringési idő, az immunrendszer aktivációja vagy a toxicitás. Jelenleg is számos kis RNS alapú terápiás szer van klinikai kipróbálási fázis alatt. Kulcsszavak: géncsendesítés, dupla szálú kis RNS, lipoid szállító rendszer, rákterápia, klinikai kipróbálás. 1. Bevezetés Az emberi örökítő anyag, a DNS szekvenciájának megfejtését követően a genom jelentős részét funkció nélkülinek vélték a kutatók. A róluk átíródó hírvivő ribonukleinsavakat (RNS) éppen ezért funkció nélküli, melléktermékként keletkező molekulákként tartották számon. A 90-es évek végén azonban egy áttörő felismerésnek köszönhetően a megváltozott szemléletmód átformálta a kis RNS-ek családjáról alkotott nézeteket. Az RNS interferencia jelenségét legelőször növényekben figyelték meg, a mechanizmus leírása ezt követően Fire munkásságának köszönhetően honosodott meg a genetika legújabb vívmányaként. Coenorhabditisben végzett kísérletei során igazolta, hogy a mesterségesen bejuttatott dupla szálú kis RNS molekulák (sirns) poszt-transzkripciós géncsendesítést idéztek elő, hatástalanítva azokat a hírvivő RNS molekulákat, melyekkel homológ szekvenciát hordoztak [1]. A jelenség pontos mechanizmusa ma már részleteiben jól ismert, és mivel egy természetes körülmények között előforduló folyamatról van szó, jó eséllyel alkalmazható terápiás eszközként jöhet számításba számos olyan betegségben, amelyek genetikai rendellenességre vezethetőek vissza. 2. RNS interferencia alkalmazásának főbb területei A kis RNS-ek közvetítette géncsendesítés a biológiai alapkutatásokban már rutinszerűen alkalmazott technika a gének szerepének tanulmányozásában, jelátviteli útvonalak feltérképezésében, betegségmodellek létrehozásában. A humán gyógyászatban is egyre nagyobb a törekvés a hatékony és biztonságos géncsendesítéses terápia kidolgozására. A terápiás alkalmazás területe sokfélék, de a leggyako- 1 Miskolci Egyetem Egészségügyi Kar, Nanobiotechnológiai és Regeneratív Medicina Tanszék, Miskolc

40 Dojcsákné Kiss-Tóth ribb felhasználása antivirális, degeneratív neurológiai problémák, dominánsan öröklődő genetikai rendellenességek, fájdalomkutatás és rákterápiás eljárásokban figyelhető meg. A mono- és poligénes megbetegedésekben a homológiai azonosságon alapuló sirns terápia teljes specifikussága révén a hibás gént/géneket képes megcélozni és lecsendesíteni. Még nagyobb szelektivitás érhető el, ha a géncsendesítő szakasz a mutációban szerepet játszó egyetlen nukleotidot érintő polimorfizmusra (SNP) irányul. A mesterségesen bejuttatott sirns így a szelektív degradáció révén csak azt a transzkriptumot hatástalanítja, mely hordozza a mutációt, míg a vad típusú transzkriptum érintetlen és működőképes marad annak ellenére, hogy a kettő között mindössze egyetlen nukleotid eltérés van [2]. Vírusinfekciókban való alkalmazásra leginkább Hepatitis és HIV ellenes in vitro kísérletekről olvashatunk. A vírusok gyakori mutációi miatt a szelektivitás elvesztése jelentős problémát okozhat. Ennek kivédésére ezért az sirns-t nem a HIV vírus fehérjéit kódoló régió ellen tervezik, hanem a fertőzéshez szükséges egyik koreceptora (CCR5) ellen. A CCR5 csendesítése a vírus infekciós képességének gyengülését eredményezte [3]. Az RNS interferencia rákterápiás alkalmazásának három fő vonulata lehetséges: 1.; Angiogenezist gátolnak a tumor képződése során azáltal, hogy a VEGF jelátviteli útvonalat gátolják, 2.; Gátolhatják a tumorsejtek túlélését apoptózis indukció révén, 3.; vagy a Multi- Drog Rezisztencia 1 (MDR1) specifikus gátlás révén elősegítik a radio- és kemoterápia hatékonyságát [4, 5]. 3. Az sirns terápiás alkalmazása, nehézségek a sejtig való eljuttatásban 3.1. Az sirns természetéből adódó alkalmazási nehézségek A mesterségesen előállított és sejtbe juttatni kívánt 21 30mer sirns- ek végső célhelye a kezelni kívánt sejtek citoplazmája. Bár az sirns-nek csupán a sejteket határoló membránon kell átjutnia, még napjainkban is nagy kihívást jelent ennek a megoldása. A csupasz sirns-ek önmagukban kevésbé stabil molekulák, vérbe juttatva fél életidejük mindössze néhány percre tehető a nukleázok hasító tevékenysége miatt. Kémiai tulajdonságaikból adódóan negatív felszíni töltéssel rendelkeznek, ami gyengíti a szintén negatív töltésű sejtmembránhoz való kihorgonyzási képességüket és a spontán bejutást. A kis méretükből adódóan szisztémás s beadásukat követően hamar kiválasztódnak a véráramból a vese filtráció útján. Ezeket a tulajdonságokat alapul véve kezdetben magas dózisú módosítatlan csupasz sirns-t juttatattak a sejtekbe közvetlen hidrodinamikus injektálás útján [6], azonban ez nem hozott megfelelő géncsendesítő hatást. Másik mechnaikus bejuttatási módszerként alkalmazható az elektroporáció (1. ábra), melynek során elektromos térben a sejtek membránjában keletkező pórusokon át jutnak be a kis dupla szálú molekulák. A korábbihoz hasonlóan ez a módszer sem jelentett tökéletes megoldást. Csupasz sirns-ek bejuttatását célzó eljárás a kémiai módosítás. A folyamattal a ribóz gyűrűn található 2 -OH csoportot helyettesítik -F, -O-Me vagy -H csoportok hozzáadásával [7], ekkor a stabilitás növekszik, de a módosítás nem befolyásolja a molekula hatékonyságát. Másik lehetőség a kémiai módosításra az, amikor az sirns vázához foszforotiolát csoportot kötnek [8]. Az így keletkezett sirns ellenállóbb a nukleázokkal szemben és növekszik a véráramban töltött fél életideje is. Továbblépést jelentett a csupasz sirns-ek különféle molekulákkal képzett biokonjugátumainak létrehozása, mely részben a stabilitás növelését, részben pedig a cél-

Az sirns terápiás alkalmazásában 41 zott bejuttatást segítették elő. Az sirns lipofil (koleszterol, E-vitamin) anyagokkal való konjugálása kezdetben sikereket hozott, javította a sejtbe jutást, és viszonylag hosszan fennmaradt az sirns hatása. A sejt penetrációs peptidek (CPP) sirns-hez való kötésével célzott sejtbe juttatást biztosítottak. A PEG-siRNS konjugátumok pedig megnövelték az sirns keringésben eltöltött idejét, meggátolták azok aggregációját, illetve a plazmafehérjékhez való kikötődésüket. Az antitestekkel konjugált sirns-ek szintén egy célzottabb szállítást biztosítanak, és segítenek kivédeni az immunrendszer aktiválását. Sejttípus specifikus szállítást értek el az aptamer (módosított oligonukleotidok, melyek bizonyos sejtfehérjékhez szelektív affinitást mutatnak) sirns- hez való konjugálásával [9]. 1. ábra. A kis interferáló RNS molekulák bejuttatási módjainak összefoglaló ábrája. 1. Spontán RNS felvétel. 2. Hidrodinamikus injektálás. 3. Elektroporáció 4. Konjugáltumot sejt penetráló fehérje, koleszterol, antitest, aptamer tartalmazó RNS célzott bejuttatása. 5. Lipoplexek, nanorészecskék útján bejuttatott RNS. 6. Felszín módosított,,lopakodó liposzómával bejuttatott RNS. A fent leírtakból láthatjuk, hogy a csupasz sirns fizikai (membrán) és kinetikus (véráramban eltöltött rövid életidő) barriereken történő átjutást célzó eljárások nem jelentettek végleges megoldást és hatékony közvetítést.

42 Dojcsákné Kiss-Tóth 3.2. sirns szállítására alkalmas specifikus rendszerek A fizikai barrierekkel szemben hatékony szállítási módszerek nem hoztak közös megoldást az sirns védelmét, stabilitást és célzott bejuttatását illetően. Szükségessé vált olyan komplex szállító rendszereknek a kidolgozása, melyek egyszerre teszik lehetővé a fent említett folyamatokat. Az sirns negatív töltéséből kiindulva olyan pozitív töltéssel rendelkező lipid anyagokkal (Lipofectamine 2000) konjugáltatták, melyek szferikus gömbszerű partikulákká álltak össze belső terükben védett környezetet biztosítva az RNS-nek. Így keletkeztek olyan lipoplexek, melyek nettó pozitív felszíni töltése révén könnyen kötődni képesek a sejtek membránjához és klatrin vagy kaveolin függő endocitózissal felvehetőek. A komplex felszíni töltés szerepet játszik a célállomás elérésében is. Az erős anionos vagy kationos töltéssel rendelkező komplexek gyakran áldozatul esnek az immunrendszer sejtjeinek vagy a retikulo-endoteliális rendszer (RES) sejtjeinek, például a máj Kupffersejtjeinek, aminek következtében gyorsan eliminálódnak a vérből és gyakran akkumulálódnak a májban. Ennek oka lehet az, hogy opszoninok, IgM és IgG, fibronektin és C3 komplement kötődnek a csupasz lipoplex felszínére, amelyek odavonzzák a fagocitáló sejteket [10]. A RES rendszer kikerülésére sikerült megoldást találni a lipoplexek, liposzómák polietilén-glikollal (PEG) való kiegészítésével. Az így keletkező PEGilált lipid komplexek felületi töltése fedett, és az sirns is védve van az úgynevezett lopakodó liposzómákon belül, mindemellett a keringési fél életideje is megnövekedett. A véráram útján a lopakodó liposzómák eljuthatnak akár a tumorig is, ahol a kapillárisok fokozott átjárhatósága miatt könnyen juthatnak a rákos sejtek közé [11]. 3.3. Kijutás az endoszómából A kinetikai és fizikális barriereken átjutva az sirns hatás érvényesülésében van még egy kritikus lépés. A lipoid szállító rendszerbe csomagolt sirns a sejtmembránhoz történő kihorgonyzást követően felvételre kerül. A felvétel történhet fagocitózissal, makropinocitózissal, klatrin vagy kaveolin közvetíttette endocitózissal [6]. A kationos liposzómák sejtbe jutása klatrin mediált endocitózissal történik [12]. Endocitózist követően a liposzóma, endoszómába csomagoltan jut a citoplazmába. Kritikus folyamat a liposzóma illetve a benne lévő sirns endoszómából történő kijutása. Ha a folyamat valamilyen ok miatt nem következik be, akkor az sirns lebontásra kerül az endoszómában. Ha a kilépés megtörténik, akkor is kritikus szempont az, hogy a kijutó sirns-ben ne történjen semmiféle módosulás, funkcióját megtartsa. Az sirns endoszómából történő kilépésére több elmélet is született. Egyik az ionpárképzés. Ennek során a kationos liposzóma lipidjei és a negatív töltésű endoszomális lipidek szoros kapcsolatba kerülnek egymással, ionpárt képeznek. A folyamat destabilizálja a membránokat, és végső soron a lipoplex szétesését eredményezi. A folyamat segítésére gyakran alkalmaznak a lipoplex képzéshez ún. helper lipideket (DOPE, savas közegben instabillá váló PEG), melyek elősegítik a membránok fúzióját az endocitózis során, illetve az endoszómában destabilizálják a membránt [13]. Egy másik elmélet szerint a lipoplexbe épített polietilénimin (PEI) segítségével érnek el egy proton-szivacs effektust, amely védelmet biztosít az sirns-nek az endoszomális lebomlástól és elősegíti annak kijutását a citoplazmába. A polimerben található 1-, 2- és 3

Az sirns terápiás alkalmazásában 43 értékű nem-protonált amino csoportok egy pufferkapacitást biztosítanak a rendszerben, mely egyrészről megvédi az sirns-t a lebomlástól az endoszóma érési folyamatai és a lizoszómával való fúziója során. Másrészről a pufferkapacitás proton, klorid ion és víz beáramlást vált ki az endoszómában, melynek hatására az endoszóma dagadni kezd, és egy bizonyos belső nyomáson túl kiszakad. A géncsendesítő sirns sikeres kiszabadulása és citoplazmában a célhelyekhez való jutása a korábban alkalmazott magas terápiás dózis csökkenthetőségét eredményezheti, mindamellett, hogy ezáltal csökkenthetővé válnak a terápiás szerek nem specifikus mellékhatásai és citotoxikus hatásai is [4]. 4. Toxicitás és mellékhatások 4.1. Magas koncentráció és toxicitás Az sirns-ek terápiás alkalmazását a gyenge stabilitása és penetrációs képessége mellet egy másik fontos tényező is korlátozza. A mesterségesen bejuttatott szintetikus RNS-ek versenyeznek az endogén RNS molekulákkal, ami az RNS interferenciát processzáló útvonalak telítéséhez vezet, és végül toxicitást okoz. A pontos dózis megállapítása szükséges, azonban ez mégsem egyszerű feladat, hiszen a sejtekbe bejutott sirns mennyisége a sejtosztódás során folyamatosan csökken, míg eléri a küszöbdózist és hatását veszti. Sok és különböző adatot olvashatunk az irodalomban arra vonatkozóan, milyen mennyiségekben érdemes az sirns-t alkalmazni, azonban minden kísérletben vagy terápiás alkalmazás esetében figyelembe kell vennünk az célsejt típusát, az egyén egészségi állapotát és anyagcsere aktivitását. 4.2. sirns immunrendszer aktiváló hatása Fontos, alkalmazást korlátozó tényező a csupasz sirns immunrendszer stimuláló képessége is. A GU-gazdag szekvencia motívumok stimulálják a gyulladásos citokin termelést sejttípus (leginkább makrofágok és dendritikus sejtek) és szekvencia specifikus módon. Az immunstimuláló hatás adódhat a nukleinsav hosszúságából is. A 30 nukleotid hosszú szakaszok ugyanis hasonlóak a patogének nukleinsav hosszához azonnali I típusú interferon választ váltanak ki. A nukleinsav felismerésben Toll- like receptorok (TLR 7, 8, 9) játszanak fontos szerepet. Az interferon válasz hatására a sejtbe jutott hosszú nukleinsav szakaszok degradációja megy végbe majd a sejt elpusztul [14, 15]. Vannak azonban olyan eljárások, például a 2 -O-metil uridin vagy guanozin nukleotidok sirns szálakba való integrálása, mely megakadályozza az immunválasz stimulálását [16]. Érdekes megfigyelés az is, hogy a koleszterollal vagy α-tokoferollal konjugáltatott sirns sem váltott ki immunválaszt [17]. 4.3. sirns-ek nem specifikus hatásai, mellékhatások A szintetikus sirns egy sense (5-3 irányú) és egy antisense (3-5 irányú) szálból álló duplexként kerül a sejtbe, melyből a sense szál lebomlik, és az antisene szál érvényesíti géncsendesítő hatását. Bizonyos esetekben a sense szál is fennmaradhat a citoplazmában, aminek nem várt mellékhatás lesz a következménye, hiszen olyan gének is csendesítésre

44 Dojcsákné Kiss-Tóth kerülhetnek, melyek eredetileg nem voltak célzottak, de a sense szál által expressziójuk elcsökken [18]. A szállítórendszerbe csomagolt sirns-nek is lehetnek járulékos mellékhatásai. Egyrészt opszoninok tapadhatnak a szállító rendszer felszínéhez, melynek következményeként egy erős komplementer aktiváció következik be, másrészt gyulladásos citokinek nagy mennyiségű felszabadulásához vezethet (IL-6, IL-12, TNF-α). A gyulladás kivédésére már számos módosítást eszközöltek a lipoid szállító rendszerek szerkezetében, leghatékonyabbnak a gyulladásgátló molekulák lipid kettős rétegbe építése, illetve a hialuronsav tartalmú lipoid rendszerek bizonyultak [4]. In vivo sirns terápiás alkalmazás során a keringésbe juttatott nanoméretű szállító részecskék közvetlen kapcsolatba kerülnek a vér alakos elemeivel (fehér vérsejtek, vérlemezkék) és fehérjéivel (plazmafehérjék, citokinek), ami végzetes kimenetelű reakciókat indíthat be. Gyakran a folyamat kísérő jelensége a trombózis, hemolízis, plazma fehérje kicsapódás, komplement rendszer aktivációja, illetve abnormális növekedési és gyulladási faktorok szekréciója [19]. Kationos liposzómába csomagolt nuklein savak esetében megfigyeltek még vörös vértest lízist és összecsapódást is [20]. Ezek értelmében szükséges az sirns-ek olyan szállító rendszerbe való csomagolása, melyek felszíni módosítása révén a keringési- és immunrendszer számára láthatatlan úgynevezett lopakodó nanorészecskéket képeznek, és kivédik a fent említett reakciókat. További toxikus veszélyt és mellékhatások kialakulásának a lehetőségét jelentik a hordozókba csomagolt sirns gyártási folyamata során alkalmazott reagensek, anorganikus sók maradványai a rendszerben [19]. A szintetikus anyagok mesterséges bejuttatása tehát egy kétélű kard, mely magában hordozza a lehetőségeket, de a veszélyeket is. 5. Klinikai vizsgálatok alatt álló sirns terápiás szerek A fentiekben láthattuk, hogy az RNS interferencia gyógyításban való felhasználása sok nehézséget rejt magában, mégis világszerte több kutatólaboratórium dolgozik a megfelelő hordozó és terápiás szer kifejlesztésén. Számos olyan sirns terápiás készítmény létezik már, amely előrehaladott klinikai vizsgálati fázisban van (1. táblázat). Ezeknek a szereknek az alkalmazása legtöbbször intravénás formájában vagy inhalációs úton, nem célzott beviteli technikával történik. A bejuttatott sirns lehet csupasz, csomagolt vagy komplexet képző. 1. táblázat Klinikai vizsgálat alatt álló sirns-alapú terápiás szereket összefoglaló táblázat Gyártó Termék Cél gén Betegség Abott Laboratories Huntsman Cancer Inst. Vitravene (Fomivirsen) TD101 HCMV-IE2 N171K mutáció a keratin 6a génben Allegran AGN211745 VEGFR-1 Cytomegalovírus okozta retinitis Pachyonychia Congenita Időskori Makula Degeneráció Koroidalis Neovascularizáció Bejuttatási mód Injekció Intravénás Státusz Forgalomban I

Az sirns terápiás alkalmazásában 45 Duke University Hadassah Medical Org. Calando Pharm. Silence Therapeutic s AG Quark Tekmira Pharmaceuti cals Corp. National Cancer Inst. Silenseed Ltd Alnylam Proteoszomális sirna és tumor antigén RNA sirna tartalmú SV40 vektor CALAA-01 Atu027 Immunoprot e-oszóma B alegysége (LMP2, LMP7, MECL1) BCR-ABL Ribonukleot id reduktáz M2 Protein Kináz N3 QPI-1007 Caspase 2 Metasztázisos melanoma Krónikus Mieloid leukémia Szolid tumor Előrehaladott szolid tumor Krónikus Látóideg Atrophia Nem artériás Anterior Ischemias Látóideg Neuropatia Intradermális Nincs adat Intravénás IV infúzió Preklinika I fázis PRO-040201 ApoB Hiperkoleszteremia IV infúzió TKM-080301 sig12d LODER ALN-RSV01 PLK-1 KRAS Nucleokaps zid Quark I5NP p53 Quark National Taiwan University Hospital National Taiwan B4GALNT3 University sirna Hospital Opko Health, Inc. Bevasiranib VEGF Opko Health, Inc. Bevasiranib VEGF Opko Health, Inc. bevasiranib VEGF Primer és metasztatikus májrák Hasnyálmirigy tumor Respiratory Syncycial Virus Akut veseelégtelenség Intravénás Intratumor Inhaláció IV I I I5NP p53 Vesetranszplantáció IV I/I AHR sirna AHR Neuroblastoma Nincs adat Preklinika B4GALNT3 Neuroblastoma Nincs adat Preklinika Macular Degeneráció Időskori Makula Degeneráció Diabéteszes Makuláris Ödéma I II I

46 Dojcsákné Kiss-Tóth Quark Quark Sylentis, S.A. RTP801i-14 RTP801i-14 SYL040012 RTP801i-14 RTP801i-14 β2- adrenerg receptor (ADRB2) Időskori Makula Degeneráció Diabéteszes Makuláris Ödéma Intravitreal Topikális I/I I Glaucoma Szemcsepp I Több klinikai tanulmány foglalkozik az időskori makula degeneráció (AMD) sirns terápiás kezelésének lehetőségével. Az első klinikai tanulmány, mely a IIig jutott, a Bevasiranib volt, ez anti-vegf sirns-t tartalmazott. A klinikai vizsgálatokat azonban felfüggesztették, a végeredmények kétes relevanciája miatt. A későbbiekben jelentek meg a kémiailag módosított, stabilizált sirns tartalmú anti-vegf készítmények, ezek jelenleg II. vizsgálati fázisban vannak. Ezt követte egy új generációs sirns készítmény a REDD14NP. Szintetikusan előállított, kémiailag stabilizált sirns, ami más oldaláról közelíti meg az AMD kezelését [21]. Egy hipoxia indukált gént az RTP801-et specifikusan gátol, aminek szerepe van a betegség kialakulásában, és előnye, hogy a szer nem aktiválja az immunrendszert [19]. Az első, célzott bevitel alapján alkalmazott sirns terápiás szer a CALAA-01 volt. A célzott tumorsejtekhez való eljutást a formulázott partikulák felszínére kötött transzferrin linganddal érték el. Ez volt az első készítmény, amely igazolta a géncsendesítéses terápia hatékonyságát emberben. A tumorterápiában alkalmazott másik, hasonlóan hatékony génterápiás szer egy liposzómába csomagolt anti-atu027 sirns. Jelentősen csökkentette a nyirokcsomó metasztázisok mennyiségét és méretét. 2010 elején a Tekmira gyógyszergyártó cég jegyzett egy ú klinikai próbát liposzómába csomagolt anti-apob sirns készítményre. Már kezdetben sikeres eredményeket értek el általa a LDL koleszterol és ApoB fehérjeszintek csökkentésében [15, 22, 23]. Az egyetlen, jelenleg forgalomban is kapható sirns alapú humán terápiás szer a Vitravene (Fomivirsen). A készítményt AIDS betegség során kialakuló Cytomegalovírus (HCMV) okozta retinitisben alkalmazzák intravitreális formájában. 6. Összegzés Az RNS interferenciát közvetítő sirns-ek hatékony és specifikus terápiás megoldásként jöhetnek számításba a különféle genetikai, neurodegeneratív, infekciós és daganatos megbetegedésekben. Előnyük mellett azonban számos olyan tulajdonsággal rendelkeznek, mely megnehezíti alkalmazásukat. Rövid fél életideje és gyenge sejtmembrán penetrációs képessége miatt nehezen jutnak át mind a kinetikai, mind a fizikális barriereken, aminek következtében csökken a lehetséges hatásuk mértéke. Ennek kiküszöbölése érdekében a legkülönfélébb szállító rendszerek kidolgozására és optimalizálására van szükség. Fontosak azonban a sirns tartalmú szállító rendszerek biokompatibilitási vizsgálatai, hiszen nem csak a géncsendesítő molekula, hanem a szállító rendszer is előidézhet immunrendszer aktivációt, súlyosabb esetekben toxicitást. A nehézségek ellenére a jelenleg forgalomban lévő készítmény mellett már számos humán klinikai vizsgálat alatt álló terápiás szer létezik, ami reményeink szerint megoldást jelent majd jó néhány betegség kezelésére, de addig is

Az sirns terápiás alkalmazásában 47 számos, körültekintő vizsgálat elvégzésére van még szükség a biztonságos alkalmazás érdekében. Köszönetnyilvánítás A kutatómunka részlegesen a Miskolci Egyetem stratégiai kutatási területén működő Alkalmazott Anyagtudomány és Nanotechnológia Kiválósági Központ, Élettudományi Műhely közreműködésével valósult meg. Irodalomjegyzék [1] Fire, A. Xu, S Montgomery, M. K. Kostas, S. A. Driver, E. Mello, C. C.: Potent and specific genetic inteference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 1997, 391, 806 811. [2] Schwarz, D. S. Ding, H. Kennington, L. Moore, J. T. Schelter, J. Burchard, J.: Designing sirna that distinguish between genes that differ by a single nucleotide. PloS Genet 2006; 2 : 140. [3] Qin, X. F. Dong, S. A. Chen, I. S. Y. Baltimore, D. et al.: Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral- mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003; 1: 183 188. [4] Tseng, Y. C. Mozumdar, S. Huang, L.: Lipid-based systemic delivery of sirna. Adv Drug Deliv Rev, 2009; 61: 721 731. [5] Kim, B. Tang, Q. Biswas, P. S. Xu, J. Schiffelers, R. M. Xie, F. Y. et al.: Inhibition of ocular angiogenesis by sirna targeting vascular endothelial growth factor pathway genes: therapeutic strategy for herpetic stromal keratitis. Am J Pathol, 2004; 165: 2177 2185. [6] Reischl, D. Zimmer, A.: Drug delivery of sirna therapeutics: potentials and limits of nanosystems. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2009; 5: 8 20. [7] Chiu, Y. L. Rana, T.M.: sirna function in RNAi: a chemical modification analysis. RNA 2003; 9: 1034 1048. [8] Layzer, J. M. McCaffrey, A. P. Tanner, A. K. Huang, Z. Kay, M. A. Sullenger, B. A.: In vivo activity of nuclease-resistant sirnas. RNA 2004; 10: 766 771. [9] Jeong, J. H. Mok, H. Oh, Y. K. Park, T. G.: sirna conjugate delivery systems. Bioconjug Chem. 2009; 20: 5 14. [10] Popielarski, S. R. Hu-Lieskovan S. French, S. W. Triche, T. J. Davis, M. E.: A nanoparticlebased model delivery system to guide the rational design of gene delivery to the liver. 2. In vitro and in vivo uptake results. Bioconjug.Chem. 2005; 16: 1071 1080. [11] Li, S. D. Chen, Y. C. Hackett, M. J. Huang, L.: Tumor-targeted delivery of sirna by selfassembled nanoparticles. Molec.Ther. 2008; 16: 163 169. [12] Zuhorn, I. Kalicharan, R. Hoekstra, D.: Lipoplex-mediated transfection of mammalian cells occurs through the cholesterol- dependent clathrin-mediated pathway of endocytosis. J Biol Chem, 2002; 277: 18021 8. [13] MacLachlan, I.: Chapter 9. Liposomal Formulations for Nucleic Acid Delivery Ed.: Stanley, T. Crooke.: Antisense drug technologies. Principles, Strategies and Applications, Second Edition. Boca Raton, Fl. CRC Press, Taylor & Francis Group 2007, 237 262. [14] Ramon, A. L. Bertrand, J. R. Malvy, C.: Delivery of small interfering RNA. A review and an example of application to a junction oncogene Tumori, 2008; 94: 254 263. [15] Wang, J. Lu, Z. Wientjes, M. G. Au, J. L. S.: Delivery of sirna Therapeutics: Barriers and Carriers. The AAPS Journal, 2010; 4: 492 503. [16] Judge, A. MacLachlan, I.: Overcoming the innate immune response to small interfering. RNA, Hum.GeneTher., 2008; 19: 111 124.

48 Dojcsákné Kiss-Tóth [17] Nishina, K. Unno, T. Uno, T. Kubodera, T. Kanouchi, T. Mizusawa Het al.: Efficient In Vivo Delivery of sirna to the Liver by Conjugation of α-tocopherol. Molecular Therapy, 2008; 16: 734 740. [18] Jackson, A. L. Bartz, S. R. Schelter, J. Kobayashi, S. V. Burchard, J. Mao, M. et al.: Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 2003; 21: 635 7. [19] Wang, Y. Li, Z. Han, Y. Hwa, L. L. Ji, A.: Nanoparticle-Based Delivery System for Application of sirna In Vivo Current Drug Metabolism, 2010; 2: 182 196. [20] Sakurai, F. Nishioka, T. Saito, H. Baba, T. Okuda, A. Matsumoto Oet al.: Interaction between DNA-cationic liposome complexes and erythrocytes is an important factor in systemic gene transfer via the intravenous route in mice: the role of the neutral helper lipid. Gene Ther. 2001; 8: 677 86. [21] Kim, S. H. Jeong, J. H. Lee, S. H. Kim, S. W. Park, T. G.: PEG conjugated VEGF sirna for anti-angiogenic gene therapy. J Control Release., 2006; 116: 123 9. [22] Shegokar, R. Al Shaal, L. Mishra, P. R.: SiRNA Delivery: Challenges and role of carrier Systems Pharmazie, 2011; 66: 313 318. [23] Zimmermann, T. S. Lee, A. C. H. Akinc. A. Bramlage, B. Bumcrot, D. Fedoruk, M. N.: RNAi-mediated gene silencing in non-human primates. Nature 2006; 441: 111 114.