A következő 2 előadás diái mind a számonkért anyag részei

Átírás

1 Sejtmag, kromatin A következő 2 előadás diái mind a számonkért anyag részei Hoechst BrdU+anti-BrdU

2 A sejtmag funkciói tárolja és védi a kromoszómákba szervezödött DNS-t külön kompartmentet képez transzkripció helye replikáció itt zajlik A sejtmag funkciói tárolja és védi a kromoszómákba szervezödött DNS-t külön kompartmentet képez transzkripció helye replikáció itt zajlik repair és rekombinációs folyamatok riboszómák gyártása a nukleoluszban A sejtmag kompartmentalizációjának szerepe transzkripció és transzláció különválása exon-intron struktúra kialakulása az exonok, és ezen keresztül a protein domének szabad kombinációja az eukarióta világ evolúciójának motorja A sejtmag szerkezete fénymikroszkóp legnagyobb sejtalkotó (5-10 µm) kromatin állomány nukleolusz EM eukromatin, heterokromatin intranukleáris szuborganellumok kettős magmembrán határolja nukleáris mátrix nukleoplazma

3 Kromatin állomány a nukleinsavak és a hozzá kapcsolódó fehérjék a magban: DNS, RNS, hisztonok, hiszton variánsok és nem-hiszton fehérjék (szabályozó fehérjék, átíró-, replikációs- és repair-apparátus fehérjéi) eukromatin és heterokromatin (fakultatív, konstitutív) Kromatin állomány a nukleinsavak és a hozzá kapcsolódó fehérjék a magban: DNS, RNS, hisztonok, hiszton variánsok és nem-hiszton fehérjék (szabályozó fehérjék, átíró-, replikációs- és repair-apparátus fehérjéi) eukromatin és heterokromatin (fakultatív, konstitutív) Diploid emberi sejt: 6.2 pg DNS 2 x 3000 Mb 46 kromoszóma átlagosan 4-5 cm DNS egy kromoszómában ~ 2 m DNS egy sejtben Kompaktálódás foka: kb x A génsűrűség a kromoszómák mentén fluktuál Gén-denz régiók: RIDGEs (regions of increased gene expression), gén / kb Hatalmas gén-szegény területek: anti- RIDGEs.

4 Különböző sejtek DNS tartalma: T m, reasszociációs kinetika, hibridizáció, ismétlődő szekvenciák Visualization of repetitive elements based on sequence information Különleges DNS struktúrák előfordulása Dotplot Sequence A RNS Sequence A Hairpin R-loop G4-DNS etc.

5 Hierarchikus csomagolódási elv A kromatin elemi szerkezeti egysége a nukleoszóma exonok átlagos mérete átlagosan 200 bp DNS-t tartalmaz 5 féle hiszton fehérje építi fel (+speciális hisztonok) nukleoszóma magja (core partikulum): 146 bp DNS és 2-2 db H2A, H2B, H3 és H4 hiszton fehérje internukleoszómális összekötő DNS (linker régió): H1-nal fedett DNS és fedetlen, változó hosszúságú DNS szakasz Elektron spektroszkópiás analízis: 10 nm-es rostok még heterokromatinon belül is! ionerősség, bivalens ionok és H1 hiánya

6 Protease which degrades histones nucleus 4 nm DNS dupla- spirál nukleoszomális gyöngysor 30 nm rost (?) Sepsis: the dark side of histones Catherine Chaput & Arturo Zychlinsky Nature Medicine 15, (2009) Hadlaczky Gyula, SzBK DNS kb hurok mely a S/MAR szekvenciáknál rögzített a matrixhoz A szuperhelicitás génszabályozó szerepe: A hurkokon belül szuperhelicitás, Angelman szindróma gyógyítható az egészséges de elhallgattatott allél szuperhelicitásának változtatásával! melynek mértéke változik a transzkripció folyamán

7 As a result of a process dubbed imprinting, the paternal copy of UBE3A is normally silenced in neurons, and the protein is only expressed from the maternally inherited copy. Szuperhelicitás regulációja: topoizomerázok mérgeik: citotoxikus szerek Top I: egyszál hasítás majd re-ligáció Top II: duplaszál hasítás, majd re- ligáció Often classified as an autism spectrum disorder (ASD), Angelman syndrome is marked by developmental delay, lack of speech, seizures and motor difficulties. Kihorgonyzódás: mag mátrix Nukleoszkeleton nuclear lamina - lamin A, B, C S/MAR: scaffold/matrix associated/attached regions A mag mátrix preparálása detergens kezelés nukleáz emésztés hisztonok eltávolítása magas só koncentráció mellett só extrakció után is funkcionális komplexek azonban

8 Kromoszómák Kariogramm osztódási ciklus fázisától függően: interfázisos metafázisos speciális: lámpakefe (meiotikus, kétéltű oocyta) polytene (Drosophyla) - a metafázisos sejt kromoszóma állománya: 2 x 22 autoszomális és 2 ivari kromoszóma Kromoszóma festés Azonos testvér kromatidák Q sávok quinakrin festés G sávok proteolitikus kezelés utáni Giemsa-festés R sávok forró alkalikus kezelés utáni Giemsa-festés Metafázis kromoszóma Másodlagos befűződés (nukleólusz organizátor) kondenzinek: kromoszóma kondenz. kohezinek: testvér kromatid kapcs. >200 fehérje

9 Fig. 2 Changes in cohesin association with chromatin during mitosis. During G2 sister chromatids are held together by cohesin. Upon entry into mitosis, most of the arm cohesin is removed, sister chromatids, resolve and condense. After attachment of kinetochores to microtubules emanating from opposite spindle poles, centromeric cohesin is cleaved by separase and sister chromatids are segregated in anaphase. Images show chromosomal DNA marked with H2B-GFP. Scale bar 5µm Fig. 1 Model for chromosome condensation. a Upon prolonged arrest with spindle poisons mitotic chromosomes become hypercondensed. DAPI staining of chromosome spreads of unarrested (left) and nocodazole arrested (right) cells. b Model for chromosome condensation mediated by topo II, c condensins and d histone modifications. Scale bar 5µm Chromosome Research, Volume 19, Number 3, Chromosome Research, Volume 19, Number 3, Rend a magban (SZEMINÁRIUM) Interphase Heterokromatin Eukromatin R-sávok G- ill. Q-sávok

10 Kompartmentalizáció a magban Magvacska (nukleolusz) GC FC DFC rdna rrns A kromoszómák lehetséges elhelyezkedése az interfázisos magban INTERFÁZISOS KROMOSZÓMA TERRITÓREUMOK BrdU-pulse FISH néhány osztódás.. anti-brdu

11 Transzkripciós gyárak RNA immunofish haemoglobin β-chain complex 25 Mb távolságban (chr. 7) erythroid associated factor RNA polymerase II Dr. Balázs Margit felvétele 2 µm 672 SEPTEMBER 2005 VOLUME 6 Replikációs gyárak nucleozid-analóg inkorporáció: az S-fázis előrehaladásával változó sztérikus mintázat korai S mid S késői S NATURE REVIEWS GENETICS VOLUME 6 SEPTEMBER Figure 4 Organizer factory. Clustered RNA polymerase II motor proteins organize genes and distal regulatory elements by using non-coding intergenic transcription. Rather than polymerases sliding along chromatin, chromatin moves through the factory that is powered by the energy released by the hydrolysis of nucleotide triphosphates during elongating RNA synthesis. Black arrows, gene promoters; blue arrows, direction of chromatin movement; LCR, locus control region; red arrows, intergenic promoters. Chakalova et al., NATURE REVIEWS GENETICS VOLUME 6 SEPTEMBER

12 Nukleáris szuborganellumok (testek) Dextrane chromatin overlay Dextrane chromatin EM: nucleolus EM ill. (auto)antitestek: speckle coiled body (Cajal) PML, PML/RAR Transzkripciós és replikációs gyárak Polycomb testecskék Repair fókuszok Condensed chromatin domains in the mammalian nucleus are accessible to large macromolecules Verschure et al., EMBO reports VOL 4 NO , 861 Mi a bepakolódás funkcionális következménye?? Meggátolja a hurkokon belüli és hurkok közötti interakciókat! lehetős ség: van Interak kcióra nincs Chromosome conformation and transcriptional activity are affected by the association of chromosomal regions with peripheral or central subcompartments. Association of chromosomal regions with peripheral or central subcompartments. (a) The nuclear lamina and adjacent nuclear space, (b) nuclear pore complexes, (c) a nucleolus, where ribosomal DNA loci from different chromosomes cluster, (d) a transcription factory, where coregulated genes preferentially colocalize, and (e) a polycomb body. The filled gray region represents a CT that is interacting with both a and c. Rajapakse I, Groudine M J Cell Biol 2011;192: Gene Recruitment Sequences (GRS) target the gene to the nuclear periphery. Nat Cell Biol February; 12(2): Rajapakse and Groudine

13 Vázak kapcsolódása: fantázia rajzon és megfigyelések alapján: modell a SUN proteinek közvetítette kapcsolatról a citoplazmatikus aktin filamentumokkal Haque F et al. J. Biol. Chem. 2010;285: by American Society for Biochemistry and Molecular Biology Intranukleáris kompartmentalizáció eukromatin és heterokromatin korán és későn replikálódó kromatin magvacska (nukleólusz) és kompartmentjei egyéb nukleáris szuborganellumok: speckle, PML-test, coiled (Cajal) body,... interfázisos kromoszoma territóreumok replikációs ill. transzkripciós gyárak Makromolekulák mozgása a magban

14 Elsődlegesen diffúzióval SPT Different classes of mean square displacement of tracked nuclear vimentin particles. a) Mean squared displacement (MSD) of four representative modes of particle mobility (x-axis: acquisition time in seconds; y-axis: MSD). Roman numbers: I) confined diffusion; II) obstructed diffusion; III) normal diffusion; IV) directed motion (The numeration refers to indicated trajectories in Figure 3a). b) The four different mobility classes are represented by particle trajectories. The trajectories correlate to the numbers indicated by arrows in Figure 3a. Bacher et al. BMC Cell Biology :45 doi: / mrns Krom moszóm ma territ tórium mok Dr. Anna Szeles, Karolinska Institutet, Stockholm Dynamics of single mrnp nucleocytoplasmic transport and export through the nuclear pore in living cells. Moret al., Nature Cell Biology VOLUME 12 NUMBER 6 JUNE 2010

15 A perinuclear actin cap regulates nuclear shape. Shyam B. Khatau et al., PNAS November 10, 2009 vol. 106 no