Uracil a DNS-ben: hiba vagy jel? A dutpáz szabályozása és egy újonnan azonosított U-DNS nukleáz a Drosophila melanogaster fejlődésében.

Átírás

1 Uracil a DNS-ben: hiba vagy jel? A dutpáz szabályozása és egy újonnan azonosított U-DNS nukleáz a Drosophila melanogaster fejlődésében. Beke Angéla (A publikációkon a leánykori név, Békési Angéla szerepel) Témavezető: Dr. Vértessy G. Beáta A biológia tudományok doktora, tudományos tanácsadó A doktori iskola vezetője: Prof. Erdei Anna CMHAS, tanszékvezető egyetemi tanár Programvezető: Prof. Gráf László MHAS, tanszékvezető egyetemi tanár Eötvös Loránd Tudományegyetem, Biológia Doktori Iskola Szerkezeti Biokémia Program Készült: a Magyar Tudományos Akadémia, Szegedi Biológiai Központ, Enzimológiai Intézetében 1

2 Köszönetnyilvánítás Elsőként köszönetemet szeretném kifejezni témavezetőmnek, Dr. Vértessy Beátának, amiért lehetővé tette számomra, hogy ilyen érdekes, fontos és sok újdonságot rejtegető témában, innovatív és inspiráló közegben dolgozhatok, hogy tanácsaival, bátorításával, az egyéni kreativitás ösztönzésével és nem utolsó sorban őszinte barátságával mindvégig támogatott. Továbbá köszönettel tartozom, a munkában résztvevő valamennyi kollegámnak és kollaboráló partnerünknek: Zagyva Imrének az elsőrangú muslicaboncolásokért és festésekért, Dr. Hunyadi-Gulyás Évának a töménytelen sok minta kitartó és precíz tömegspektrometriás azonosításáért, az UDE fehérje klónozásáért Dr. Felföldi Ferencnek, a rekombináns UDE fehérje előállításában és jellemzésében nyújtott elengedhetetlen segítségért Muha Villőnek, Pukáncsik Máriának és Leveles Ibolyának. Hlavanda Emmának és Dr. Farkas Attilának köszönöm a sok-sok tanácsot, technikai segítséget és kölcsönkért eszközt, vegyszert. Az antiszérumok előállításáért Prof. Erdei Anna csoportjának tartozom hálás köszönettel. A témában további résztvevő kutatóknak: Németh (Pongrácz) Veronikának, Kovári Júliának, Nagy Ágnesnek, Kónya Emesének, Dr. Kele Zoltánnak, Klement Évának, Dr. Haracska Lajosnak és Burkovics Péternek köszönöm a szíves együttműködést. Köszönöm Dr. Homolya Lászlónak és Dr. Jankovics Ferencnek a konfokális felvételekhez nyújtott lehetőséget és segítséget. Lengyel kollaboráló partnerünknek, Janusz Bujnicki-nek és Jan Kosinski-nek köszönettel tartozom az UDE fehérje szerkezetmodellezéséért. A csoport minden tagjának köszönöm, hogy barátságukkal, és őszinte érdeklődéssel, hasznos tanácsokkal segítették munkámat: Dr. Barabás Orsolyának, Takács Enikőnek, Dubrovay Zsófiának, Varga Balázsnak, Dr. Tóth Juditnak, Merényi Gábornak. Köszönöm az Intézet volt és jelenlegi igazgatójának, Dr. Friedrich Péternek és Dr. Závodszky Péternek, hogy lehetővé tették számomra az Intézetben való munkát. Köszönettel tartozom továbbá az egész intézeti kollektívának azért a baráti légkörért, amiben a kutatómunka igazán örömteli lehet. Köszönet illeti családomat: szüleimet, akik őszinte szeretettel mindig mellettem álltak, és akiktől az első motivációkat kaptam a világ dolgainak kikutatásához; férjemet, aki kitartó türelemmel és segítséggel állt mellettem a munka dandárjában is; két kisfiamat, akik gyermekkorukat meghazudtoló türelemmel és nagy-nagy megértéssel támogatták a laborban és otthon végzett munkámat; és nem utolsó sorban férjem szüleit és Ildikót is, akiknek nagylelkű segítsége szintén megsokszorozta a munkára fordítható időmet. 2

3 Tartalomjegyzék Köszönetnyilvánítás 2 Tartalomjegyzék 3 Egyéni szerepem a disszertáció eredményeiben 6 1. Bevezetés 6 2. Rövidítések jegyzéke és jelmagyarázat 8 3. Irodalmi áttekintés Uracil a DNS-ben, mint a leggyakoribb hiba Uracil megjelenése a DNS-ben A dutpáz enzim katalitikus funkciója és élettani szerepe Báziskivágásos javító mechanizmus az uracilhibára Az U-DNS glikoziláz (UDG) családok jellemzése Timinmentes sejthalál jelensége és terápiás alkalmazása Uracil a DNS-ben, amikor nem csupán hiba Uraciltartalmú genomok U-DNS feltételezett szerepe bizonyos fiziológiás folyamatokban U-DNS feltételezett szerepe a Drosophila melanogaster fejlődésében Egy vitatott hipotézis fel- és eltűnése Programozott sejthalál a Drosophila fejlődésében DNS-degradáció programozott sejthalál folyamán Célkitűzések és a kísérletek racionális tervezése Módszerek és módszertani eredmények Anyagok Fehérjék termelése, tisztítása Kétféle rekombináns dutpáz forma előállítása A rekombináns CG18410 géntermék (UDE) előállítása Fehérjekoncentráció meghatározása Ecetmuslica minták készítése különböző fejlődési állapotokból Ecetmuslica tenyésztése, ill. S2 sejtek fenntartása Fejlődési stádiumok gyűjtése Fehérjekivonatok készítése a különböző fejlődési stádiumokból Mitokondriumizolálás Drosophila embriókból 58 3

4 4.4. Gél-elektroforézis DNS minták natív gél-elektroforézise agaróz gélen Fehérje minták gél-elektroforézise (SDS-PAGE) RNS kimutatás RNS-izolálás Félkvantitatív RT-PCR In situ RNS-hibridizálás Felszíni Plazmon Rezonancia (SPR) Fehérjék immunodetektálása Antiszérumok Western blot far Western blot Immuno-hisztokémia Immunoprecipitálás Immunoaffinitás kromatográfia Affinitás kromatográfia dutpáz konjugált szefaróz gyanta készítése U-DNS konjugált szefaróz gyanta készítése dutpáz affinitás kromatográfia U-DNS affinitás kromatográfia Fehérjék tömegspektrometriás azonosítása A dutpáz enzimaktivitás követésére használt folyamatos módszer A genomi DNS uraciltartalmának kimutatása Az UDE aktivitásának, szerkezetének jellemzésére alkalmazott módszerek U-DNS előállítása Elektroforetikus mobilitás teszt (EMSA) Az UDE enzimaktivitása uracil tartalmú plazmid DNS-en Limitált emésztés In silico eljárások Eredmények és kifejtésük A dutpáz szabályozása ecetmuslicában A dutpáz két izoformája A dutpáz mrns-einek kimutatása az ecetmuslica egyedfejlődése során A dutpáz fehérje hiánya a lárvális szövetekben 86 4

5 A dutpáz sejtciklushoz kötött szabályozása A dutpáz aktivitást befolyásoló makromolekuláris tényezők A dutpázzal kölcsönható makromolekuláris partnerek kimutatása Potenciális dutpáz partnerek izolálása és azonosítása Hipotézis a DNS-javításban szereplő potenciális dutpáz partnerekről U-DNS-re specifikus nukleáz (UDE) izolálása, azonosítása és jellemzése A lárvális DNS uraciltartalmának kimutatása U-DNS specifikus nukleáz aktivitás kimutatása lárva extraktumban U-DNS kötő fehérjék izolálása és azonosítása lárva extraktumból A CG18410 géntermék in silico jellemzése A rekombináns UDE fehérje funkciójának jellemzése DNS-kötő tulajdonsága U-DNS-re specifikus nukleáz aktivitása A rekombináns UDE fehérje szerkezetének jellemzése A fehérje doménanalízise Az 1A és 1B fragmensek de novo szerkezetmodellezése Az UDE fehérje fejlődésbiológiai szerepének jellemzése Az UDE fehérje kifejeződése a különböző szövetekben, az egyedfejlődés során Az UDE kifejeződésének szabályozása a Drosophila-ban Az UDE aktivitás lehetséges szerepe a metamorfózis során zajló sejthalál folyamatokban Az UDE lehetséges alkalmazási területei Összefoglalás, konklúzió Irodalomjegyzék Közlemények listája Magyar nyelvű összefoglaló Angol nyelvű összefoglaló 146 5

6 Egyéni szerepem a disszertáció eredményeiben Napjainkban megfelelő hatékonyságú molekuláris biológiai kutatómunka szinte kizárólag kutatócsoportokban, több kutató együttműködésével és további csoportok bevonásával képzelhető el. Ennek megfelelően a jelen dolgozatban foglalt eredmények is több kutató közös munkáját tükrözik. Az egyértelműség kedvéért egyes szám első személyben fogalmaztam a saját önálló eredményeimre vonatkozó részeknél, míg a többes szám első személyben fogalmazott eredmények olyan közös munkából származnak, amiben kreatívan és fizikailag aktív módon részvettem. Továbbá minden esetben megnevezem a kísérletet végző, vagy abban segítő kollegáimat. 1. Bevezetés A DNS-ben az uracil a hagyományos értelmezés szerint hibaként jelenik meg. Azonban ismerünk néhány példát életképes, uraciltartalmú genomi DNS-t hordozó szervezetekre (PBS2 bakteriofág [1] dut-/ung- E. coli [2]), ill. átmenetileg uracilt tartalmazó DNS (továbbiakban U-DNS) fiziológiás folyamatokban betöltött feltételezett szerepére. Egyrészt az AID fehérje a DNS-ben lévő citozint uracillá képes alakítani, ezzel kulcs szerepet játszik a szomatikus hipermutáció és az osztályváltó ( class switch ) rekombináció folyamatában [3]; másrészt a lárvákban feltehetőleg felhalmozódó U-DNS részt vehet a Drosophila metamorfózisa során zajló sejthalál folyamatok indukálásában [4]. Míg az előbbi hipotézis egyre inkább jól körülírt, az utóbbit - az U-DNS metamorfózisban betöltött, sejthalált indukáló szerepét - egyetlen csoport vetette fel, de eredményeik [4-7] az irodalomban vitatottakká váltak [8], majd a további kutatás abbamaradt. A jelen dolgozatban foglalt eredmények megoldani látszanak a polémiát, s egyben új utat nyitnak a DNS-ben megjelenő uracil fejlődési jelként való értelmezéséhez. Emellett a vizsgált két enzim rák- ill. vírusellenes terápiák célpontja ill. kiindulópontja lehet, ami különösen indokolttá teszi beható, alapkutatás szintjén történő vizsgálatukat is. Egyrészt vizsgáltam az uracil DNS-ből való kizárásában kulcs szerepet játszó dezoxiuridin-trifoszfát-nukleotidohidrolázt (dutpázt) ill. annak sejtbeli és egyedfejlődésbeli szabályozását a Drosophila esetében; másrészt azonosítottam és jellemeztem egy mind szerkezetileg, mind funkciójában teljesen újszerű nukleázt, mely az U-DNS-t képes felismerni és specifikusan hasítani. 6

7 Jellemeztem a Drosophila dutpáz fejlődés során történő sokrétű szabályozását. Izoláltam és azonosítottuk az enzim két izoformáját. Kimutattam, hogy a fehérje kifejeződése a lárvaállapotokban drasztikusan lecsökken: csupán az imaginális diszkuszokban detektálható. Ez valószínűsíti a lárvaállapotok során a lárvális szövetek DNS-ében uracil felhalmozódását, tekintettel arra, hogy a Drosophila genomból hiányzik a fő U-DNS glikoziláz génje, az ung gén, mely a DNS-ben lévő uracil felismeréséért és kivágásáért felelős. Az uracil jelenlétét a lárvális genomban kvalitatív módon sikerült megerősítenem. Kimutattam, hogy a dutpáz fehérje kifejeződésének drasztikus csökkenése hátterében poszt-transzkripciós szabályozás áll - mivel a két izoformának megfelelő mrns egyaránt konstitutívnak tekinthető a fejlődés alatt. Megerősítettem a dutpáz sejtciklus-függő szabályozását Drosophila S2 sejtvonalban. Detektáltam továbbá egy dutpázt aktiváló aktivitást is. A sokrétű szabályozás alapján feltételeztük, hogy a dutpáznak számos kölcsönható fehérje partnere lehet a különböző Drosophila szövetekben, amit felszíni plazmon rezonancia és far Western blot kísérletekkel meg is erősítettünk. Affinitás kromatográfiával izoláltam és azonosítottunk számos lehetséges kölcsönható partnert, melyek között több kapcsolatba hozható DNS-javítással és/vagy apoptózissal. A lárvaállapotok során megtűrt uracilt minden valószínűség szerint az általam izolált és azonosított, közvetlenül a bebábozódás előtt kifejeződő U-DNS specifikus nukleáz (UDE) ismeri fel. Az U-DNS-be az UDE által bevitt száltörések feltehetőleg erős apoptotikus jelként jelentkeznek a lárvális szövetekben. A fehérje így a metamorfózis alatt zajló sejthalál folyamatok indukálásában játszhat szerepet. Jellemeztük a rekombináns UDE aktivitását: szigorúan U-DNS-re specifikus, a DNS-t egyszálon hasító, relatíve fémfüggetlen nukleáz. Ezzel együtt az UDE egy teljesen új fehérjecsalád első leírt tagja: homológjait egyelőre csak teljes átalakulással fejlődő rovar genomokban találtam meg. A homológok összerendezéséből kitűnt öt konzervált régió, melyből az első kettő egymással is homológ, kiterjedtebb szakasz, ezek limitált proteolízis kísérletek szerint a fehérje önálló doménjei lehetnek. Az összerendezést is alapul véve kollaborációban végzett szerkezetmodellezés szerint nincs olyan ismert feltekeredési mintázat (gomboly, angolul: fold ) mely az UDE-nek megfelelne. A konzervált motívumok sem mutatnak hasonlóságot eddig ismert U-DNS-t felismerő fehérjékhez (U-DNS glikoziláz családok, UDG-k), sem más nukleázokhoz. Az UDE aktivitás fiziológiás relevanciájára utal, hogy kifejeződése szigorúan a bábállapotokhoz köthető; továbbá, hogy az UDE expressziója ung- E. coli sejtekben toxikusnak bizonyult. 7

8 E két enzimnek a dolgozatban részben megvalósított - proteomikai szemléletű vizsgálata elengedhetetlen az U-DNS, metamorfózissal fejlődő rovarok egyedfejlődésében betöltött szerepének vizsgálatához. A munka korántsem befejezett; épp ellenkezőleg: az új nukleáz azonosításával tág teret nyit a további kutatások számára, nem csupán a Drosophila ill. a teljes átalakulással fejlődő rovarok esetén, de szélesebb horizonton is felveti a DNS-ben megjelenő uracil esetleges jelszerepét. 2. Rövidítések jegyzéke és jelmagyarázat 5hmeU: 5 -hidroximetil-uridin 5meCpG: 5-metil-citidinből és guanozinból álló dinukleotid szegmens β-ftz F1: Fushi Tarazu faktor 1, ekdizon által regulált transzkripciós faktor εc: 3,N4-eteno-dezoxicitidin AID: Aktiválás Indukált citidin Dezamináz APE: AP endonukleáz (APE1: a fő humán APE, másik neve Redox faktor 1 (Ref1)) AP hely: bázismentes hely a DNS-en (apurin/apirimidin hely) AUDG: archeákban kifejeződő UDG család BCIP: 6-bromo-4-kloro-3-indolil-foszfát BER: báziskivágásos javító mechanizmus (Base Excision Repair) BR-C: (BRoad-Complex) ekdizon indukálta korai gén által kódolt fehérje BSA: marha szérum albumin (Bovine Serum Albumin) C-terminális: karboxi terminális CAD: kaszpáz aktiválta DNáz (Caspase Activated DNAse) cdns: kódoló DNS, az mrns reverz-transzkripciójával előállított DNS CG18410: a jelen munkában azonosított UDE-t kódoló gén kódja CpG: citidinből és guanozinból álló dinukleotid szegmens dn: dezoxinukleozid (N lehet U: uridin, T: timidin, C:citidin, A: adenozin, G: guanozin) DNáz: DNS-t hidrolizáló enzim dndp: dezoxinukleozid-5 -difoszfát (N lehet, mint fent) dnmp: dezoxinukleozid-5 -monofoszfát (N lehet, mint fent) DNS: dezoxiribonukleinsav dntp: dezoxinukleozid-5 -trifoszfát (N lehet, mint fent) dsdns: kettős szálú DNS DTT: ditio-treitol 8

9 dug: az E. coli MUG fehérjét kódoló gén dut: a dutpáz gén E. coli-ban dutpáz: dezoxiuridin-trifoszfát-nukleotidohidroláz E93: ekdizon indukálta korai gén által kódolt fehérje E. coli: Escherichia coli ECL-reagens: HRP-vel kemilumineszcenciát adó reagens (Enhanced ChemiLuminescent reagent) EDTA: etiléndiamin-n,n,n,n -tetraecetsav EMSA: elektroforetikus mobilitás teszt (Electrophoretic Mobility Shift Assay) FEN1: flaping endonukleáz GAPDH: glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz GGR: globális genom javítás (Global Genome Repair) HEPES: N-(2-hidroxietil)piperazin-N -etánszulfonsav His-UDE: rekombináns 6 hisztidinből álló címkével ellátott UDE HRP: torma peroxidáz (Horse Radish Peroxidase) IPTG: izopropil-β-d-tiogalaktozid k cat : katalitikus sebességi állandó K M : Michaelis-Menten állandó, a szubsztrát kötődéserősségét jellemzi LB: Luria-Bertani (tápoldat) LD dutpáz: teljes hosszúságú rekombináns Drosophila dutpáz MBD4: hibáspár specifikus UDG, (Metil Binding Domain) mrns: hírvivő RNS (messenger RNA) MUG: hibáspár specifikus UDG (Mismatch Uracil-DNA Glycosylase) N-terminális: amino-terminális NBT: Nitro Blue Tetrazolium NER: nukleotidkivágó javító mechanizmus (nucleotide excision repair) NLS: magi lokalizációs szignál nt: a DNS hosszának kifejezésére szolgáló mértékegység (nukleotidszám) S2: Drosophila Schneider-line 2 sejtvonal SD dutpáz: a 28 aminosavas C-terminálist nélkülöző rekombináns Drosophila dutpáz p53: 53 kd-os tumorszupresszor fehérje PARP: poli(adp-ribóz) polimeráz PBS: fiziológiás sót tartalmazó foszfát puffer (Phosphate Buffer Saline) PBS2: Bacillus subtilis fág 2 PCNA: szaporodó sejt nukleáris antigén (proliferating cell nuclear antigene) 9

10 PCR: polimeráz láncreakció PMSF: fenilmetánszulfonil-fluorid PP i : anorganikus pirofoszfát RNáz: RNS-t hidrolizáló enzim RNS: ribonukleinsav RT-PCR: reverz transzkripcióval kapcsolt PCR s-fázis: a sejtciklus DNS-szintézis fázisa CJ236: dut-, ung- mutáns E. coli törzs SDS: nátrium-dodecil-szulfát SDS-PAGE: SDS-t tartalmazó poliakrilamid gél SMUG1: egyes szál specifikus UDG (Single-strand selective Monofunctional UDG) ssdns: egyes szálú DNS ssu: ssdns-ben levő uracil TBS: fiziológiás sót tartalmazó Tris puffer (Tris Buffer Saline) TCR: transzkripcióhoz csatolt DNS-javítás TDG: timin-dns glikoziláz, az E. coli MUG emlős homológja TES: 2-{[trisz(hidroximetil)metil]amino}etánszulfonsav Tris/HCl: (aminometántriil)trimetanol U-DNS: uracil tartalmú DNS UDE: U-DNS degradáló faktor, U-DNS specifikus nukleáz UDG: U-DNS glikoziláz (több fehérje család összefoglaló neve) UDG-2: a ciklinszerű UDG család UGI: U-DNS glikoziláz inhibitor fehérje UNG: a fő U-DNS glikoziláz, ung: E. coli-ban az UNG génje, UNG1: UNG mitokondriális izoformája UNG2: UNG nukleáris izoformája XRCC1: DNS-javító fehérje (XeRoderma Cross Complementing 1) Továbbá az aminosavakat mindig a standard egybetűs kódokkal adom meg. 10

11 3. Irodalmi áttekintés 3.1. Uracil a DNS-ben, mint a leggyakoribb hiba A genetikai információ megőrzése és változatlan továbbadása minden élőlény számára elengedhetetlen feladat. Ezt az információt a DNS hordozza az őt felépítő nukleotidok négyféle bázisának (adenin (A), timin (T), guanin (G), citozin (C)) változatos sorrendjében, szekvenciájában. A DNS szerkezete lehetővé teszi az információ megfelelően stabil tárolását, valamint annak mobilizálását a transzkripció révén ill. másolását a replikációval. A stabil tárolás lehetősége a kettősspirál szerkezetben rejlik, ahol az antiparalell futó két cukor-foszfát gerincet a befelé néző és a szekvenciát hordozó bázisok közti hidrogénkötések tartják össze. A másolás és az átírás alapja a bázispárosodás: a timin és az adenin között kettő, ill. a citozin és a guanin között három hidrogén-híd teremt kapcsolatot (1. ábra). Megjegyzendő, hogy a genetikai információ mobilis hordozóiban, az RNS-ekben a timint a bázispárképzés tekintetében vele teljesen analóg uracil (U) (1. ábra) helyettesíti. A genetikai információ azonban a bázisok kémiai változékonysága révén még a stabilnak mondható DNS-ben is - könnyen károsodhat, megváltozhat, akár különösebb mutagén környezeti hatások nélkül is. Ezek a változások a sejt normális funkciójának elvesztéséhez és többek között rákos elfajuláshoz vezethetnek. Humán sejtekben a leggyakoribb ilyen változás a C T(U) átmenet (tranzíció), amely hátterében az 5-metilcitozin, vagy a citozin oxidatív dezaminálása áll [9, 10](ld. 1. ábra). Amennyiben mutációk keletkeznek a sejt működéséhez vagy az osztódás szabályozásához elengedhetetlen génekben, tönkretéve a génekben kódolt fehérjék megfelelő aktivitását, akkor a folyamat könnyen vezet rákos elváltozáshoz. A fentiek fényében érthető, hogy miért elengedhetetlen a bázisok kémiai változásainak javítása az élő szervezet számára. A DNS-javító rendszerek kiemelkedő fontosságát mutatja az is, hogy számos örökletes, rákos elfajuláshoz vezető betegség hátterében gyakran DNSjavító fehérjék génjében keletkezett mutációk állnak [11-13]. Emellett nyilvánvaló a DNSjavítás és a programozott sejthalál szoros kapcsolata is: számos olyan DNS-javító fehérjét ismerünk, mely túl sok DNS-hiba esetén apoptózis indukcióban is szerepet játszik [14-16] 11

12 3.1.1 Uracil megjelenése a DNS-ben Uracil a DNS-be alapvetően két úton kerülhet. Egyrészt a DNS-ben előforduló egyik leggyakoribb mutagén változás - a spontán depurinálódás mellett - a citozin oxidatív dezaminálása [10] (1. ábra), ami uracilt eredményez. Az uracil bázispárképzési hajlamát tekintve timin-analóg, így a következő replikáció során az új DNS-szálba, az uracillal szembe, guanin helyett adenin épül, így stabil pontmutációt jön létre. A folyamat mutagenezishez való hozzájárulását baktériumban [17] és humán sejtekben [18] egyaránt bizonyították. A citozin dezaminálását a nagy mennyiségben jelenlevő vízmolekulák okozzák, így fiziológiás körülmények között is naponta több százszor fordul elő egy közepes méretű emlős genomban [10, 19, 20]. Érdekes megjegyezni, hogy az adenin hasonló spontán dezaminálásának gyakorisága a citozinéhoz viszonyítva csupán 2-3 % [10]. A kettős szálú DNS-szerkezet szignifikáns védelmet nyújt a citozin dezaminálással szemben, ehhez képest a transzkripció során szükségszerűen jelenlévő egyes szálú DNS-ben (ssdns) kb. 200-szor gyorsabb a folyamat [10, 21]. Ezen kívül a CpG kontextusban előforduló, DNS 12

13 metiltranszferáz által katalizált citozin metiláció során megjelenő dihidropirimidin köztitermék is kedvez a spontán dezaminálásnak [10]. Bizonyos külső mutagén hatások nagymértékben növelhetik a citozin dezaminálás gyakoriságát, pl. UV sugárzás hatására kialakuló ciklobután dimerekben a folyamat mintegy 7-8 nagyságrenddel gyorsabb, mint nem károsodott kettősszálú DNS-ben [21]. Továbbá ismert olyan enzimaktivitás is, mely a DNS-ben lévő citozin dezaminálását katalizálja [21, 22]. Meglehetősen bő irodalmi adat áll rendelkezésre az ún. aktiválás-indukált dezamináznak (activation induced deaminase, AID) az immunoglobulin gének diverzifikációjában betöltött szerepét illetően [3, 23, 24]. Mindazonáltal, az enzimatikus dezaminálás jelentősége részletekbe menően még nem tisztázott (ld fej.). A másik úton uracil hibásan timin helyett is beépülhet a DNS-szintézis során. Ugyanis a DNS polimerázok (az archeák B típusú DNS polimeráza kivételével [25]) nem képesek különbséget tenni az azonos bázispárképzési hajlammal bíró, egymástól csupán egyetlen metil csoportban különböző uracil és timin között [9, 26]. Az uracil kizárása azáltal valósul meg, hogy a DNS polimerázok által dump ill. dtmp beépítésére felhasználható magas energiájú nukleotid trifoszfátok szintje szigorúan szabályozott: amennyiben a dutp/dttp arány megfelelően alacsony, jó eséllyel timin kerül a DNS-be és nem uracil. A megfelelően alacsony dutp/dttp arány biztosításáért nagy specificitásuk és specifikus aktivitásuk révén két kulcsenzim, a dutpáz és a timidilát szintáz a felelős (2. ábra). Mivel a dnmp-dndpdntp átalakulásokban szintén szereplő nukleotid kinázok a bázisra nézve alacsony specificitásúak, továbbá reverzibilis módon katalizálnak, így azok nem biztosíthatják a megfelelő szabályozást (2. ábra). Az sejtbeli dutp/dttp arány meghatározásában jelentős különbségek adódhatnak a sejttípustól ill. a sejtciklus különböző fázisaitól függően, a DNSszintézis szempontjából releváns adatok csak aktívan osztódó sejtekből mérhetők. Ennek megfelelően az irodalomban is különböző értékeket találhatunk: átlagolt mérések alapján a dutp/dttp arány értékűnek adódik [27]. Ezzel szemben aktívan osztódó humán limfoblast sejtvonalban extrém alacsony, 10-5 nagyságrendű értéket mértek, ami azonban a timidilát szintáz enzim gátlásával 0,2-ig emelkedet [28]. Ugyanakkor vadtípusú E. coli törzsek genomi DNS-ének uracil tartalmát 1 / 10 6 bázis alattinak mérték [29], ami arra is utal, hogy az alacsony dutp/dttp arány mellett, az uracilt javító mechanizmus is szerepet játszik a DNS-replikáció során a kis mértékben hibásan beépült uracil hatékony eliminálásában (ld fej). Ezt megerősíti, hogy a mindkét UDG génben mutáns (dug-/ung-) E. coli-ban a DNS-ben található uracil mennyisége / 10 6 bázis (~10-4 U/T) értékre nőtt [29], ami így a replikációhoz kötött uraciljavítás hozzájárulása nélkül - a sejtbeli 10-4 nagyságrendű dutp/dttp arányt tükrözi. Azt, hogy ehhez az extrém alacsony arányhoz mennyiben járul 13

14 hozzá a dutpáz ill. a timidilát szintáz, jól demonstrálja, hogy a (dug-/ung-) E. coli-ban a timidilát szintázt 5-fluoro-2 -dezoxiuridinnel gátolva a DNS uraciltartalmában mintegy 4- szeres, ugyanakkor ugyanitt dutpáz mutáció esetén szeres növekedést tapasztaltak [29]. Ez a hangsúlyeltolódás a dutpáz szerepe felé azzal is magyarázható, hogy az enzim két szempontból is segíti dutp/dttp arány alacsonyan tartását: egyrészt csökkenti a dutp koncentrációját, másrészt termeli a dtmp szintézis előanyagát a dump-t [30] (2. Ábra). Megjegyzendő azonban, hogy míg enterobaktériumokban így az E. coli-ban is a dutpáz reakció a dump elsődleges forrását jelenti (ld. 2. ábra, dctp dezamináz a dcmp dezamináz helyett) [31], eukariótákban dump a dcmp dezamináz által katalizált reakcióban 14

15 is keletkezik, ezért eukariótákban feltehetőleg a timidilát szintáz és a dutpáz enzimeknek kiegyenlítettebb szerepe lehet a megfelelő dutp/dttp arány biztosításában. A DNS-be kétféleképpen bekerült uracilt csupán az különbözteti meg, hogy adeninnel vagy guaninnal szemben áll-e. Tulajdonképpen csak a guaninnal szemben álló, citozinból keletkezett uracil tekinthető mutagén módosulásnak abban az értelemben, hogy az, javítás nélkül, a következő DNS megkettőződéskor stabil pontmutációhoz vezetne. A citozinnak fent vázolt instabilitása lehet a felelős azért, hogy az evolúció során az uracil helyett a nála ugyan bonyolultabb, de vele megegyező bázispárképzési hajlammal rendelkező timin szelektálódott, mint a genetikai információt stabilan hordozó DNS egyik építőköve [9]. Így ugyanis lehetőség nyílt a citozinból átalakult uracil szelektív és hatékony javítására, ami a genetikai információ stabilabb tárolása és továbbadása révén jelenthetett szelekciós előnyt. Ha szemügyre vesszük a rendszert, nem mondhatjuk nyugodt szívvel, hogy a legegyszerűbb, vagy akár a leghatékonyabb megoldást választotta volna az evolúció, de nagyon valószínű, hogy a véletlenek által adott lehetőségek közül a leginkább megfelelőt. Mindazonáltal a jelen timin-dns világunkban a timint helyettesítő uracil sem hatástalan a sejt életében, ugyanis a különböző DNS-kötő fehérjék többnyire a normál timint tartalmazó DNS-hez való viszonyukban evolválódtak, így például egyes transzkripciós faktorok DNS felé mutatott affinitása megváltozik, ha timin helyett uracilt tartalmaz a felismerőhely [32, 33]. Így nagy mennyiségű timint helyettesítő uracil ami ugyan a mutáció gyakoriságot nem növeli - jelentős torzulást okozhat a sejt expressziós mintázatában. Amennyiben a genom csaknem teljes mértékben uracilos, a sejt növekedése és osztódása gyakorlatilag ellehetetlenül [34] (ld fej.) A dutpáz enzim katalitikus funkciója és élettani szerepe A dutpáz enzim a dutp-t dump-vé és anorganikus pirofoszfáttá hidrolizálja (3. ábra). A termék dump egyben a dttp bioszintézisének előanyaga: a timidilát szintáz enzim dtmp-vé konvertálja, ami foszforilációs lépést követően dttp-vé alakul (ld. 2. ábra). Ezzel a dutpáz közvetve két oldalról is segíti a sejtbeli dutp/dttp arány megfelelően alacsony szinten tartását, így hatékonyan képes biztosítani az uracil kizárását az újonnan szintetizálódó DNS-ből. A Drosophila enzim katalitikus hatékonysága dutp szubsztráttal k cat = 12 s -1, K M = 0,4 μm, k cat /K M = 3x10 7 s -1 M -1 értékekkel jellemezhető [35], hasonlóan más eukarióta és 15

16 bakteriális dutpázok katalitikus paramétereihez. A katalízis sebességét a Mg 2+ kofaktor maximalizálja [36]. A dutpázok rendkívül szigorú szubsztrátspecificitással rendelkeznek, mind a bázis, a cukorrész és a foszfátlánc tekintetében [37], ami kétségkívül elengedhetetlen más, a szervezet számára szükséges nukleotidok energiapazarló hidrolízisének elkerülése érdekében. A nagyfokú szubsztrátspecificitást továbbá jól tükrözi, hogy a Drosophila enzim esetén a k cat /K M értékek mind dttp-re, mind dctp-re mintegy öt nagyságrenddel alacsonyabbak [35] (3. ábra). A dutpáz enzimcsalád egységes abban a tekintetben, hogy - a viszonylag alacsony szekvencia-azonosság mellett - minden tagját ugyanaz az öt konzervált szekvencia-motívum jellemzi (4. ábra) [38-40]. Az N-terminális szakaszok nagyobb változatosságot mutatnak, itt találhatók a különböző lokalizációs szignálok. Ugyanakkor két kivételtől eltekintve az összes ismert trimer dutpáz C-terminálisa az 5. motívum után pár aminosavval véget ér, aminek a hátterében az 5. motívumot tartalmazó, glicingazdag, flexibilis P-hurok motívumnak a dutpáz aktivitásában betöltött szerepe [41] állhat. A Drosophila enzim a C-terminálison mintegy 28 aminosavval [39], ill. egy adenovirális enzim 18 aminosavval [42] hosszabb. Ebből a szempontból továbbá a feltehetőleg kovalens trimerként kifejeződő C. elegans dutpáz is kivételt jelent [43]. A jelen munkában még kitérünk a Drosophila fehérjére jellemző extra C-terminális régió feltételezett szerepére (ld. alább és fej.). 16

17 Szerkezeti szempontból a legtöbb dutpáz homotrimer. Kivételt képeznek az emlős Herpes vírusok monomer enzimei, amelyek valószínűleg egy ősi dutpáz-gén 17

18 duplikációjával keletkeztek, és szekvenciájukban az öt motívum más elrendezésben található [44]. A dolgozat a továbbiakban csak a homotrimer dutpázokkal foglalkozik, amely családhoz a Drosophila enzim is tartozik. A homotrimer enzimnek több fajból is ismert a háromdimenziós térszerkezete; általános feltekeredése ("folding ) különösen konzervált, retrovírusoktól az emberig [37, 40, 45]. Az alegységek β-szálai ún. "lekváros tekercs" (jelly roll) módon tekerednek fel antiparalell β-lemezzé, melynek integráns eleme a szomszédos alegység egyik β-szála, így a trimer rendkívül stabil (5. ábra) [37, 45]. A három aktív centrumot a három alegység együttesen hozza létre oly módon, hogy minden egyes aktív hely felépítésében mindhárom alegység részt vesz: az egyik adja az 1., 2., 4., a másik a 3. és a harmadik pedig az 5. motívumot [37, 45]. Ez az 5. motívum az alegységet adó polipeptid szál flexibilis C-terminálisán helyezkedik el, mely régió csak a dutp megkötése után rendeződik az aktív helyen, és elengedhetetlen az enzim aktivitásához [41]. Az alegységek között létrejövő ilyen magas fokú kooperáció eddigi ismereteink szerint egyedülálló a homooligomer fehérjék körében. Míg a szubsztrát kötésben résztvevő oldalláncok már az első háromdimenziós térszerkezetekben is jól azonosíthatók voltak, a támadó vízmolekulát koordináló III. motívumbeli aszpartát azonosítását, a szubsztrát megfelelő orientációjának, valamint a fémion kofaktor helyének meghatározását már csoportunkban Barabás Orsolya végezte [46]. Amellett, hogy a dutpáz család szerkezetéről és katalitikus funkciójáról meglehetősen részletes ismereteink vannak, jócskán akadnak még megválaszolatlan kérdések. Például érdekes megfigyelés, hogy a prokarióta ill. eukarióta/virális enzimek eltérő kooperativitással jellemezhetők, ill. a központi csatornában eltérő az alegységek közti kölcsönhatásokat 18

19 megvalósító oldalláncok polarizáltsága [35, 39]. A prokarióta enzimeknél szorosabb pakoltság jellemző, amit hidrofób oldalláncok valósítanak meg, és az alegységek közt nem tapasztalható kooperativitás. Az eukarióta enzimekre azonban egyfajta allosztérikus viselkedés jellemző, aminek pontos feltárása a csoportban jelenleg is folyik. Szintén érdekes kérdéseket vet fel a különösen bensőséges kapcsolatban lévő monomerek homotrimer szerveződésbe való feltekeredésének mechanizmusa [47]). Amellett, hogy a dutpáz szerkezetét és a katalízis mechanizmusát beható vizsgálat tárgyává tesszük, elengedhetetlen, hogy az enzim sejtbeli összefüggéseit is feltárjuk ahhoz, hogy a valódi funkciójáról részletes képet kapjunk. Ezért szükséges áttekinteni, mit tudunk az enzim élettani jelentőségéről, fiziológiás izoformáiról, kifejeződésének szabályozásáról, esetleges kölcsönható partnereiről, az aktivitás poszt-transzlációs módosítások, vagy fehérjepartnerek által történő szabályozhatóságáról. A dutpáz enzim aktivitása esszenciálisnak tűnik minden aktívan osztódó sejt számára. Hiányában felborul a dutp/dttp egyébként szigorúan szabályozott aránya, ami az újonnan szintetizálódó DNS-be uracil beépülését eredményezi [9, 29]. Az emelkedett uraciltartalom feltehetőleg túlaktiválja az uracilt kivágó javító mechanizmust, ami végül a sejt programozott halálához vezet, ez az ún. timinmentes sejthalál jelensége (ld fej.). Az enzim esszenciális voltát igazolja az is, hogy null-mutációja több fajban letális [48, 49], továbbá az, hogy számos vírus limitált méretű genomjában kódolja saját dutpázát [38, 50]. A dutpáz génben mutáns (dut-) E. coli törzs esetén - amellett, hogy kizárták a dut génen kívüli változásoknak a letalitásban játszott esetleges szerepét - megfigyelték, hogy a letalitás fennmarad több, elvileg dutpáz-funkcióvesztést kompenzáló mutáció létrehozása mellett is [49]. Ugyanakkor a csupán egyetlen kodonban mutáns, inaktív dutpáz fehérjét kifejező törzs ung- háttéren életképes, bár DNS-e jellemzően emelkedett uracil mennyiséget tartalmaz (ld. CJ236 sejtvonal, [29, 49]). Az előbbiekből arra következtetnek, hogy a dut génnek a dutpáz aktivitáson túl egyéb esszenciális funkciója is lehet E. coli-ban [49]. Amellett, hogy a dut gén szekvencia esetleg létfontosságú szabályozó elemeket, vagy esetleg egy másik létfontosságú gént hordozhat, elképzelhető az is, hogy magának a dutpáz fehérjének van alternatív esszenciális funkciója, amiről mostanáig nem áll rendelkezésre egyéb kísérletes adat. Humán sejtvonalakban a dutpáz két izoformáját azonosították, melyek alternatív promóterhasználat révén keletkeznek [51, 52]. A rövidebb izoforma magi lokalizációt mutat, amit az N-terminálison azonosított nukleáris lokalizációs szignál (NLS) is megerősít [53]. A hosszabb izoforma mitokondriális lokalizációjáért egy hosszú (mintegy 60 aminosavas) N- terminális szignál szekvencia felelős [52, 54]. A nukleáris izoforma N-terminálisa tartalmaz 19

20 egy ciklinfüggő kináz konszenzus foszforilációs helyet, ami in vitro a cdc2 kinázzal foszforilálható is [55]. Ez a foszforiláció ugyanakkor, úgy tűnik, nincs hatással sem a lokalizációra, sem az enzimaktivitásra [51], annak ellenére sem, hogy korábban Herpes simplex vírus fertőzés során a gazdaszervezet dutpázának defoszforilálódásával összefüggésben az aktivitás csökkenését mutatták ki [56]. Bár a foszforiláció szerepe nem világos, elképzelhető, hogy fehérje-fehérje kölcsönhatásokat vagy a fehérje élettartamát befolyásolja. A mitokondriális izoforma szerepe ill. élettani jelentősége sem tisztázott teljes mértékben, azonban a mitokondriális DNS károsodás öregedéssel való kapcsolatának kiterjedt irodalma van (ld. a köv. összefoglaló cikkek: [57-59]). Pusztán az a tény, hogy legalábbis humán sejtvonalakban, mind a fő UDG-nek (ld fej.), mind a dutpáznak konstitutívan kifejeződik mitokondriális izoformája, megerősíti a sejtciklustól függetlenül folyamatosan osztódó mitokondriális DNS-ben fellépő uracilhibák javítására evolválódott mechanizmus létét [51]. Az enzim expressziója többnyire a sejciklustól függ: közvetlenül S-fázis előtt és alatt jelentős a kifejeződése [54, 60, 61], ami összecseng azzal, hogy elsősorban DNSreplikációnál fontos a megfelelően alacsony dutp/dttp arány. Ettől eltérő expressziós szabályozásra is találunk példát. Egyrészt éretlen immunsejtekben a dutpáz foszforilált és foszforilálatlan formája egyaránt magas konstitutív expressziós szintet mutat, ami az enzimnek a sejtciklustól független funkciójára is utal egyben [62]. Ez a konstitutív kifejeződés feltehetőleg kapcsolatban lehet az immunoglobulin gének diverzifikációjában szerepet játszó enzimatikus citozin dezaminálás folyamatával (ld fej.). Másrészt Drosophila lárvákból az enzim aktivitásának hiányát mutatták ki [63], ami ellentmondani látszik az enzim esszenciális funkciójának. Nem világos továbbá az sem, hogy a DNSjavításkor történő DNS-szintézis során - ami nemcsak S-fázisban és előtte zajlik, ld. transzkripció kapcsolt javítás (TCR) [64] - miképp biztosítódik a megfelelő dutp/dttp arány. Lehetséges, hogy ez a javító szintézis olyan rövid szakaszokat és relatíve keveset érint csupán, hogy magasabb dutp koncentráció mellett is biztosítható az új szakasz uracilmentessége? A hosszú szakaszos báziskivágásos javító mechanizmus (BER) során 6-15 nukleotidnyi szakaszok [65, 66], a nukleotidkivágó javító mechanizmus (NER) során 30nt hosszú szakaszok [67] újraszintézise történik. Az is feltételezhető, hogy alacsonyabb koncentrációban jelenlevő dutpáz is elegendő, amennyiben az a javítás helyén lokalizálódik feltételezett specifikus fehérje-fehérje kölcsönhatások révén. Ez esetben indokolt a dutpáz sejtbeli kölcsönható partnereinek módszeres vizsgálata. Eddig néhány egyedi esetben azonosítottak feltételezett dutpáz partnereket (dutpázzal kölcsönható patkány PPARα (peroxiszóma proliferátor aktiválta receptor α) 20

21 [68], továbbá egy virális nukleokapszid-dutpáz fúziós fehérje partnerei [69]), de a kölcsönhatások fiziológiás jelentősége messze nem tisztázott. Két dutpáz-gátló aktivitásról szóló beszámoló (Drosophila-ban [5] ill. PBS2 fágban [70]) azt sugallja, hogy a dutpáz aktivitás esetleg bizonyos faktorok által regulálható, azonban az inhibitor fehérjék mindkét esetben azonosítatlanok maradtak. A PBS2 fág dutpáz inhibitora 83 kd látszólagos molekulatömeggel bíró homodimer, hőérzékeny, a dutpázhoz monomer formában, reverzibilisen kötődő fehérje, mely kovalensen nem módosítja a dutpázt, ph-optimuma 6,5 körül van, gátló aktivitása ph = 8,5-9,0 tartományban drasztikusan lecsökken [70]. Az előbbivel szemben a Drosophila-ban leírt inhibitor fehérje léte és aktivitása sokkal kevésbé alátámasztott: 61 kd látszólagos molekulatömegű, hőstabil fehérje, de a dutpázzal alkotott komplexét nem mutatták ki, sőt meghagyták a lehetőségét annak, hogy a dutpáz esetleg elszenved valamiféle módosulást, akár degradációt is a gátlás során [5]. A jelen dolgozatban vizsgált Drosophila dutpáz a homotrimer dutpázokhoz tartozik, hiánytalanul tartalmazza a dutpázokra jellemző öt konzervált szekvencia motívumot. A humán enzimmel nagyfokú homológiát mutat. Ennek megfelelően a központi csatornában koordinál egy kétértékű fémiont, ami valamiképp összefüggésben lehet az enzim alegységeinek allosztérikus működésével [35, 39]. A Drosophila enzim egyedi a mintegy 28 aminosavnyi extra C-terminális régióját tekintve, melynek funkciója egyelőre ismeretlen [35]. Mivel a feltételezett NLS (ld fej.), mely a humán enzimben kísérletesen is azonosított szignállal [53] közeli homológiát mutat, a fehérje N-terminálisán található, ennek az extra C-terminális régiónak valószínűleg egyéb szerepe lehet. Feltételezésünk szerint ez az extra régió kölcsönható partnereknek kínálhat felszínt, ill. az enzim egyéb regulációs mechanizmusaiban játszhat fontos szerepet. Korábban az irodalomban az enzim aktivitásának hiányát [63], valamint egy inhibitor fehérje kifejeződését [5] (vö fej.) írták le a Drosophila lárvaállapotok során, mely ellentmondani látszik az enzim esszenciális voltának. Többek között e jelenség hátterében húzódó okokat, ill. következményeinek feltárását tűztük ki célul, amikor az enzim regulációs mechanizmusait kezdtük vizsgálni a Drosophila egyedfejlődése során. 21

22 Báziskivágásos javító mechanizmus az uracilhibára Az uracilhiba javítására a báziskivágásos javító mechanizmus (BER / Base Excision Repair (6. ábra)) szolgál [71]. A BER a DNS-ben előforduló báziskárosodások nagy többségét javítja [72, 73]. Az uracil mellett a sejt anyagcsere folyamataiban keletkező és/vagy külső környezeti tényezők hatására megjelenő reaktív oxigéngyökök (ROS / reactive oxygen species) által indukált oxidatív bázismódosulásokat is a BER javítja, mint a leggyakoribb 8-oxoguanint, továbbá timinglikolt, 5-hidroxicitozint, formamidopirimidint [73]. Továbbá szintén a BER felelős az alkiláló ágensek hatására bekövetkező léziók többségének javításáért is, ilyen a 3-metiladenin, 7-metilguanin [74]. Valamint annak ellenére, hogy az UV-indukált pirimidin dimerek javításában a nukleotidkivágó javító mechanizmusnak (NER) van fő szerepe, a ciklobután timin dimerek javítását a BER is végezheti [75]. A BER-ben az első lépés mindig a DNS-glikozilázoké, amelyek a hibás bázis glikozidos kötését elhasítják, és bázismentes helyet hagynak maguk után. A glikozilázok ismert hatékonyságának hátterében feltehetőleg az áll, hogy a DNS-en egy dimenzióban 22

23 haladva mintegy pásztázzák azt, ami jelentősen növeli a hiba megtalálásának valószínűségét. A nem hélix-destabilizáló hatású hibák felismeréséhez feltehetőleg a glikoziláz sorban minden egyes bázist kifordít a hélixből, hogy lehetővé váljon a hibás bázis felismerése ill. kivágása [76], ilyen hibák közé tartozhat az adeninnel szemben álló uracil is. Azok a glikozilázok, melyek hélix-destabilizáló hibákat javítanak, ennél lényegesen egyszerűbben: a deformálható hely erősebb kötésével találhatják meg a javítandó helyet [73]. A nagyszámú és változatos hibás bázisokat különböző specifikus DNS glikozilázok tehát uniformizálva bázismentes (AP: apurin/apirimidin) helyekké alakítják, így ezután a közös BER enzimek végezhetik a javítást. Így az uracil hiba esetén az első lépést az UDG enzimcsaládok tagjai végzik [77], melyekből legalább ötféle létezik (ld fejezet). A DNS glikozilázok katalitikus szempontból két osztályba sorolhatók [73]. A monofunkciós DNS glikozilázok csupán a glikozidos kötést hasítják. Ezzel szemben a bifunkciós fehérjében a nukleofil támadásért meghatározott amin csoport a felelős, ezáltal kovalens intermedier alakul ki, ami további átalakulásokat katalizál [78]. Így a cukor-foszfát gerinc is elhasad, ami β-elimináció (egy bevágás a hibás bázistól 3 irányban) [79] ill. β,δ-elimináció (két bevágás 3 és 5 irányban is, szabad 3 foszfát véggel) [80] révén történik aszerint, hogy a támadó amin primer ill. szekunder volt-e. Ezért a glikozilázok után keletkező AP helyek (bázismentes helyek) sem teljesen ekvivalensek, de a bázismentesség és az 5 irányban lévő foszfát csoport érintetlensége tekintetében azonosak. Az eddig ismert UDG-k kivétel nélkül a monofunkciós DNS glikozilázokhoz tartoznak, melyek egyetlen doménből állnak és az uracilt ill. a hibás G:T párban lévő timint vágják ki [81, 82]. A G:T hibás pár a legvalószínűbb módon az 5- metil-citozin dezaminálása révén keletkezik A DNS glikozilázok katalízise nyomán ill. a spontán depurinálódás útján keletkező AP helyek jelentős citotoxicitással bírnak, nem csupán az elveszett információ tartalom miatt, de a replikációs villa [83], ill. a transzkripciós buborék [84] összeomlásához is vezethetnek, ezért további javításuk elengedhetetlen. Ezt támasztja alá az is, hogy élesztőben az AP helyeket tovább javító AP endonukleáz (APE) nullmutációja letális [85]. Ez a letalitás az ung kiütésével elnyomható, más glikozilázok kiütésével azonban nem, ami egyben azt is jelzi, hogy rendes körülmények közt a hibás bázisok közt valóban az uracil jelenti a meghatározó többséget [20]. A bázismentes helyen az APE-k hasítják el 5 irányban a foszfodiészter kötést szabad 3 OH véget, ill. bázismentes 5 -dezoxiribóz-foszfátot hagyva maguk után (6. ábra). Az APE-k mind a 3 irányba bevágott szálon lévő AP helyet, mind az egyes bifunkciós glikozilázok által hagyott 3 foszfátot le tudják hasítani [73]. APE-ból két szerkezeti család ismeretes, melyek különböző módon ugyanazt a reakciót katalizálják. A két család első képviselőit egyaránt E. coli-ban azonosították: az exonukleáz III, ami a humán 23

24 APE1-gyel homológ és az endonukleáz IV, amelynek élesztőben létezik homológja, az APN1 [86]. Mindkét esetben ismert az enzim-dns komplex szerkezete. Az APE1 [87] ill. az endo IV [88] egyaránt kifordítja az AP helyet a hélixből hasonlóan a glikozilázokhoz ill. egyaránt fémionokat használ a foszfátészter-hidrolízis katalizálásához. Említést érdemel, hogy a két ismert szerkezetű APE-n kívül újabban más főként Drosophila riboszómális fehérjékről is kimutattak APE aktivitást [89, 90]. Az APE aktivitást követően a javító DNS polimeráz β, liáz aktivitása révén, lehasítja 5 -drp-ot, majd polimeráz aktivitása révén beépíti a hiányzó bázist [91]. Végül a ligáz III/XRCC1 komplex összevarrja a DNS-szálat [92], ill. emellett a ligáz I-ről is kimutatták, hogy képes a DNS polimeráz β-val kölcsönhatásba lépni [93], és a BER-t lezárni in vitro [94], ami valószínűsíti a BER-ben játszott alternatív szerepét. A BER-en belül megkülönböztetünk ún. hosszú szakaszos ( long patch ) ill. rövid szakaszos ( short patch ) mechanizmust, melyekben részben a szereplők is eltérnek, de fő különbség az újraszintetizált DNS részt alkotó nukleotidok számában van: a rövid szakaszosban csupán a hibás bázis cserélődik le, míg a hosszú szakaszosban 2-15 nukleotidnyi DNS-szakasz újraszintézise történik [65, 66]. Utóbbi esetben általában a DNS polimeráz δ/ε kezdi a polimerizációt, aminek nincs 5 -drp-liáz aktivitása [95]. Így a beépített nukleotidok következtében az 5 -drp-t tartalmazó helyettesített, leváló (flap) szál kimetszéséhez szükség van az ún. flaping endonukleázra (FEN1) [96]. Ez utóbbi alternatív út létét megerősítették in vitro rekonstitúciójával is, mellyel a szaporodó sejt nukleáris antigén (PCNA) fehérje szükségességét is kimutatták [97]. A hosszú szakaszos BER-ben is lehet a DNS polimeráz β a javítás kulcsszereplője, ekkor azonban maximum 6 nukleotidnyi szakasz cserélődik le [98, 99], továbbá kimutatták, hogy a poli(adp-ribóz) polimeráz-1 (PARP-1) stimulálja a DNS polimeráz β hosszú szakaszos aktivitását [100]. Hogy melyik út milyen fiziológiás környezetben játszik szerepet, és miért, még nem teljesen tisztázott. Az uracilhiba feltehetőleg mind a hosszú szakaszos, mind a rövid szakaszos mechanizmussal javítódik attól függően, hogy melyik UDG kezdeményezi, és a sejtciklus mely fázisában történik a javítás [101]. Magasabb rendű eukarióta szervezetekben a BER folyamatában további fontos fehérjék is részt vesznek, mint a PARP, az XRCC1, vagy a p53 [73]. Ezek funkciója a DNSkárosodás helyén történő fehérjetoborzástól az egész javítás szabályozásáig terjedően meglehetősen sokrétű, és kevésbé egyszerűen megfogható, mint a javítás alaplépéseit végző enzimek szerepe. A PARP a BER-ben mégis kulcsszerepet játszik, amit az is alátámaszt, hogy PARP-1 deficiens egér sejtextraktumban az AP helyek nem javítódnak megfelelően [102]. A PARP-1-ről tudjuk, hogy az egyes száltörésekhez köt [103], szerepe abban lehet, 24

25 hogy a DNS-szálon haladva felismeri az APE által elvágott helyeket, és ott további DNSjavító fehérjéket toboroz (direkt kölcsönhatásba lép például a DNS polimeráz β-val és az XRCC1 fehérjével) [73]. A PARP által katalizált poszt-transzlációs módosításnak sokrétű szabályozó szerepe van attól függően, hogy mi a célfehérje, ill. milyen fiziológiás folyamatban történik a módosítás. A hisztonok poli(adp-ribozil)-álása révén például fellazul a kromatin szerveződés, ami az esetleges javítás számára hozzáférhetőbbé teszi a DNS-t [104]. Az XRCC1 (X-ray Repair Cross Complementing protein 1) mindenekelőtt fehérjetoborzásban játszik szerepet, nagyobb fehérjekomplex összeszerelődéséhez kínálva felszínt ( scaffold ): közvetlen kölcsönhatásban van a fő APE-vel, a DNS polimeráz β-val, a DNS ligáz III-mal, valamint glikozilázok közül a hogg1-gyel, aminek aktivitását ez a kölcsönhatás stimulálja is [73]. A p53 transzkripciós faktor szerepén túl közvetlenül stimulálja a BER-t: kölcsönhat a DNS polimeráz β-val és stabilizálja az AP helyet tartalmazó DNS-sel alkotott komplexét [73]. A fenti kölcsönhatások továbbá arra utalnak, hogy a javításban nagyméretű komplexek szerelődhetnek össze ugyan eddig még nem izoláltak és jellemeztek ilyen nagyméretű, stabil BER komplexet. Továbbá ismeretes, hogy a BER enzimei egymásra stimuláló hatással vannak, így például a humán fő APE stimulál több glikozilázt is, köztük két UDG-t [105, 106], bár direkt kölcsönhatást ezekkel a glikozilázokkal még nem sikerült kimutatni. A humán APE1 stimulálja a FEN1 és a DNS ligáz I aktivitását is [107]. Megjegyzem, hogy az irodalomban mutatkozik egyfajta hiátus: eukarióta szervezetek közül csupán emlősökben és élesztőben vizsgálták részletesen a DNS-javító rendszereket és e kettő között helyet foglaló fajok meglehetősen alulreprezentáltak a területen. Így nem tudhatjuk pontosan, hogy például a Drosophila ilyen esetben a magasabb rendű eukariótákhoz (emlősök), vagy a jórészt élesztő képviselte alacsonyabb rendű eukariótákhoz áll-e közelebb. Főként bioinformatikai eredményekre alapozva feltehető, hogy Drosophilaban a DNS-javító fehérjék terén meglehetősen nagy eltérések mutatkoznak mindkét fent említett csoporthoz viszonyítva [108, 109]. A DNS-javítást hagyományosan a sejtciklus ellenőrzési pontjaihoz kötött folyamatnak tartották, de mára egyértelművé vált, hogy a genetikai információ védelme a transzkripcióhoz kötődve (transzkripció-kapcsolt javítás: TCR [64]) éppúgy, mint a sejtciklus során folyamatosan (globális genom javítás: GGR) [110, 111] fontos megoldandó feladat a legtöbb élő sejt számára. Így az uracilt kivágó BER működése is a sejtciklus során változó intenzitású lehet, de feltehetőleg nem szorítkozik csupán a sejtciklus ellenőrzési pontjaira. Egyrészt a fő UDG (UNG2, ld. köv. fej.) S-fázishoz kötött expressziója [112] arra utal, hogy ennek az enzimnek a DNS replikáció során a visszaolvasó hibajavításban van elsődleges szerepe. 25

26 Ugyanakkor más UDG-k nem mutatnak ilyen sejtciklus-függő kifejeződést (ld. köv. fej.). Továbbá az UNG és az APE aktív nukleoszómális pakoltságú DNS-en is [113], ami azt sugallja, hogy nemcsak a replikációhoz, ill. a transzkripcióhoz kötődve működhet az uracilt kivágó javítás. Számos további érdekes kérdés vetődik fel a BER szabályozását ill. más sejtbiológiai folyamatokhoz való kapcsolatát illetően, amire itt most nem tudok részletesen kitérni. Mindenképpen említést érdemel azonban, hogy egy-egy BER enzimre gyakran nagyfokú multifunkcionalitás jellemző. Így például a fő APE ahogy azt másik neve (redox factor 1, Ref1) is tükrözi - redox-függő transzkripciós aktivátor szereppel is bír [114]. Továbbá egyes UDG-kről is ismert transzkripciós szabályozó szerep (ld. köv. fej.), míg a PARP enzimnek az apoptózis indukcióval kapcsolatos szerepe egyértelmű [115]. Egyes BER fehérjékben mutáns egyedek megnövekedett mutációs gyakorisága, súlyos rákos elfajulásai vagy esetleg letalitása a DNS-javítás lényeges szerepét igazolják. Ugyanakkor a legtöbb glikoziláz hiánya egérben nem okoz azonnal szembetűnő fenotípusos változást. Ennek hátterében egyrészt egyes glikozilázok szélesebb szubsztrátspecificitása révén lehetővé váló redundancia állhat. Másrészt a glikoziláz kiesése folytán esetleg megnövekedett mutációs gyakoriság nem feltétlenül okoz azonnal szembeötlő változást. A BER fehérjék szintjének zavarai rákképződéshez is vezethetnek, ami továbbá megerősíti a javító mechanizmus bonyolult szabályozásának élettani fontosságát is. Így több rosszindulatú daganat esetében megfigyelték az APE1 túltermelődését [ ], ami egyes transzkripciós faktorok redox aktiválása révén a sejthalál kikerülését segítheti a kontrollálatlanul osztódó daganatban. A relatíve kis pontosságú DNS polimeráz β túltermelése szintén növelheti a rákképződés gyakoriságát [119, 120], ahogy a túlexpresszált glikozilázok nyomán feltehetőleg felhalmozódó AP helyek is hasonló hatást eredményezhetnek [121, 122] Az U-DNS glikoziláz (UDG) családok jellemzése Az uracil felismerésében kritikus szerepet játszó UDG-knek több családját is ismerjük, melyek meglehetősen különböznek egymástól mind a szubsztrátspecificitásukat, mind pedig a fiziológiás szerepüket illetően. A rendkívül kiterjedt irodalom áttekintését nehezíti, hogy a használt rövidítések nem csak sokfélék, de olykor-olykor egymásnak ellentmondók is, különös tekintettel az adatbázisokra. Emlősökben legalább öt UDG család ismert, úgy mint 26