Génexpresszió szabályozása I

Hasonló dokumentumok
Epigenetikai Szabályozás

Az X kromoszóma inaktívációja. A kromatin szerkezet befolyásolja a génexpressziót

TÉMAKÖRÖK. Ősi RNS világ BEVEZETÉS. RNS-ek tradicionális szerepben

Epigenetikai mintázatok biomarkerként történő felhasználási lehetőségei a toxikológiában

Molekuláris biológiai alapok

DNS replikáció. DNS RNS Polipeptid Amino terminus. Karboxi terminus. Templát szál

Sejtmag, magvacska magmembrán

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Biológus MSc. Molekuláris biológiai alapismeretek

Epigenetikai szabályozás

TEMATIKA Biokémia és molekuláris biológia IB kurzus (bb5t1301)

Fehérje expressziós rendszerek. Gyógyszerészi Biotechnológia

A doktori értekezés tézisei. A növényi NRP fehérjék lehetséges szerepe a hiszton defoszforiláció szabályozásában, és a hőstressz válaszban.

NUKLEINSAVAK. Nukleinsav: az élő szervezetek sejtmagvában és a citoplazmában található, az átöröklésben szerepet játszó, nagy molekulájú anyag

ADATBÁNYÁSZAT I. ÉS OMICS

NÖVÉNYGENETIKA. Az Agrármérnöki MSc szak tananyagfejlesztése TÁMOP /1/A

A nukleinsavak polimer vegyületek. Mint polimerek, monomerekből épülnek fel, melyeket nukleotidoknak nevezünk.

RNS-ek. 1. Az ősi RNS Világ: - az élet hajnalán. 2. Egy már ismert RNS Világ: - a fehérjeszintézis ben résztvevő RNS-ek

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

13. RNS szintézis és splicing

transzláció DNS RNS Fehérje A fehérjék jelenléte nélkülözhetetlen minden sejt számára: enzimek, szerkezeti fehérjék, transzportfehérjék

I. A sejttől a génekig

Biológiai módszerek alkalmazása környezeti hatások okozta terhelések kimutatására

OTKA ZÁRÓJELENTÉS (F48921)

DOKTORI ÉRTEKEZÉS TÉZISEI. Az MDR1 gén kromatin szerkezetének tanulmányozása gyógyszerérzékeny és gyógyszerrezisztens humán sejtekben.

Alkímia Ma. az anyagról mai szemmel, a régiek megszállottságával. KÖZÉPISKOLAI KÉMIAI LAPOK

- Conrad Hal Waddington számára a gének fizikai háttere még ismeretlen volt (Watson-Crick-Franklin 1953), így próbálta leírni a sejt specializációt=>

Nukleinsavak. Szerkezet, szintézis, funkció

CzB Élettan: a sejt

Fehérje interakciók az ecetmuslica telomerének retrotranszpozonjain. Takács Sándor

Transzláció. Szintetikus folyamatok Energiájának 90%-a

A nukleinsavak polimer vegyületek. Mint polimerek, monomerekből épülnek fel, melyeket nukleotidoknak nevezünk.

A következő 2 előadás diái mind a számonkért anyag részei

2007/11/05 Molekuláris biológia előadások - Putnoky 1-1

3. Sejtalkotó molekulák III. Fehérjék, enzimműködés, fehérjeszintézis (transzkripció, transzláció, poszt szintetikus módosítások)

A genetikai lelet értelmezése monogénes betegségekben

Kromoszómák, Gének centromer

A molekuláris biológia eszközei

A BIOTECHNOLÓGIA TERMÉSZETTUDOMÁNYI ALAPJAI

A replikáció mechanizmusa

12/4/2014. Genetika 7-8 ea. DNS szerkezete, replikáció és a rekombináció Hershey & Chase 1953!!!

Nukleinsavak építőkövei

Antiszenz hatás és RNS interferencia (a génexpresszió befolyásolásának régi és legújabb lehetőségei)

BIOLÓGIA ALAPJAI. Anyagcsere folyamatok 2. (Felépítő folyamatok)

A BIOTECHNOLÓGIA ALKALMAZÁSI LEHETŐSÉGEI A GYÓGYSZERKUTATÁSBAN

2. Sejtalkotó molekulák II. Az örökítőanyag (DNS, RNS replikáció), és az öröklődés molekuláris alapjai (gén, genetikai kód)

Az ADA2b adaptor fehérjéket tartalmazó hiszton acetiltranszferáz komplexek szerepének vizsgálata Drosophila melanogaster-ben

Human genome project

Emlősök korai embrionális génjei kifejeződésének vizsgálata. molekuláris biológiai módszerekkel. Baji Gál Árpád

5. Előadás Nukleinsavak kimutatása, szekvenálás

A dsaga SPECIFIKUS HISZTON ACETILÁCIÓ GÉNMŰKÖDÉS SZABÁLYOZÁSBAN BETÖLTÖTT FUNKCIÓJÁNAK VIZSGÁLATA. Zsindely Nóra

A géntechnológia genetikai alapjai (I./3.)


KERINGŐ EXTRACELLULÁRIS VEZIKULÁK ÁLTAL INDUKÁLT GÉNEXPRESSZIÓS MINTÁZAT VIZSGÁLATA TROPHOBLAST SEJTVONALBAN

Epigenetikai tényezők jelentősége az immunológiában

A genomiális medicina szép új világa

TAF10 fehérjék szerepe Drosophila melanogaster-ben

GENOMIKA TÖBBFÉLE MAKROMOLEKULA VIZSGÁLATA EGYIDŐBEN

,:/ " \ OH OH OH / \ O / H / H HO-CH, O, CH CH - OH ,\ / "CH - ~(H CH,-OH \OH. ,-\ ce/luló z 5zer.~ezere

BIOLÓGIA HÁZIVERSENY 1. FORDULÓ BIOKÉMIA, GENETIKA BIOKÉMIA, GENETIKA

Epigenetika. szomatikus sejt (emlőszövet sejt) magjának enukleált (magjától megfosztott) petesejtbe ültetésével hozták létre

Genetika. Tartárgyi adatlap: tantárgy adatai

Uracil a DNS-ben: hiba vagy jel? A dutpáz szabályozása és egy újonnan azonosított U-DNS nukleáz a Drosophila melanogaster fejlődésében.

Az Oxidatív stressz hatása a PIBF receptor alegységek összeszerelődésére.

11. Dr. House. Biokémiai és sejtbiológiai módszerek alkalmazása az orvoslásban

Flowering time. Col C24 Cvi C24xCol C24xCvi ColxCvi

MEDICINÁLIS ALAPISMERETEK AZ ÉLŐ SZERVEZETEK KÉMIAI ÉPÍTŐKÖVEI AZ AMINOSAVAK ÉS FEHÉRJÉK 1. kulcsszó cím: Aminosavak

Új temékek az UD- GenoMed Kft. kínálatában!

3. Sejtalkotó molekulák III.

Egy vagy több nukleotid mutációja megváltoztathatja a fehérje szerkezetét és működését

Hamar Péter. RNS világ. Lánczos Kornél Gimnázium, Székesfehérvár, október

Az enzimműködés termodinamikai és szerkezeti alapjai

Biológiai feladatbank 12. évfolyam

Molekuláris biológiai eljárások alkalmazása a GMO analitikában és az élelmiszerbiztonság területén

15. Fehérjeszintézis: transzláció. Fehérje lebontás (proteolízis)

Az Ig génátrendeződés

HUMÁN PAPILLOMAVÍRUS FERTİZÉS HATÁSA AZ EPIGENETIKAI ÉS JELÁTVITELI SZABÁLYOZÓ FOLYAMATOKRA KERATINOCITÁKBAN

Bioinformatika előadás

Molekuláris genetikai vizsgáló. módszerek az immundefektusok. diagnosztikájában

Farmakológus szakasszisztens Farmakológus szakasszisztens 2/34

DNS-szekvencia meghatározás

A glükóz reszintézise.

Immunológia alapjai. 10. előadás. Komplement rendszer

Mutagenezis és s Karcinogenezis kutatócsoport. Haracska Lajos.

TDK lehetőségek az MTA TTK Enzimológiai Intézetben

TÁMOP /1/A Tantárgy címe: Transzdifferenciáció és regeneratív medicina Dr. Balogh Péter és Dr. Engelmann Péter

Johann Gregor Mendel Az olmüci (Olomouc) és bécsi egyetem diákja Brünni ágostonrendi apát (nem szovjet tudós) Tudatos és nagyon alapos kutat

3. Főbb Jelutak. 1. G protein-kapcsolt receptor által közvetített jelutak 2. Enzim-kapcsolt receptorok által közvetített jelutak 3.

Epigenetika kihívások az ökotoxikológiában

Génkifejeződési vizsgálatok. Kocsy Gábor

Poligénes v. kantitatív öröklődés

Terhesség és emlőrák genetikai szempontok. Kosztolányi György PTE Orvosi Genetikai Intézet

Balázs Anna. Az importin-béta 1 szerepe a kromatin 2 szerveződésében. Abstract

A FISH technika alkalmazása az előnemesítésben

CHO H H H OH H OH OH H CH2OH HC OH HC OH HC OH CH 2

Mit tud a genetika. Génterápiás lehetőségek MPS-ben. Dr. Varga Norbert

A T sejt receptor (TCR) heterodimer

Bevezetés a bioinformatikába. Harangi János DE, TEK, TTK Biokémiai Tanszék

Új temékek az UD-GenoMed Kft. kínálatában!

7. A SEJT A SEJT 1. ÁLTALÁNOS TUDNIVALÓK

Átírás:

Sejtszintű biológiai szabályozás Szabályozás élő rendszerekben Génexpresszió szabályozása I 2018. október 29. 2018 ősz Szabályozási lehetőségek és szintek a génkifejeződésben Az eukarióta gének szerkezete Transzkripció szabályozása: mikor mely génekről indulhat meg az mrns átírása - represszorok, inducerek, transzkripciós faktorok - kromatin szerkezet epigenetika: a DNS és az őt körülvevő fehérjék kódja Poszttranszkripcionális szabályozási lehetőségek: mrns érés, stabilitás Kis RNS-ek szerepei 3 4 1

Hisztonok DNA Enhancer Activators Distal control element DNAbending protein Promoter Gene TATA box General transcription factors Group of mediator proteins RNA polymerase II RNA polymerase II 5 Transcription initiation complex RNA synthesis A kromatin szerkezet szerepe a szabályozásban Egyes kromatin hurkok különböző egyedi kromoszómákról behajlanak a sejtmag egy központi régiójába Ez a központi régió sok RNS polimeráz és transzkripciós faktor fehérje molekulát tartalmaz Különböző helyről származó kromoszóma részletek együtt átírhatók és még a fehérje molekulákkal is spórolni lehet Chromosomes in the interphase nucleus 10 m Vajon hogyan készülhetett ez a mikroszkópos kép? Chromatin loop Chromosome territory Transcription factory 2

Eukromatin Génekben gazdag kromatin (legalábbis a heterokromatin régióhoz viszonyítva). A génjeit körülvevő hiszton fehérjék nem szorosan kötődnek a DNS-hez, ezért a génexpresszió (génkifejeződés) aktív, szinte folyamatosan íródnak át az mrns-be (messenger RNS-be) a gének információi Nehezen festhető, laza szerkezete miatt. Heterokromatin Nem aktív, az RNS polimeráz nem fér hozzá. Két fő típus: konstitutív vagy fakultatív heterokromatin. A konstitutív heterokromatin sohasem íródik át, mind funkciójában, mind formájában irreverzibilisen inaktívvá vált. Az emberi kromoszómák közül az 1-es, 9-es, 16-os és az Y kromoszóma tartalmaz ilyen régiókat. Fakultatív heterokromatin: képes visszatérni az eukromatikus állapotba, ezzel lehetővé téve génjeinek kifejeződését. A nőkben található inaktív X kromoszómájuk ilyen kromatinból áll. Ezen kromatin régiók metilációval és hiszton acetilációval tudnak ebben az állapotukban maradni, megakadályozva az enzimeket, hogy a DNS-hez férjenek. Jól festhető (Giemsa-festés): fénymikroszkóp alatt szabálytalan körvonalú sötét szemcséket mutat. 9 https://en.wikipedia.org/wiki/giemsa_stain 10 Eukromatin vs heterokromatin Mi a molekuláris háttér? 11 A genetikai információ a nukleinsav szekvencián kívül még további elemeket tartalmaz: epigenetika (C.H. Waddington) Hisztonok módosulásai DNS módosulásai Így létrejöhet egy olyan elköteleződés, ami alapján a részlegesen differenciálódott sejtek csak néhány további úton mehetnek tovább (pl hemopoetikus sejtekből csak 12 véralkotó sejtek lesznek) 3

C.H. Waddington Örökletes és nem génszekvenciaalapú tulajdonságok -Egypetéjű ikrek különböző hajszínnel, egy alomból származó u tódállatok eltérő szőrzettel -Női X kromoszóma inaktiválás -Szerzett tu lajdonságok örökítése! Micsu rin Mioblaszt izomsejt, keratonocita bőrsejt Jóllehet a genom ugyanaz Itt olyan elköteleződésről van szó, ami a sejtek generációin át tud érvényesülni! Egyszer mioblaszt lett utána már visszamenni nem tud! Omnipotens őssejt pluripotens sejtvonal - differenciálódott 14 DNS módosítások Fehérje kovalens módosítások DNS kovalens módosítások Hiszton módosítások 15 16 4

Hiszton módosítások Milyen módosítások? Foszfo- (P) Trimetil- Metil- Me Adapted from Lund and Lohuizen Genes Dev 2004 17 Acetil- (A) 18 Lizin metilálás Metil-lizin demetilálás S-adenozil-metionin (SAM) a metil-donor, ebből lesz S-adenozil-homocisztein (SAH) Enzim: hiszton metil-transzferáz (lizin-metiltranszferáz) Lizin-demetiláz (FAD-függő amin-oxidáz) Jumanji (Fe és ketoglutarát) Formaldehid szabadul fel 19 Mi az a H3K4? H3K36? 20 5

Hiszton módosulás vs transzkripció Metilált DNS vs transzkripció Gén bekapcsolás: H3-K9 acetilálás Gén kikapcsolás: H3-K9 metilálás Methylated DNA 21 Histone 22 DNS-metiltranszferázok C-metilálás a DNS-ben Ugyanaz a metildonor! Mi következhet ebből? 23 24 6

C-metilálás: fenntartja az inaktív állapotot Metil-C a heterokromatinban Mi biztosítja, hogy ez is másolódhat? 25 Palindróma! 26 A DNS és a hisztonok együttes módosításai határozzák meg a genom átírásának lehetőségeit Első kialakítás (de novo) és azt követő fenntartás (m aintenance) Együttes szabályozás kell! Mi lehet a közös kapcsoló? 27 Alex Meissner, Henry Stewart Talks 7

Kell-e aktív DNS-demetiláció? Miért kell, ha kell? BER javítás és epigenetika kapcsolata Hibás bázis vagy metil-citozin-származék TDG(UDG)-függő aktív demetiláció DNS glikoziláz UNG/TDG Kivágott bázis DNS De-metilezés utak Passzív: nincs DNMT Bhutani et al, Cell 2011 146:866-872 Aktív: DNS javítással kapcsolt Gyakran előforduló példák bázishibákra és hamis párokra BER mi is az? 8

Hasítandó kötések 5 irányú vágás, termék 3 -OH Enzimaktivitások: 1. Glikoziláz 2. AP endonukleáz 3. Polimeráz 4. Ligáz Sematikusan: UDG = uracil-dns glikoziláz] HAP1 = humán AP endonukleáz 3 irányú vágás, termék 5 -OH Hasítandó kötések 5 irányú vágás, termék 3 -OH Fehérje kölcsönhatások: Pol APE XRCC APE Ligáz - XRCC 3 irányú vágás, termék 5 -OH 9

Uracil kötés: A bázispárosodásban szereplő U-atomok kötnek a fehérjéhez, (ez kb a várható, DE: glikozilos N is lehetne) Uracil-DNSglikoziláz PDB: 1EMH, 4SKN Tehát: ki kell fordítani egyes és kettős szálú DNS egyaránt szubsztrát G:U jobb szubsztrát mint H-hidak és aromás átlapolás A:U cikkek - további info Az uracil-dns glikozilázok A konzervált Leu: exponált, szerepe van a DNS szálakkal kialakított kölcsönhatásban U-zseb: hidrofób Az aktív centrum körül a fehérje pozitív árkot mutat A DNS-ben található uracilt specifikusan megkötik, majd kivágják Az enzimcsalád tagjai: Enzim Funkció UNG Emberben legaktívabb, replikáció során is véd SMUG Egyes szálú DNS-en aktívabb TDG U:G, T:G hibáspárok javítása MDB4 CpG szigetekben keletkező uracil kivágása 10

DNS-javítással kapcsolt aktív DNS - demetiláció. (1) TET enzimek: 5-metilcitozin (5mC) ből oxidatív átalakításokkal hoznak létre 5-hidroximethicitozint (5hmC), vagy 5-formilcitozint(5fC) vagy 5-karboxi-citozint (5caC). (2) AID/APOBEC enzimek: dezaminálnak (3) BER enzimek: a dezaminált/oxidált citozin formákat kivágják, és erre a helyre a BER során beépül a naszcensen de-metilált citozin TDG-null heterozigóta és homozigóta embrió Western blot és funkcionális aktivitás assay (A) TDG kifejeződés (Western) KO homozigóta: nincs látható expresszió, heterozigóta: a vadtípushoz képest csökkent expresszió. (B) TDG funkcionális assay: G:T mismatch repair aktivitás sejtmagi kivonattal a különböző genotípusú sejtekben. O : negatív kontroll, sejtkivonat nélkül, rm : rekombináns TDG-val történő reakció Pozitív és negatív kontrollok hol vannak?? Minek a béta-aktin? (C and D) Gross phenotype of wild-type and Tdg/ littermate embryos at embryonic day E11.5. Double arrows: constriction in the cervical region of Tdg null embryos (D) compared to wild-type (C); the enlarged heart with pericardial effusion (h) and hemorrhagic liver (l) are apparent; (G and H) Transverse sections of the liver at E11. A bdominal hemorrhage (I and J) Transverse sections of the heart at E11.5 show patterning defects in mutant embryos. (K and L) Immunostaining of the vascular labyrinth: disorganisation Vad típus és TDG-null homozigóta embrió fejlődési rendellenességek 11

A differenciálódás állomásai DNS metilálásban van a különbség 45 Alex Meissner, Henry Stewart Talks Na-biszulfit szekvenálás : C U, DE!! MeC nem dezaminálódik, marad MeC Na-biszulfitos analízis TDG-null vs TDG +/+ esetekben TDG (A D) Üres karika: nem-metilált Teli karika: metilált 47 Egyértelmű kísérletes bizonyíték TDG szerepére a metilációs mintázatban: nincs TDG sokkal több MeC van 12

Általános kérdés: A DNS kémiai tere limitált de mennyire is? A DNS szekvenálási módszerek legtöbbször inherens előítélettel rendelkeznek DNS szekvenálás: a bázissorrend meghatározása (Sanger dideoxi) A két DNS szálat kettéválasztjuk Az egyikhez hozzáépítünk egy új szálat a négy bázis jelenlétében (T, G, C, A) A hozzáépítés közben figyeljük a beépülő bázisok (T, G, C, A) sorrendjét Többféle bázist egybemosnak, mert csak 4-félét tudnak illeszteni T - A G - C A - T C - G DNS szekvenálás: a bázissorrend meghatározása (Sanger dideoxi) A két DNS szálat kettéválasztjuk Az egyikhez hozzáépítünk egy új szálat a négy bázis jelenlétében (T, G, C, A) A hozzáépítés közben figyeljük a beépülő bázisok (T, G, C, A) sorrendjét T - A G - C De-metil-T - A Oxo-G - C T - A G - C A - T C - G Ez a módszer mindig csak 4-féle bázist fog leolvasni, még akkor is, ha ennél többféle van a mintában! oxidált - A - T Dezaminált-C - G Általános kérdés: A DNS kémiai tere limitált de mennyire is? A DNS szekvenálási módszerek legtöbbször inherens előítélettel rendelkeznek Többféle bázist egybemosnak, mert csak 4-félét tudnak illeszteni IGAZI szekvenálás kellene a furcsa bázisokra (v.ö. Na-biszulfit 5MeC/C) Ehhez kell valami okos kémia vagy antitest-jellegű felismerés Ki lehet használni a glikozilázokat 13

Az uracil-dns glikozilázok A DNS-ben található uracilt specifikusan megkötik, majd kivágják Az enzimcsalád tagjai: Enzim Funkció UNG Emberben legaktívabb, replikáció során is véd SMUG Egyes szálú DNS-en aktívabb TDG U:G, T:G hibáspárok javítása MDB4 CpG szigetekben keletkező uracil kivágása UNG CONSTRUCTS FOR CELLULAR ASSAYS I. Currently used construct: Mesterséges, módosított UNG Kettős pontmutációt hordoz (D154N, H277N) Specifikusan kikötődik az uracilhoz Katalitikusan inaktív, nem hasítja ki No UGI UNG-alapú szenzor kromoszóma festésre DAPI UNG-DsRed Ung-/- cells were treated with fluoro-deoxyuridine, than stained with the UNG-reagent + UGI Staining is visible in mostly the heterochromatic regions (cf DAPI), II. New construct with 1XFlag or 3XFlag-tag: Másféle alapokon: Nanopórusos szekvenálás Nincs előítélet! Ez már működik sokféle módosított citozinra Staining is erased by UGI, arguing for specificity www2.technologyreview.com 56 14

DNS bázis módosítások detektálása : single-molecule real-time sequencing (SMRT, PacBio) Valósidejű szekvenálás: ha metil-adenin van a láncban, akkor ahhoz sokkal tovább tart, amíg a polimeráz beépíti a timint http://www.labonline.com.au/articles/50190-dna-basemodification-detection-using-single-molecule-real-timesequencing 57 15