PANNON EGYETEM Georgikon Kar KESZTHELY Festetics Doktori Iskola Doktori értekezés (PhD) tézisei A takarmányozás hatása egyes fizikai, kémiai, szövettani és mikrobiológiai paraméterek változására brojlercsirkék bélcsövében Molnár Andor Konzulens: Dr. Dublecz Károly egyetemi tanár KESZTHELY 2018.
PANNON EGYETEM Georgikon Kar KESZTHELY Festetics Doktori Iskola Doktori értekezés (PhD) tézisei A takarmányozás hatása egyes fizikai, kémiai, szövettani és mikrobiológiai paraméterek változására brojlercsirkék bélcsövében Molnár Andor Konzulens: Dr. Dublecz Károly egyetemi tanár KESZTHELY 2018. 2
Tartalom 1. CÉLKITŰZÉSEK... 4 2. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK... 6 2.1. I. Kísérlet... 6 2.2. II. Kísérlet... 7 3. EREDMÉNYEK... 8 3.1. I. Kísérlet... 8 3.2. II. Kísérlet... 9 4. KÖVETKEZTETÉSEK...11 5. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK...12 6. PUBLIKÁCIÓS TEVÉKENYSÉG...14 3
1. CÉLKITŰZÉSEK Vizsgálatainknak az volt a célja, hogy különböző gabona magvak és takarmány-kiegészítők bél egészségére kifejtett hatásait tanulmányozzuk és ezzel a bél egészségét támogató takarmányozási módszereket dolgozzunk ki, amelyek alternatívát jelentenek az antibiotikum hozamfokozók használatára a csirketartásban. A célkitűzés megvalósítása érdekében két kísérletet végeztünk. Az első kísérletünk fő témája egy kukorica alapú és a kukorica egy jelentős részének búzával történő helyettesítésével készített takarmánykeverék etetésének (nem-keményítő szénhidrát bontó enzimmel vagy anélkül) Campylobacter jejuni (C. jejuni) kolonizációjára kifejtett hatásának tanulmányozása volt. A második kísérletünkben 4 különböző forrásból származó, oldható nem-emészthető szénhidrátot magas arányban tartalmazó takarmánykeveréket (búzás, árpás, inulinos, laktózos) vizsgáltunk, összehasonlítva egy kontroll, kukorica alapú takarmánykeverékkel. A bél egészségének felmérése érdekében e kísérletekben vizsgáltuk a bél morfológiai paramétereit, a bélhám rétegének goblet sejt és lymphocyta számát, a vakbél ph 4
alakulását, rövidszénláncú zsírsav tartalmát, valamint a vakbél Lactobacillus és coliform populációját. Ugyancsak megvizsgáltuk azt, hogy a különböző takarmányozásban részesült csirkékből vett bélnyálka befolyásolja-e a butirát (vajsav) Campylobacter-ellenes hatását. 5
2. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 2.1. I. Kísérlet A kísérlet kezdetén 54, Ross-308-as napos csirkét háromféle takarmányozási csoportba osztottunk: kukorica alapú (K), kukorica-búza alapú (K+B) és kukorica-búza alapú NSP (nem-keményítő szénhidrát) bontó enzimmel kiegészített (K+BE) csoportokba. A csirkéket mélyalmos rendszerben (faforgácson) neveltük és ad libitum takarmányoztuk. A dercés formátumú kísérleti takarmányokat úgy alakítottuk, hogy azonos energia- és fehérjetartalommal rendelkezzenek, valamint hogy a Ross- 308-as fajta igényeinek megfeleljenek. A 14. napon minden csirkét 10 8 CFU C. jejunival (NCTC 12744-es referencia törzs) fertőztünk szájon át. A fertőzést követően a 7., 14. és 21. napon csoportonként 6-6 állatot leöltünk és mintát vettünk a csípőbél valamint a vakbél tartalmakból a C. jejuni tenyésztése érdekében. A csípőbél tartalomból viszkozitást mértünk, a csípő- és vakbél tartalomból meghatároztuk a ph értéket, valamint gázkromatográfiával azokból a rövidszénláncú zsírsavak koncentrációit. A csípőbélből kimetszettünk egy szakaszt, amelyet szövettani vizsgálatok céljára használtuk fel. 6
2.2. II. Kísérlet Összesen 200, Ross-308-as napos kakast állítottunk a kísérletbe. A napos csirkéket csoportokban, mélyalmos rendszerben (szalma) neveltük. Öt takarmányozási csoport került kialakításra a betelepítés során (n=40): kukorica alapú (kontroll), kukorica-búza alapú (K+B), kukorica-árpa alapú (K+Á), inulinnal kiegészített kukorica alapú (K+I) és laktózzal kiegészített kukorica alapú (K+L). A K+I és K+L tápok 20 g/kg inulint és 30 g/kg laktózt tartalmaztak, külön-külön. A csirkék testtömegét mértük az első és a 35. napokon. A 28. napon csoportonként három állatot leöltünk és a csípőbelükből nyálka mintát vettünk. A csípőbél nyálka mintákon in vitro körülmények között vizsgáltuk a vajsav Campylobacter ellenes hatásának alakulását. A 35. napon csoportonként 12 csirkét leöltünk és a csípőbélből (a Meckel-gurdélytól 10 cm-el disztális irányban) egy centiméter hosszú bélszövet darabokat gyűjtöttünk, majd azokat foszfát pufferolt formalinba helyeztük szövettani vizsgálat céljából. A csípőbél tartalomból mintát vettünk viszkozitás mérésre, a vakbél tartalomból a rövidszénláncú zsírsavak vizsgálatára, ph mérésre és baktériumtenyésztésre. 7
3. EREDMÉNYEK 3.1. I. Kísérlet Az etetett takarmánykeverék fajtája önmagában nem, de az enzim-kiegészítés befolyásolta a Campylobacter kolonizációját a béltartalmakban. A kontroll táphoz képest a K+BE csoportban alacsonyabb Campylobacter számokat találtunk a csípőbélben és a vakbélben 14 nappal a fertőzést követően (P < 0,01). Nem volt azonban különbség a fertőzést követő 7. és 21. napon (P 0,05). A csípőbéltartalom viszkozitása megnőtt (P < 0,01) a K+B csoportban a kontroll takarmánykeverék etetéséhez viszonyítva. A K+BE táp hatással volt a csípőbél morfológiájára, megnövelte a bélbolyhok hosszát (P < 0,01), a kripták mélységét (P < 0,01), az izomréteg vastagságát (P < 0,05) és növekedett rövidszénláncú zsírsav koncentrációt (P < 0,05) eredményezett a vakbélben a kontrollhoz képest. A csípőbélben mért ph-ra a takarmányozás nem volt hatással (P 0,05). A vakbéltartalom ph értékét a K+BE takarmánykeverék etetése csökkentette a fertőzést követő 21. napon (P < 0,01). 8
3.2. II. Kísérlet A takarmányozás nem befolyásolta szignifikánsan a 35. napi testsúlyokat (P 0,05). A különböző nememészthető szénhidrát források nem gyakoroltak hatást a bélbolyhok hosszát, a goblet sejtek és intraepitheliális lymphocyták számát (P 0,05) illetően, de mindegyik csökkentette a kripták mélységét a kontrollhoz viszonyítva (P < 0,01). A boholy/kripta hossz arány (P < 0,05) egyedül a K+L csoportban változott meg. A vakbél ph értékei alacsonyabbnak mutatkoztak mind a K+B, a K+Á, a K+I és a K+L takarmánykeverék etetésekor, a kontroll táphoz képest (P < 0,05). A legalacsonyabb vakbél ph értéket a K+I takarmánykeverék esetében mértük. A K+B takarmány etetésekor megnövekedett a vakbél vajsav és összes rövidszénláncú zsírsav koncentrációja (P < 0,05), valamint a K+L táp etetésekor csökkent a vakbél valerát koncentrációja (P < 0,05) a kontrollhoz viszonyítva. Egy kísérleti takarmánykezelés sem gyakorolt hatást a vakbél Lactobacillus kolonizációjára (P 0,05), azonban a vakbél coliformjainak megemelkedett számát (P < 0,01) tapasztaltuk a K+B, K+Á, K+I és K+L takarmánykeverékek etetésekor. A bélnyálka in vitro kísérletünk azt mutatta, hogy a különböző takarmányozási 9
csoportból származó bélnyálka nem befolyásolja a vajsav Campylobacter-ellenes hatását. 10
4. KÖVETKEZTETÉSEK Az első kísérletben a K+BE takarmány pozitívan befolyásolta a vizsgált bél paramétereket, késleltette a C. jejuni kolonizációját, ezért alkalmas lehet arra, hogy a gyakorlatban alkalmazva csökkentse a kórokozó vágóhídi terjedését. A második kísérletben a különböző forrásból származó nem-emészthető szénhidrátok pozitívan hatottak a vizsgált bél paraméterekre, de más-más pontokon fejtették ki kedvező hatásukat. Az alkalmazott komponenseket nehéz egyértelműen rangsorolni a bélre kifejtett hatásuk alapján. Néhány olyan paramétert is megfigyeltünk azonban, amelyeket együttesen befolyásoltak a magasabb nem-emészthető szénhidrát tartalmú takarmányok, segítve ezzel a bél ökoszisztéma komplex működésének jobb megértését. 11
5. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK 1. Elsőízben tanulmányoztuk kísérletünkben a búza alapú tápok hatását a C. jejuni kolonizációjára mesterséges fertőzést követően többszörös mintavétellel. Kísérletünkben a xylanáz/glükanáz enzimmel kiegészített búza alapú takarmány késleltette a csípőbélben és a vakbélben mérhető Campylobacter jejuni kolonizációját, ami a fertőzést követő 14. napon alacsonyabb baktériumszámokban mutatkozott meg, a kukorica alapú takarmány etetéséhez viszonyítva. 2. Nem-emészthető szénhidrátokat magasabb arányban tartalmazó (búzával, árpával, inulinnal vagy tejcukorral kiegészített) takarmánykeverékek hasonló módon csökkentették a csípőbél nyálkahártya kriptamélységét, a vakbélben mért ph értéket, valamint növelték a vakbél coliform baktériumainak számát a kukorica alapú takarmányhoz viszonyítva. A vizsgált takarmánykezelések a vakbélbeli Lactobacillus számokra nem voltak hatással. A vizsgált nem-emészthető szénhidrát források közül - az alkalmazott bekeverési arányban -, csak a búzával kiegészített takarmány növelte a vakbél vajsav és összes rövidszénláncú zsírsav koncentrációit. 12
3. Vágókorú pecsenyecsirkében a tejcukorral kiegészített kukorica alapú táp megnövelte a csípőbél boholy/kripta hossz arányát, csökkentette a vakbél ph értékét és a vakbél valerát koncentrációját a kukorica alapú takarmány etetéséhez képest. 4. A bélnyálka in vitro kísérletünk azt mutatta, hogy a különböző takarmányozási csoportból származó bélnyálkák nem befolyásolják a vajsav Campylobacterellenes hatását. 13
6. PUBLIKÁCIÓS TEVÉKENYSÉG A disszertáció témakörében megjelent angol nyelvű lektorált publikációk: Molnár, A., Hess, C., Pál, L., Wágner, L., Awad, W.A., Husvéth, F., Hess, M. and Dublecz, K. (2015) Composition of diet modifies colonization dynamics of Campylobacter jejuni in broiler chickens. J. Appl. Microbiol. 118: (1) pp. 245-254. (IF: 2.479, Applied Microbiology and Biotechnology: Q2) Awad, W.A., Smorodchenko, A., Hess, C., Aschenbach, J.R., Molnár, A., Dublecz, K., Khayal, B., Pohl, E.E., and Hess, M. (2015) Increased intracellular calcium level and impaired nutrient absorption are important pathogenicity traits in the chicken intestinal epithelium during Campylobacter jejuni colonization. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99:6431-6441. (IF: 3.337, Applied Microbiology and Biotechnology: Q1) Awad, W. A., Molnár, A., Aschenbach, J. R., Ghareeb, K., Khayal, B., Hess, C., Liebhart, D., Dublecz, K., Hess, M. (2015) Campylobacter infection in chickens modulates 14
the intestinal epithelial barrier function. Innate Immun. 21:151-161. (IF: 3.271, Microbiology: Q2) Konferencia kiadványban megjelent angol nyelvű publikációk: Molnár, A., Dublecz, F., Pál, L., Wágner, L., Hess, C., Hess, M., Husvéth, F. and Dublecz, K. The effects of various soluble non-digestible carbohydrates on gut health in broiler chickens. Fiatal Biotechnológusok Országos Konferenciája FIBOK 2018. Eötvös Loránd Tudományegyetem, Budapest, 2018.03.28-29. Dublecz, F., Pál, L., Wágner, L., Husvéth, F., Dublecz, K. and Molnár, A. The effects of feeding maize or wheat based diets with or without xylanase supplementation on the gut morphology and microflora of broiler chicks. Proceedings of the XXth European Symposium on Poultry Nutrition (ESPN). August 24-27, 2015. Prague, Czech Republic. P-141. Molnár, A., Hess, C., Pál, L., Wágner, L., Awad, W. A., Husvéth, F., Hess, M. and Dublecz, K. (2014) Diet composition modifies colonization dynamics of Campylobacter jejuni in broilers. Konferenz zum Thema 15
Geflügelernährung und Darmgesundheit. 13. June 2014. Veterinärmedizinische Universität, Wien. Konferencia kiadványban megjelent magyar nyelvű publikációk: Molnár, A., Dublecz, F., Pál, L., Wágner, L., Husvéth, F., Hess, C., Hess, M. and Dublecz, K. Nememészthető szénhidrátok etetése brojlercsirkékben: a bél fiziko-kémiai, szövettani és egyes mikrobiológiai paramétereinek változása. XXIII. Ifjúsági Tudományos Fórum, Keszthely, 2017.05.26. Molnár, A., Hess, C., Pál, L., Wágner, L., Awad, W. A., Husvéth, F., Hess, M. and Dublecz, K. Búza és kukorica alapú tápok hatása a Campylobacter jejuni kolonizációjára brojlercsirkékben. MTA Akadémiai Beszámolók, Budapest, Hungary, 2013. Molnár, A., A Campylobacter visszaszorításának lehetőségei brojlerállományokban. LIII. Georgikon Napok, Keszthely, Hungary, 2011. 16