Abszorbciós spektroszkópia (Nyitrai Miklós; 2011 január 31.) A fény Elektromágneses hullám kölcsönhatása anyaggal Az abszorbció definíciója Az abszorpció mérése Speciális problémák, esetek Alkalmazások Emlékeztető Elektromágneses hullámok terjedése Emlékeztető növekvő energia távoli vörös vörös narancs sárga zöld kék ibolya UV 760nm 647nm 586nm 535nm 492nm 422nm 390nm Hogyan függ össze a frekvencia, hullámhossz és energia? A fény transzverzális elektromágneses hullám. Spektroszkópia energia (ev)* hullámhossz (nm) Snellius Descartes törvény frekvencia (Hz) hullámhossz tart. sin Θ sin Θ 1 2 n = n 2 1 Θ 1 Θ 2 n 1 n 2 sp.-i módszer *1eV = 1,602 x 10-19 J = 3,83 x 10-20 cal 1
Fényelnyelés híg oldatokban 0 Transzmittancia - transzmittancia -abszorpció fényforrás anyag detektor T = / 0 Általában százalékban (%) adjuk meg intenzitás 0 Minta (homogén) Exponenciális függvény!!! = 0 exp (-kx) vagy = 0 e -kx Megj.: hasonló a radioaktív bomlás egyenletéhez! N = N 0 exp (-λt) vagy N = N 0 e -λt távolság 0 minta Ez is exponenciális! A cél: Az abszorbció definíciója intenzitás - legyen könnyen érthető - legyen jól mérhető - legyen additív Megj: a transzmittancia (T=/ 0 ) nem additív: ha az egyik komponens átenged 30%-ot, a másik 60%-ot, akkor a kettő együtt NEM -10%-ot fog átengedni! ln(távolság) 2
A távolságfüggés más formában Miért ε(λ) és nemcsak ε? intenzitás 0 minta távolság abszorpció = 0 10 -ε(λ) c x λ (nm) Paraméterek definíciója! Az A λ függő így az ε is az kell hogy legyen! Az abszorbció definíciója Mi áll a megfigyelések hátterében? 0 A Born-Oppenheimer közelítés: Mag mozgás vs. elektron mozgás. anyag OD = A = - log ( / 0 ) = ε (λ) c x Röv.: optical density = 0 10 -ε(λ) c x Az energia felbontása Az energia felbontása E összes = E elektron + E vibrációs + E rotációs Az energia típusok nagyságrendje: Az egyes energia típusok megváltozása független. A megváltozás írható mint: ΔE elektron ~ 1,000 * ΔE vibrációs ~ 1,000,000 * ΔE rotációs ΔE összes = ΔE elektron + ΔE vibrációs + ΔE rotációs 3
Emergia séma: sávos spektrum Fotometriai mérések megvalósítása fotometriai = abszorpciós spektroszkópiai Hogyan mérjük az abszorpciót? Egy fotométer egyszerű sémája. fényforrás monokromátor minta detektor Spektrofotométer Fő komponensek: 1. Fényforrás UV fényforrás (~180-350nm): Deutérium lámpa Látható fény forrása (~350-800nm): Wolfram-izzó 2. Monokromátor: egyedi hullámhosszak kiválasztása. 3. Mintatartó: a minta és a referencia behelyezése a fényforrás és a detektor közé (küvetta: kisméretű, fényáteresztő mintatároló egység) 4. fotodetektor: PMT, dióda 5. Egyebek: lencsék, szűrők, rések. Egy és két-utas fotométerek Miért használunk referencia mintát? Fényforrás Deutérium lámpa Alacsony nyomású gázkisülési lámpa Hullámhossz tartomány: 112nm-900nm 180-370nm: folyamatos! 4
Deutérium lámpa spektruma Hidrogén spektruma a látható fény tartományában Balmer sorozat - n: x 2 410.2 nm n:6 2 (lila) 434.1 nm n:5 2 (kék) 486.1 nm n:4 2 (kék-zöld) 656.3 nm n:3 2 (vörös) Lymann sorozat n: x 1 (UV) Paschen sorozat n: x 3 (R) Wolfram lámpa Wolfram lámpa spektruma Fénykibocsátás hő hatására Just Sándor & Hanaman Ferenc 1904 Dec. 13-án elfogadott szabadalma. A Tungsram cég dobta piacra először 1905- ben Látható fény + hő (közeli R) Monokromátor Prizma Monokromatikus fény előállítására alkalmas eszköz. Típusai: Prizmás Rácsos (optikai rács) 5
A törésmutató hullámhosszfüggése A törésmutató hullámhosszfüggése n Monokromatikus fény fehér piros sárga lila λ λ Optikai rács Párhuzamosan, egymáshoz közel kialakított igen vékony rések vagy visszaverő felületek sorozata. diffrakció: a fény elhajlása az útjába eső kisméretű tárgy körül. Típusai Transzmissziós Reflexiós (osztott v. holografikus) Diffrakció (elhajlás) d sin β d sin α α α β α β d a) b) d (sinα + sin β ) = mλ Kollimátor: A széttartó fénysugarakat párhuzamossá tevő optikai berendezés. Felbontóképesség Optikai rács (λ/δλ) = m N látható fény tartományában ~ 600vonal/mm Mintatartó Küvetta: az anyagok optikai tulajdonságának meghatározásához használt üvegedény. Anyaga: Műanyag: olcsó, nem túl pontos, UV+VS. Üveg: Látható fény tartományában használható. Kvarc: UV tartományban is használható. 6
Fotodetektor Fény és egyéb elektromágneses hullám érzékelésére alkalmas eszköz. Típusok: Fényérzékeny ellenállás (LDR): az ellenállás a fény intenzitására változik. Fotodiódák: fényérzékeny félvezetők. Fotoelektron-sokszorozó: a fotokatód fény hatására elektront bocsájt ki, melyek száma dinódák sorozatán felerősödik. CCD kamera (Charge-coupled devices): félvezető alapú kondenzátorokat tartalmazó optikai érzékelő. Spektrum A fehérjék abszorpciója A fehérjék abszorpciója A fehérjék abszorpciójának értelmezése Lambert-Beer törvény 7
Johann Heinrich Lambert (1728 1777) o? Lambert törvény Német matematikus, fizikus. 1760 Photometria gyengítési (abszorpciós, extinkciós) együttható Δx Δ = k(λ) Δx k(λ) : Lineáris gyengítési (extinkciós) együttható = 10 0 kx Lambert törvénye August Beer (1825 1863) / (0) 1 Német fizikus, matematikus. 1854 Einleitung in die höhere Optik. 1/2 1/4 1/8-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 x k = εc k : abszorpciós együttható ε(λ): moláris abszorpciós együttható (egységnyi koncentráció fényelnyelése egységnyi úthosszon) c : koncentráció (mól/liter) Lambert-Beer törvény = 10 0 k x A fényelnyelés mértéke Transzmittancia fényáteresztő képesség (%) / 0 *100 = 10 0 εc x o k = εc ε c x 8
A fényelnyelés mértéke Abszorpció (abszorbancia, extinkció, optikai sűrűség(od) Fényelnyelés (mértékegység nélküli) A = εcx = lg 0 o ε c x Abszorbancia mérésének előnyei a koncentrációval egyenesen arányos csak híg oldatokban! additív Miért jó az additivitás? Alkalmazás: fehérjekoncentráció meghatározása A mért abszorbció: A Szükség van egy referencia számra (kalibráció): extinkciós koefficiens: ε abszorpció fehérje fluoreszcens próba ε szokásos egységei: M -1 cm -1, vagy (mg/ml) -1 cm -1 Ha A = 0.55 and ε = 1.1 (mg/ml) -1 cm -1 λ (nm) c = (A/ ε) in mg/ml; c = 0.5 mg/ml Példa egy másik alkalmazásra: elektroforézis eredmények kiértékelése A fotométer linearitása; stray light effect S 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 Megfigyelés: Abszorpció Várható tendencia Meredekség: ε Mérési eredmények 0.0 0 5 10 15 20 [mdia3-fh2] (μm) Koncentráció 9
De miért nem mér lineárisan? A probléma forrása: elvileg sem tökéletesek a monokromátorok! Második, harmadik felharmónikusok! 2λ; 3λ Optikai rács A monokromátor működésének alapelve. Tegyük fel, hogy az anyag csak a kiválasztott hullámhosszon nyel el! Nagy abszorbció mellett: Kicsi abszorbció mellett: 0 0 99% λ választ és anyag 89% λ választ. és 99% λ választ. és 1% λ felh.. anyag 1% λ választ. és 1% λ felh. 1% λ felh. 1% λ felh. Az átmenő fény összetétele A hatás! Kicsi abszorbció: / 0 = 90 / 100 = 0.9 valódi érték = 89 / 99 ~ 0.9 A mért és a valódi közel azonos! Nagy abszorbció: / 0 = 2 / 100 = 0.02 valódi érték = 1 / 99 ~ 0.01 Az eltérés nagy! Abszorpció Várható tendencia Meredekség: ε Koncentráció 10
Derivatív spektroszkópia Mikor és mire jó? A probléma pl. nagy fényszórás a mintában - optikailag sűrű minták - nagyon szóró minták - igen kicsi abszorbció változások Hasznos módszer a biokémiában, gyógyszerkutatásban.stb. abszorbció A látszólagos vagy mért abszorpció A valódi abszorpció λ (nm) A spektrum deriváltja! Emlékeztető! Deriválás: ΔA / Δλ, és Δλ nagyon kicsi, nullához tart: da / dλ abszorbció Δλ ΔA d (abszorbció) / d λ A spektrum (első) deriváltja! Mért spektrum Valódi spektrum λ (nm) λ (nm) A módszer előnyei A lényeg - az abszorpciós csúcsokat könnyebb azonosítani - alkalmas továbbra is koncentráció meghatározásra - az abszorbció definíciója - az abszorbció mérése - az abszorbció alkalmazásai 11