BEVEZETŐ Tumorprogresszió és előrejelzése Dr. Győrffy Balázs Áttekintő 1. Multigénes markerek 1. Módszerek 2. Indikáció: Ismeretlen eredetű tumor Emlőrák 3. Problémák 2. Bioinformatika Közös gének génlistákban Egy gén Transzkripció szabályozása Meta-analízisek BEVEZETŐ Előnyök Multigénes markerek Multigénes folyamat több gén egyszerre! 3 patológus által adott tumor grade: 50%-os egyezés unbiased screening = meglévő tudás nem befolyásolja Módszerek #1/3 - technológia Minta FFPE FFPE Morfológia alapú Gének száma Szemi (S)-/ (Q)kvantitatív IHC FISH RT-PCR Microarray RNA-seq FFPE/ fagyasztott Fagyasztott Fagyasztott Igen Igen Nem Nem Nem Kicsi Kicsi Közepes Nagy (exonszinten) Exonszinten S S Q Q Q Statisztika Egyszerű Egyszerű Komplex Nagyon komplex Ultra komplex FDR ráta Kicsi Kicsi Közepes Nagy? BEVEZETŐ Módszerek #2/3 - felhasználás ER/PGR-státusz meghatározása IHC FISH RT-PCR Microarray Igen* Nem Igen Igen HER-2 státusz Igen* Igen* Igen Igen KEMO válasz Nem Nem Igen* Igen* Kezelés toxicitás meghatározása *klinikai alkalmazásban Nem Nem Nem Nem BEVEZETŐ FFPE: formalin fixed paraffin embedded FDR: false discovery rate 1
BEVEZETŐ Módszerek #3/3 - alkalmazás IHC FISH RT-PCR Microarray RNA-seq Mikrodisszekció Nem Nem Igen Igen Igen Több útvonal vizsgálata Nem Nem Közepes Igen Igen Standardizálás Rossz* Alacsony Közepes** Magas? Automata rendszerek Költség Közepes Közepes Magas Magas Kizárólag Alacsony (100-400 $) Alacsony (300-600$) Magas (3500$+) Magas (3500$+) Extrém (8,000-30,000$+) TUMOR EREDET *Eredménytelen scoring technikák **RNS izolálás, különböző kontrollgének Ismeretlen eredetű tumor NCCN Carcinomaof UnknownPrimary= váratlan helyen több helyen egyszerre morfológiailag gyengén differenciált NCCN útmutató: http://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/occult.pdf fizikai kórtörténet labor képalkotók Ismeretlen eredetű tumor Bloom et al, Am J Pathol, 2004 Útmutatókkal 20-25%-a azonosítható (Hillen, PMJ, 2000) Első multi-tumor osztályozó vizsgálat Összesített előfordulás: daganatok 5%-a Medián túlélés 3-6 hónap Ø megfelelő kezelés / OEP Ø fizet Egyéb technológiák? 2 platform 32k cdna microarray, 78 tumor, 8 tumortípus AffymetrixHU6800 és U95A array, 463 tumor, 21 tumortípus ANN, 85% pontosság 2
Toothill et al, Cancer Res, 2005 Fejlesztés: Microarray, 10.500 próba 229 primer és áttét-minta 14 tumortípus 89%-os pontosság 79 gén, RT-PCR (teszt: 13 beteg) Osztályonkénti top 10 gén HK Ma et al. ArchPatholLabMed, 2006 RT-PCR, 92 gén Fejlesztés: microarray: 22.000 gén 466fagyasztott (76% primer / 24% áttét) 39 tumotípus, KNN algoritmus 84% pontosság Teszt: 112 FFPE minta (70% primer / 30% áttét) 82% pontosság van Laar et al, Int J Cancer, 2009 Fejlesztés 643 tumor (497 fagyasztott, 146 FFPE) 22k microarray alapján 495 gén (KNN) Print Teszt: 229 tumor (Toothill minták) 94% pontosság Pathwork #1/3 1550 probeset/ 15 szöveti típus TOO (Tissueof Origin) vs. 1. Fejlesztés: 2.039 minta 2. Diszkrimináció validálás: 547 minta (Monzon, JCO, 2009) 3. Reprodukálhatóság validálás: 60 mintán 4 laborban (Dumur, JMD, 2008) Pathwork #2/3 Pathwork #3/3 15 similarity score Skála: 0-100 könnyen diagnosztizálható IHC rendelkezésre áll 3
mirns #1/3 Rosenfeld, Nature, 2008 mirns microarray(600 mirns) 400 FFPE/fagyasztott, 22 tumortípus 48 mirns összesített pontosság: 89% mirns #2/3 DÖNTÉSI FA elágazás mirns 1 Liver hsa-mir-122a,hsa-mir-200cb 2 Testis hsa-mir-372 3 Nodeno.12 hsa-mir-200c,hsa-mir-181a,hsa-mir-205 4 Nodeno.5 hsa-mir-146a,hsa-mir-200a,hsa-mir-92a 5 Lymphnode hsa-mir-142-3p,hsa-mir-509 6 Brain hsa-mir-92b,hsa-mir-9*,hsa-mir-124a 7 Meninges hsa-mir-152,hsa-mir-130a 8 Thymus(B2) hsa-mir-205 Nodeno.11 hsa-mir-192,hsa-mir-21,hsa-mir- 9 210,hsa-miR-34b 10Lung-pleura hsa-mir-194,hsa-mir-382,hsa-mir-210 11Sarcoma hsa-mir-187,hsa-mir-29b 12Nodeno.13 hsa-mir-145,hsa-mir-194,hsa-mir-205 13Nodeno.14 hsa-mir-21,hsa-let-7e 14Colon hsa-let-7i,hsa-mir-29a 15Stomach hsa-mir-214,hsa-mir-19b,hsa-let-7i Nodeno.17 hsa-mir-196a,hsa-mir-363,hsa-mir- 16 31,hsa-miR-193a,hsa-miR-210 17Breast hsa-mir-27b,hsa-let-7i,hsa-mir-181b Nodeno.19 hsa-mir-205,hsa-mir-141,hsa-mir- 18 193b,hsa-miR-373 19Thyroid hsa-mir-106b,hsa-let-7i,hsa-mir-138 20Nodeno.21 hsa-mir-10b,hsa-mir-375,hsa-mir-99a 21Lung hsa-mir-205,hsa-mir-152 Endo- 23Thymus(B3) hsa-mir-192,hsa-mir-345 hsa-mir-345,hsa-mir-29c,hsa-mir-182 22metrium Lung hsa-mir-182,hsa-mir-34a,hsa-mir-148b 24(squamous) mirns #3/3 Ismeretlen eredetű tumor összefoglalás 1. elágazás 12. elágazás : tumorok 5%-a nincs kezelés -> rossz prognózis Microarray +/- RT-PCR Pathwork mirns Emlőrák akadémiai vizsgálatok RÁK ÉS MULTIGÉNES MARKEREK 1. Alosztályok 2. Prognózis 3. Terápiás válasz előrejelzése 4
Emlőrák termék fejlesztés MammaPrint Prosigna Oncotype DX BLN Assay Theros Breast Cancer Index SM MapQuant DX ARUP Breast Bioclassifier Celera metastatic score exagen BCtm Invasive Gene Signature Wound Response Indicator Mammostrat Tesztek #1/3 - RT-PCR Teszt Assay Cél Név Cég Gének Elérhető száma Szövet Technika Oncotype Dx Genomic Health EU,USA 21 Ffp Q-RT-PCR Prognózis, tamoxifen kezelést követő kiújuláspredikció Theros Breast Cancer Index Biotheranostics USA 2(5) Ffp Q-RT-PCR PM prognózis,endokrin terápiát követő kiújuláspredikció Breast ARUP USA 55 Ffp RT-PCR Prognózis Bioclassifier Celera Metastatic Score Applera - 14 Ffp RT-PCR Prognózis, tamoxifen kezelést követő kiújuláspredikció Tesztek #2/3 - IHC/FISH Teszt Assay Cél Név Cég Gének Elérhető száma Szövet Technika exagen exagen Diagnostics - 3 Ffp FISH Prognózis Mammostrat Applied Genomics USA 5 IHC PM prognózis ProEX TM Br TriPath - 5 IHC Prognózis ProEX TM Br 5 antitestje: E2F TF p21 Ras asszociált fehérje Src kináz SLPI (secretory leukocyte peptidase inhibitor) Proteasome core subunit beta1 Tesztek #3/3 Teszt Assay Cél Név Cég Gének Elérhető száma Szövet Technika MammaPrint Agendia EU,USA 70 F/F Microarray Prognózis 61 éven felül MapQuant Dx Ipsoggen EU 97 F/F Microarray Prognózis Breast Lymph Node (BLN) GeneSearch Veridex UK 76 F/F Microarray Intraoperatív metasztázis kimutatás Assay Invasive Gene - - 186 F/F Microarray Prognózis Signature Wound Response Indicator - - 512 F/F Microarray Prognózis Nouvera Biosciences - Microarray Veridex - 30 - - Prognózis, tamoxifen és taxán kezelést követő kiújuláspredikció Oncotype DX #1/8 21 gén RT-PCR Klinikai haszon ER+ betegek adjuváns kemoterápiás kezelésében Távoli áttét (Paik, NEJM, 2004) Túlélés (Habel, BCR, 2006) Kemoterápia hatásossága (Paik, JCO, 2006) ASCO / NCCN útmutatók Magas penetráció Oncotype DX #2/8 ER+ LN- kemoterápia mindenkinek 100-ból 4-nél használ Kinél fog hatni a kemo? Ki valóban alacsony rizikójú? 5
Oncotype DX #3/8 250 gén 447 betegből -> 21 gén + recurrencescore(rs) Proliferáció KI-67 STK15 Survivin Cyclin B1 MYBL2 Invázió Stromelysin 3 Cathepsin L2 HER2 GRB7 HER2 BAG1 Ösztrogén ER PGR Bcl2 SCUBE2 GSTM1 CD68 Normalizálás B-aktin GAPDH RPLPO GUS TFRC Oncotype DX #4/8 Klinikai validálás #1 NSABP B-14 vizsgálat (Paik, NEJM, 2004) Csoport Betegek %-a 10 éves recurrence Alacsony (RS<18) 51% 6.8% Nem meghatározható (RS 18-30) 22% 14.3% Magas (RS>30) 27% 30.5% p=0,00001 Oncotype DX #5/8 Klinikai validálás #2 Kemoterápia hatékonyság (Paik, JCO, 2006) RS: alacsony RS: közepes RS: magas KEMO hatása Oncotype DX #6/8 Klinikai döntéshozatal (Oratz, J Oncol Parctice, 2007) Oncotype előtti ajánlás (n=68) Oncotypeután megvalósult kezelés (n=68) Csak hormonterápia 51% 68% Hormonterápia + kemoterápia 49% 32% betegek 25%-ában változott a kezelés Oncotype DX #7/8 Klinikai döntéshozatal: Vizsgálat Hely N Kezelésben változás Referencia Retrospektív USA 32 25% Oratz et al, 2007 Retrospektív USA 85 44% Asad et al, 2008 Retrospektív USA 80 18% Kamal et al, 2007 Prospektív USA 89 32% Lo et al, 2009 Oncotype DX #8/8 HER2 meghatározás (Dabbs és mtsai, JCO 2011. november) RT-PCR vs. IHC+FISH ODX(?) ODX(-) ODX (+) Összes IHC/FISH (?) 0 23 0 23 IHC/FISH (-) 5 779 0 784 IHC/FISH (+) 12 14 10 36 Összes 17 816 10 843 Költségek: 2.256 USD megtakarítás az elmaradó KEMO miatt (DE: USA árak mellett!) ODX nem alkalmas HER2 státusz meghatározására Microsoft Office Word dokumentum 6
MammaPrint #1/6 MammaPrint #2/6 Training: van t Veer, Nature, 2002 117 beteg Agilent Hu25k DNS microarray Jó / Rossz prognózis: idő távoli áttétig Áttét <5 év Áttét >5 év Teszt: van de Vijver, NEJM, 2002 295 beteg 70 gén 10 éves túlélés 70 gén: sejtciklus, invázió, áttétképzés, érképzés MammaPrint #3/6 Nyirokcsomó pozitív és negatív betegeknél is: MammaPrint #4/6 Előrejelzés jobb a klinikai és hisztológiai paramétereknél: MammaPrint #5/6 Validálás: Buyse, JNCI, 2006 307 beteg, medián utánkövetés 13,6 év klinikai praméterektől független rizikó-előrejelzés: hatás: 20-30%-al kevesebb KEMO OS MammaPrint #6/6 Klinikai döntéshozatal: - Bueno de Mesquita et al, Lancet, 2008 - Prospektív vizsgálat, n=427, Hollandia - Klinikai kezelésben változás: 26% (kemo elhagyása) 7
Klinikai vizsgálatok TAILORx MINDACT Teszt Oncotype DX Mammaprint Belépés LN- ER+ LN+ betegek Nem Igen Kérdés Ki fog reagálni kemoterápiára? Kinek vanjó prognózisa kemoterápia nélkül? Bevont betegek 10.500 6700 Randomizált betegek 4.390 1.920 Állapot Lezárva Lezárva Clinical trials NCT00310180 NCT00433589 Eredmény (várható) 2017 december 2015 március Emlő indikációk Nyirokcsomó negatív Nyirokcsomó nem releváns ER pozitív Oncotype Dx The Theros Breast Cancer Index MapQuant Dx Breast Bioclassifier Celera metastatic score Mammostrat Nouvera Biosciences SEER: ER+ 76,3% nyirokcsomó- 63,5% ER nem releváns Mammaprint Breast Lymph Node BLN Assay exagen Invasive Gene Signature Wound response indicator Emlő összefoglalás ÁTTEKINTÉS OncotypeDX Mammaprint Cég Genomic Health Agendia Alapanyag FFPE F/F (FFPE) Génekszáma 21 (RT-PCR) 70 (microarray) Legfontosabb útvonalak Indikáció Előrejelzés LN- ER+/- LN- ER+ Prognózis Predikció(CMF) Proliferáció, ER, HER-2 LN- ER+/- Prognózis Kor Idősebb betegek Fiatalabb betegek Eredmény Folyamatos Low/Highrisk Költséghatékonyság Igen igen FDA Nem hagyta jóvá Jóváhagyta ASCO Jóváhagyta Vizsgálat alatt PROBLÉMÁK ÁTTEKINTÉS ÁTTEKINTÉS Vizsgálati variabilitás forrásai Mintagyűjtés, mintatárolás Izolálás, jelölés, RNS amplifikálás Platformok különbözősége Statisztikai módszerek Gyenge pontok Alacsony statisztikai erő (20 beteg+) 3000 beteg kellene stabil mintázat felismeréséhez (Ein-Dor, PNAS, 2006) Alacsony mintaszám a fontos gének felismerésének gátja (Ioannidis, Lancet, 2005) Hiányzó / csak házon belüli validáció Más klinikai paraméterek hatásának mellőzése Poszttranszkripciós hatások: mrnsnem feltétlenül utal működő fehérje jelenlétére 8
Előrejelzés nehézségei Bioinformatika The motorcarwillneverreplacehorse Motor magazin, 1903 Forcomputers there is a world market formaybefive IBM vezérigazgató, 1943 The internet is justa passingfad - Bill Gates, 1993 GÉNLISTÁK Melanoma #1/2 GÉNLISTÁK Génlisták: közös gének? Gyorffy B, Lage H. A Web-Based Data Warehouse on Gene Expression in Human Malignant Melanoma. J Invest Dermatol. 2007 Feb;127(2):394-9. Gyorffy B, Dietel M, Fekete T, LageH. A snapshotof microarray-generated geneexpression signatures associated with ovarian carcinoma, Int J Gynecol Cancer. 2008 Nov- Dec;18(6):1215-33. Referencia Év Technológia Gének # Minták száma Viszonyítva Affymetrix 45 primary melanoma 18 benign skin nevi Talantov et al. 2005 HGU133A 33 and 7 normal skin Affymetrix human cancer GG-62 cell line 11 non-melanoma cell lines Schaefer et al. 2002 G110 30 Affymetrix 9 melanoma cell lines Normal human Hoek et al. 2004 HGU133A 590 melanocytes Segal et al. 2003 Affymetrix HGU95A 30 cell lines and 9 tissue samples 47 STS patient and 1 CCS/MSP cell line Affymetrix 6 cell lines 21 other cell lines Schaefer et al. 2004 HGU95Av2 92 Atlas human apoptosis and 10 melanoma metastases Normal human melanocytes Nambiar et al. 2005 cancer array 33 de Wit et al. 2005 custom oligos 25 IF6 and Mel57 cell lines Nevus nevocellularis Agilent Human patient T-cells 15 healthy control T- Xu et al. 2004 1 cdna 9 cells Weeraratna et al. 2004 SAGE 61 3 melanoma tissues 7 different tissues Melanoma #2/2 4 3 3 3 3 3 Leggyakoribb gének HGU133A ID UniGene ID Symbol Gene Title Gene Ontology GÉNLISTÁK 206039_at Hs.56294 RAB33A RAB33A, member RAS oncogene family small GTPase mediated signal transduction 202454_s_at Hs.306251 ERBB3 v-erb-b2 erythroblastic transmembrane receptor leukemia viral oncogene protein tyrosine kinase homolog 3 (avian) signaling pathway 206170_at Hs.2551 ADRB2 adrenergic, beta-2-, receptor, surface G-protein coupled receptor protein signaling pathway cell growth and/or maintenance 206028_s_at Hs.306178 MERTK c-mer proto-oncogene tyrosine kinase 208078_s_at Hs.380991 SNF1LK SNF1-like kinase protein amino acid phosphorylation 203723_at Hs.78877 ITPKB inositol 1,4,5- signal transduction trisphosphate 3-kinase B Ovárium #1/2 GÉNLISTÁK Publication Year Platform # a Validation (# of Samples investigated genes) Ovarian carcinogenesis Ono et al. (10) 2000 custom, 9121 genes 103 RT-PCR (9) 9 ovarian tumors compared to normal counterparts Mok et al. (54) 2001 Micromax 30 RT-PCR and IHC (1) 3 ovarian tumor cell lines vs 3 normal ovarian surface epithelial cells (validation on 64 patients and 137 control subjects) Welsh et al. (55) 2001 Affymetrix 18 RT-PCR (3) 24 malignant and 4 normal tissues HuGeneFl Tonin et al. (56) 2001 Affymetrix Hs6000 17 Northern blot (5) 4 spontanously immortalized ovarian cancer cell lines vs 1 normal ovarian surface epithelium Bayani et al. (57) 2002 custom, 1718 genes 26 RT-PCR (3) 17 tumors from 13 patients Zhang et al. (58) 2003 custom, 512 cancer related genes 30 - ovarian carcinomas vs normal ovarian tissues Donninger et al. (59) 2004 Affymetrix HGU133A plus 2.0 1150 RT-PCR (14) 37 advanced stage papillary serous primary carcinomas Lancaster et al. (60) 2004 Affymetrix HuGeneFL 45 RT-PCR (2) 31 serous ovarian cancer samples compared to 3 normal ovarian epithelial samples Santin et al. (61) 2004 Affymetrix HGU95Av2 114 RT-PCR (2) genes differentiating uterine and ovarian serous papillary carcinomas Zhang et al. (62) 2005 custom, 512 genes 39 IHC (1) ovarian carcinomas vs normal ovarian tissues Le Page et al. (63) 2006 Affymetrix HuGeneFL 6800 126 RT-PCR (13) 65 primary cultures of normal ovarian surface epithelial and epithelial ovarian cancer Bignotti et al. (64) 2006 Affymetrix HGU133A 140 RT-PCR (6) 19 flash-frozen ovarian serous papillary carcinoma vs 15 human ovarian surface epithelium short-term cultures Heinzelmann-Schwarz et al. 2006 Affymetrix custom: EosHu03 72 RT-PCR (11) 49 primary ovarian cancers and additional normal ovaries (65) Mougeot et al. (66) 2006 Affymetrix HGFA chips 54-61 ovarian specimens of normal and various cancerous type Histology subtypes Ono et al. (10) 2000 custom, 9121 genes 115 RT-PCR (9) 5 serous adenocarcinomas vs 4 mucinous adenocarcinomas Moreno-Bueno et al. (67) 2003 custom, 6386 genes 66 RT-PCR (6) 24 endometrioid carcinomas compared to 11 nonendometrioid carcinomas Zheng et al. (68) 2004 custom cdna array 9 - serous, borderline and endometrioid ovarian carcinomas Heinzelmann-Schwarz et al. 2006 Affymetrix custom: EosHu03 273 RT-PCR (11) 49 different primary ovarian cancers Therapy response Sugimura et al. (69) 2002 Toyobo arrays 45 RT-PCR (4) the ovarian cancer cell line KF, and its paclitaxel resistant clone treated with paclitaxel Lamendola et al. (70) 2003 Affymetrix HGU95Av2 18 - paclitaxel resistant sublines compared to parental SKOV-3 line Selvanayagam et al. (71) 2004 custom, 10692 genes 16-8 primary ovarian cancer specimens stratified into 2 groups based on their response to cisplatin Macleod et al. (72) 2005 Clontech Atlas human cancer chip 108 RT-PCR (14) cisplatin resistant PE01CDDP compared to parent PE01 cell line 1.2 Samimi et al. (73) 2005 Stanford microarrays 272 - oxaliplatin sensitive and stably resistant sublines were compared in 5 cell lines Bild et al. (74) 2006 Affymetrix HGU133A plus 2.0 165 - recombinant adenovirus-transformed human primary mammary epithelial cell cultures and ovarian and HGU95Av2 cancer samples, beta-catenin and src pathways Cheng et al. (75) 2006 Stanford microarrays 25 RT-PCR (5) 6 pairs of cisplatin resistant and sensitive ovarian carcinoma cells lines Prognosis and progressio Xu et al. (76) 2002 BioDoor 4096 array 22 - high and low metastatic tumor tissues and normal ovarian tissues Adib et al. (77) 2004 Affymetrix HGU95Av2 42 RT-PCR (4) stage III ovarian serous adenocarcinomas vs normal ovarian tissue of the same individuals De Cecco et al. (78) 2004 custom, 4451 cancer-related genes 30 RT-PCR (10) genes differentiating stages III-IV epithelial ovarian cancer samples Lancaster et al. (60) 2004 Affymetrix HuGeneFL 40 RT-PCR (2) 31 serous ovarian cancer samples who either survived less than 2 years or more than 7 years Ouellet et al. (79) 2005 Affymetrix HuGeneFL 45 RT-PCR (8) 37 tumors with low malignant potential and invasive tumors Motamed-Khorasani et al. (80) 2006 custom, 19200 genes 17 RT-PCR genes regulated in response to androgen exposure, effect on progression in 149 patients Mougeot et al. (66) 2006 Affymetrix HGFA chips 61 - genes differentiating between early cancer onset and low malignant potential in 27 ovarian cancer samples 9
Ovárium #2/2 Ovárium tumorigenezis GÉNLISTÁK Miért kevés az átfedés? GÉNLISTÁK GeneBank Repeat UniGene Name Symbol Gene Ontology Genes identified in more than two studies AB032951 3 Hs.446240 Protein kinase C binding PRKCBP1 DNA binding,cell cycle,regulation of transcription, protein 1 DNA-dependent AI885290 3 Hs.445818 Spondin 1, extracellular SPON1 cell adhesion,development,extracellular matrix (sensu matrix protein Metazoa),protein binding NM_002354 3 Hs.542050 Tumor-associated calcium TACSTD1 integral to membrane,plasma membrane signal transducer 1 X58288 3 Hs.49774 Protein tyrosine phosphatase, PTPRM hydrolase activity, protein amino acid receptor type, M dephosphorylation,receptor activity, Alacsony mintaszám variabilitás Nem standardizált a mintagyűjtés Terápiás válasz Több microarray platform GenBank Repeat UniGene Name Symbol Gene Ontology BF210063 4 Hs.458414 Interferon induced IFITM1 cell surface receptor linked signal transduction,immune transmembrane protein 1 (9- response,integral to membrane,negative regulation of 27) cell proliferation,plasma membrane,receptor signaling protein activity,regulation of cell cycle,response to biotic stimulus BF680512 3 Hs.522584 Thymosin, beta 4, X-linked TMSB4X NM_002087 3 Hs.514220 Granulin GRN cell proliferation,cell-cell signaling,cytokine activity,extracellular region,growth factor activity,positive regulation of cell proliferation,signal transduction NM_003257 3 Hs.510833 Tight junction protein 1 (zona TJP1 intercellular junction assembly,membrane,membrane occludens 1) fraction,protein binding,septate junction,tight junction Sok bioinformatikai módszer KMPLOT Klinikai használhatóság? EGY GÉN VS. Egy gén szerepe KMPLOT Áttekintő Nyers adat n=16k GEO Klinikai adat KMPLOT Minták osztályozása <-> gének osztályozása lekérdezés www.kmplot.com Minőség-ellenőrzés és MAS5 normalizálás Prognosztikus gének (ABCB1, TOP2A, ER, HER- 2, KI-67 ) További gének: túlélésre gyakorolt hatás független validálása? SEER adatok Génexpresszió filterezése és R input Valós idejű plottolás R-ben Grafikus visszajelzés (KM-görbe) és szignifikancia Platformok kombinálása és második normalizálás mysql adatbázis 10
www.kmplot.com KMPLOT ASCO proliferációs gének és túlélés KMPLOT MARKER GENE NAME AFFYMETRIX ID HR RFS P MKI67 antigen identified by monoclonal antibody 212020_s_at 0.95 (0.82-1.1) 1 Ki-67 212021_s_at 1.13 (0.97-1.31) 1 212022_s_at 1.8 (1.5-2.1) 1.14E-12 212023_s_at 1.3 (1.1-1.5) 0.0352 CCND1 cyclin D1 208711_s_at 1.3 (1.1-1.5) 0.0374 208712_at 1.07 (0.93-1.25) 1* CCND2 cyclin D2 200951_s_at 1.2 (1.0-1.4) 0.946 200952_s_at 0.62 (0.53-0.72) 1.23E-08 200953_s_at 0.68 (0.58-0.79) 9.02E-06 CCND3 cyclin D3 201700_at 0.7 (0.6-0.82) 0.000114 CCNE1 cyclin E1 213523_at 1.2 (1.1-1.4) 0.1518 CCNE2 cyclin E2 205034_at 2.5 (2.1-2.9) <1e-16 211814_s_at 1.2 (1.0-1.3) 1 CDKN1B cyclin-dependent kinase inhibitor 1B (p27, Kip1) 209112_at 1.3 (1.1-1.5) 0.0132 CDKN1A cyclin-dependent kinaseinhibitor 1A (p21, 202284_s_at 0.68 (0.59-0.79) 1.21E-05 Cip1) TK1 thymidine kinase 1, soluble 202338_at 1.2 (1.0-1.4) 0.506 TK2 thymidine kinase2, mitochondrial 204227_s_at 0.53 (0.45-0.62) 7.26E-15* 204276_at 0.67 (0.58-0.78) 4.18E-06 204277_s_at 0.81 (0.70-0.94) 0.1496 TOP2A topoisomerase (DNA) II alpha 170kDa 201291_s_at 2.3 (2.0-2.7) <1e-16 201292_at 1.8 (1.6-2.1) 2.05E-13* TOP2B topoisomerase (DNA) II beta 180kDa 211987_at 1.7 (1.5-2.0) 4.4E-11 KMPLOT KMPLOT Kaplan-Meier görbék Proliferáció/ kemorezisztencia markerek: TK2 TOP2A Cyclin D1 KM-plot összefoglalás A rendszer lehetővé teszi 22 ezer gén túlélésre gyakorolt hatásának online vizsgálatát emlő/petefészek/nsclc betegekben. Jelölt gének listája: Gyors előrejelzés Minimális bioinformatikai tudás Transzkripció szabályozás Gének és szabályozás Mintagyűjtés, normál / kontroll RNS izolálás DNS-re átírás DNS chipre hibridizálás Bioinformatika (normalizálás, SAM, PAM, clustering) Komplex kiértékelés: pathway analízis REGULÁCIÓS HÁLÓZATOK 11
Clustering Hierarchikus génaktivitás K-means Transzkripció áttekintése #1 G É N upstream TSS downstream 5 3 DNS 3 promoter RNS intron exon intron polimeráz mrns Fehérje Hasonlóan regulált gének egy csoportba! idő TSS: transcription start site Transzkripció áttekintése #2 TF TF TSS 5 TFBS TFBS TFBS TFBS 3 DNS 3 RNS intron exon intron polimeráz mrns Fehérje Transzkripciós faktorok #1 Gerincesekben kb. 2000 db TFBS: cis-regulációs szakaszok (transcription factor binding site) 1 gén több TFBS 1 TF több gén Hossz: 4-10 bázis, nonspecificity, mátrix TF: transcription factor TFBS: transcription factor binding site Transzkripciós faktorok #2 AC T00207 CO Copyright (C), Biobase GmbH. FA E47 SY BCF-1; E2A; E2A-E47; E2A.E47; E47; IEBP1 (rat). OS human, Homo sapiens OC eukaryota; animalia; metazoa; chordata; vertebrata; tetrapoda; mammalia; eutheria; primates SZ 651 AA; 67.3 kda (cdna) SQ MNQPQRMAPVGTDKELSDLLDFSMMFPLPVTNGKGRPASLAGAQFGG SF basic region contacts DNA, HLH domain is the dimerization[18]; SF binds DNA avidly as homodimer, or as heterodimer [8]; FF part of MEF-1 complex; IN T00003 AS-C T3; fruit fly, Drosophila melanogaster. IN T01629 Atoh2; mouse, Mus musculus. BS R04157 AS$TAL1_01; Quality: 2. BS R02139 E2A$CONS; Quality: 1. AC XX ID XX DT DT CO XX DE XX SQ XX BF SO MM MM Transzkripciós faktor kötőhely R04157 AS$TAL1_01 18.04.1995 (created); ewi. 13.06.1995 (updated); dbo. Copyright (C), Biobase GmbH. artificial sequence. acctgaacagatggtcggct. T00207 E47; Quality: 2; Species: human, Homo sapiens. 0123 Jurkat. direct gel shift supershift (antibody binding) 12
Transzkripció-regulációs hálózatok Génlista DNS chipek alapján Génlisták microarray adatokból Promoterek azonositása Kötőhelyek azonosítása Felül-reprezentált kötőhelyek Multiple testing korrekció EZ-Retrieveweb-service: http://siriusb.umdnj.edu:180 80/EZRetrieve/about.jsp MotifScanner http://homes.esat.kuleuven.be/ ~thijs/work/motifscanner.html TOUCAN http://homes.esat.kuleuven.be/ ~saerts/software/toucan.php REGULÁCIÓS HÁLÓZAT FELÁLLITÁSA Példa eredmények Szignifikáns TF-ek TFBS pozíciók META TF n p Bonferroni E47 9 0.001 Yes EGR3 4 0.02 No NFY 1 0.03 No HEN1 4 0.03 No ISRE 9 0.05 No Meta-analízis TF lista Tímár J, Győrffy B, RásóE. Gene signature of the metastatic potential of cutaneous melanoma: too much for too little? Clin Exp Metastasis. 2010 Aug;27(6):371-87. Melanoma #1/4 Nyers GEO datasetek: melanoma vs. melanoma metasztázis n=3 (zöld) Génlisták MAS5 normalizálás n=11 (sárga) Tükrözés egy Affymetrix platformra (HGU133A) Affymetrix próbákra vetítés Datasetek kombinálása (=minden elérhető adatot tartalmazó adatbázis létrehozása) Ismételten azonosított Génlistákra szűrés VSN normalizálás és adatbázis méretét gének meghatározása csökkentő szűrés (=génlisták (átlag gén < 1% * max minden gén) heterogenitása) PAM alkalmazása a génlisták validálására Unsupervised hierarchical (=génlisták értéke) clustering a primer és áttétes minták összehasonlítására META Melanoma #2/4 META Áttét-mintázatok Year Cohort Platform Bioinformatics # probes / GEO Reference Overall CV Melanoma genes in misclassification metastasis published set error using the misclassification reported genes error 2004 1 primary tumor Custom 17.5k Log2ratio, 42 NA (Wang et al.) 24.2% 5.1% 3 in-transit met cdna unsupervised 28 cutaneous met microarray clustering 35 LND met 2 visceral met 2004 13 primary skin Research Univariate + 4 NA (Becker et al.) NA NA melanoma (mixed Genetics GF200 multivariate histology) arrays analysis 10 met samples of undisclosed origin 2005 situ primary melanoma Affymetrix ANOVA, 105 NA (Smith, Hoek, and 17.2% 13.9% 2 VGP primary melanoma HGU133 Plus 2.0 Benjamini and Becker) 2 metastatic VGP Hochberg, SOM melanoma 2 LND met 2005 4 skin met Clontech Atlas SAM, cluster 33 NA (Nambiar et al.) 20.9% 0.7% human analysis cancer cdna array 1.2K 2005 25 primary skin 20,862 cdna SAM and 2,602 (list not NA (Haqq et al.) - - melanomas of Research hierarchical published) radial+vertical growth Genetics array clustering phase 11 cutaneous mets 7 LND mets 2007 19 primary skin Affymetrix Random 308 NA (Jaeger et al.) 18.1% 0.7% melanoma HGU133A permutation 22 cutaneous mets analysis and support vector machines 2008 16 primary tumor Affymetrix t-test, Pearson 1667 probes GSE7553 (Riker et al.) 5.4% 3.0% 16 cutaneous mets HGU133 Plus 2.0 correlation and (GSE7553 (GSE7553 22 LND mets SAM excluded) excluded) 2 visceral mets 2007 52 melanoma metastases Affymetrix NA NA GSE8401 NA - - 31 primary melanomas HGU133A 13
META META Melanoma #3/4 Keresztvalidált valószínűségek: Nambiar: (nagy hatékonyság) Smith: (alacsony hatékonyság) Melanoma #4/4 Prognosztikus mintázatok Year Cohort Platform Bioinformatics # probes / genes GEO Reference Overall CV Melanoma in published set datasets misclassificatio metastasis n error using misclassificati the reported on error genes 2000 4 visceral met Custom Log ratio, 22 NA (Bittner et al.) 22.8% 5.1% 1 LND met 8,150 oligo hierarchical 27 cell lines array cluster 2006 11 cutaneous 17,500 SAM, SPC 80 probes (70 NA (Mandruzzato et 29.3% 18.9% mets element genes) al.) 30 LND mets cdna 2 visceral mets microarray 2006 83 primary Pangenomic Cox 254 probes NA (Winnepenninck 19.5% 4.3% melanoma 44k oligo multivariable x et al.) 29 validation microarray model and set primary stratified logrank test melanoma 2006 45 melanomas Affymetrix ANOVA and 296 probes GSE4845 (Hoek et al.) 27.6% 11.9% in 3 cohorts HGU133A clustering (GSE4845 (GSE4845 with different /Plus 2.0 excluded) excluded) metastatic potential 2008 29 LND mets 30,888 ANOVA, hclust, 21 NA (John et al.) 26.1% 11.7% 10 LND mets MWG PCA (validation) oligonucleo tide array Post-processing Zárszó: klinikai vizsgálatok?! 1. Génlisták Átfedő gének listája Jelátviteli útvonalak (gene ontology) Biomarkerek(egy gén szerepe) Transzkripció szabályozása 2. Meta-analízis Génlista validálása Nagyobb adatbázison valódi meta 14