KONFORMER SPECIFIKUS PARAMÉTEREK

SEMMELWEIS EGYETEM GYÓGYSZERTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA KONFORMER SPECIFIKUS PARAMÉTEREK BEVEZETÉSE ÉS ALKALMAZÁSA BIOLÓGIAILAG AKTÍV VEGYÜLETEK JELLEMZÉSÉBEN Doktori (Ph.D.) értekezés MAZÁKNÉ KRASZNI MÁRTA Témavezető: Dr. Noszál Béla, D.Sc. Semmelweis Egyetem Gyógyszerészi Kémiai Intézet Budapest, 2004

TARTALOMJEGYZÉK ÖSSZEFOGLALÓ... 4 SUMMARY... 5 1. BEVEZETÉS, CÉLKITŰZÉSEK... 6 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS... 8 2.1. Rotamer analízis...8 2.1.1. A rotamer analízis diszkrét modellje...9 2.1.1.1. árom kötéses NMR csatolási állandók meghatározása...10 2.1.1.2. Rotamer csatolási állandók származtatása...12 2.1.1.3. Iteratív módszer a rotamer betöltöttség és a rotamer csatolási állandók egyidejű számítására...15 2.1.1.4. A rotamer betöltöttség számítás hibái...17 2.1.2. A rotamer analízis folytonos eloszlás modellje...18 2.2. Molekuláris paraméterek konformációfüggése...19 2.2.1. A protonálódási állandó konformációfüggése...19 2.2.2. A megoszlási hányados konformáció függése...21 2.3. A vizsgált molekulák ismertetése...22 2.3.1. N acetilcisztein...22 2.3.2. isztamin...23 2.3.3. Amfetamin...25 2.3.4. Klenbuterol...26 3. KÍSÉRLETI RÉSZ... 27 3.1. Anyagok, eszközök...27 3.2. Vizsgálati módszerek...27 3.2.1. NMR spektrumfelvételek és 1 1 csatolási állandó meghatározások...27 3.2.2. Rotamer betöltöttség meghatározások...29 3.2.2.1. N acetilcisztein rotamer betöltöttségének meghatározása...29 3.2.2.2. isztamin rotamer betöltöttségének meghatározása...30 2

3.2.2.3. Amfetamin és klenbuterol rotamer betöltöttségének meghatározása...32 3.2.3. Protonálódási állandó meghatározása NMR p titrálásból...34 3.2.4. Megoszlási hányados mérése...34 4. EREDMÉNYEK, KÖVETKEZTETÉSEK... 36 4.1. Rotamer specifikus bázicitás...36 4.1.1. Az N acetilcisztein rotamer specifikus bázicitásai...36 4.1.2. A hisztamin rotamer specifikus bázicitásai...41 4.2. Rotamer specifikus megoszlási hányados...45 4.2.1. A rotamer specifikus megoszlási hányados elméleti vonatkozásai...46 4.2.2. Amfetamin rotamer specifikus megoszlási hányadosai kloroform/víz rendszerben 48 4.2.3. Amfetamin rotamer specifikus megoszlási hányadosai oktanol/víz rendszerben...50 4.2.4. Klenbuterol rotamer specifikus megoszlási hányadosai oktanol/víz rendszerben...52 5. ÖSSZEFOGLALÁS... 58 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS... 60 IRODALOMJEGYZÉK... 61 AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT KÖZLEMÉNYEK, KÖNYVFEJEZET... 68 Az értekezés alapját képező közlemények...68 Az értekezés témájához kapcsolódó közlemények...68 EGYÉB KÖZLEMÉNYEK... 69 ELŐADÁSOK, POSZTERBEMUTATÓK... 69 3

ÖSSZEFOGLALÓ KONFORMER-SPECIFIKUS PARAMÉTEREK BEVEZETÉSE ÉS ALKALMAZÁSA BIOLÓGIAILAG AKTÍV VEGYÜLETEK JELLEMZÉSÉBEN Mazákné Kraszni Márta Témavezető: Dr. Noszál Béla, D.Sc. Semmelweis Egyetem, Gyógyszertudományok Doktori Iskola, Budapest, 2004 Program: A gyógyszerészeti tudományok korszerű kutatási irányai Gyógyszer olyan molekulából válhat, amelyik amellett, hogy hatékony a kívánt receptoron, kedvező farmakokinetikai sajátságokkal is bír. E sajátságok összefüggenek a molekulák egyes fizikai-kémiai paramétereivel, mint pl. az oldhatóság, bázicitás és a megoszlási hányados. Ezért ezeknek a molekuláris tulajdonságoknak részletes megismerése alapvető a gyógyszerkutatásban. Doktori munkám célja a gyógyszermolekulák két, talán legfontosabb fizikaikémiai paraméterének, a bázicitásnak és a megoszlási hányadosnak a vizsgálata volt abból a szemszögből, hogy a molekulák konformációs állapotának változása milyen hatást gyakorol e tulajdonságok alakulására. Két, orvosi-gyógyszerészi szempontból jelentős molekula, az N-acetilcisztein és hisztamin konformer-specifikus bázicitásait határoztuk meg NMR spektroszkópiával. Az N-acetilcisztein esetében a karboxilátcsoport bázicitását csak kis mértékben befolyásolta a konformáció, a tiolát protonálódásnál viszont jelentős eltéréseket tapasztaltunk a konformerek bázicitásában. isztamin esetében az imidazolcsoport protonálódásának volt jelentősebb hatása a rotamerek bázicitására. A konformerspecifikus állandók különbségeit minden esetben jól lehetett magyarázni a rotamerek szerkezetéből adódó intramolekuláris kölcsönhatások meglétével illetve hiányával. Kidolgoztuk mozgékony kismolekulák konformer-specifikus megoszlási hányados meghatározásának elméleti alapjait, és az amfetamin példáján bemutattuk annak kísérletes meghatározási módját kloroform/víz rendszerben. Ezt a módszert kiterjesztettük a gyógyszerészetben használatos oktanol/víz rendszerre, és megmértük az amfetamin valamint a klenbuterol ilyen típusú állandóit. Míg az amfetamin rotamerek lipofilitása csak kis mértékben különbözött, addig a klenbuterol rotamerspecifikus megoszlási hányadosai jelentős különbségeket mutattak, melyek a rotamerek eltérő szolvatációs készségével voltak összefüggésben. 4

SUMMARY INTRODUCTION AND APPLICATION OF CONFORMER-SPECIFIC PYSICO-CEMICAL PARAMETERS IN TE CARACTERIZATION OF BIOLOGICALLY ACTIVE COMPOUNDS Márta Mazák-Kraszni Tutor: Dr. Béla Noszál, D.Sc. Semmelweis University, Doctoral School of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, Budapest, 2004 Programme: Recent trends in pharmaceutical sciences Drugs are required not only to be potent at a given receptor but also to have appropriate pharmacokinetic properties. The latter is related to different physicochemical characteristics of the molecules such as solubility, basicity, lipophilicity etc. Therefore, study of these parameters is an important task in drug research. The aim of this work was to study how two physico-chemical parameters, the basicity and partition coefficient are affected by the conformational changes of the molecules. Conformer-specific basicities of two biologically active molecules, N- acetylcysteine and histamine have been determined by NMR-p analysis. It was found that the carboxylate basicities of N-acetylcysteine rotamers differ to a small extent, but the conformer-specific thiolate basicities show larger variations. In histamine, the protonation of the imidazol group has significant effect on the rotamer-specific basicities. Differences between conformer-specific parameters can be explained in terms of the existence or lack of intramolecular interactions in the conformers. Theoretical basis of the determination of conformer-specific partition coefficients has been elaborated and the experimental method of the determination has been presented for amphetamine in the chloroform/water solvent system. This method has been extended to the octanol/water system widely used in pharmaceutics. Rotamerspecific octanol/water partition coefficients of amphetamine and clenbuterol have been measured. Lipophilicity of amphetamine rotamers showed only small variations, while rotamer-specific partition coefficients of clenbuterol differed significantly, which could be interpreted in terms of intramolecular interactions between the vicinal polar sites and the solvent-accessibility of the groups. 5

1. BEVEZETÉS, CÉLKITŰZÉSEK A gyógyszermolekuláknak ahhoz, hogy biológiai hatásukat ki tudják fejteni az élő szervezetben, el kell jutni az alkalmazás helyéről a hatás helyére. A leggyakrabban alkalmazott orális adagolás esetében a gyógyszernek először fel kell oldódnia a felszívódás helyén a gyomor-bélrendszer nedveiben, lipofil membránokon át be kell jutnia a vérkeringésbe, onnan szintén membránok sokaságán keresztül a kívánt szövetbe, majd kötődnie kell a célmolekulához. Ezeket a feltételeket csak megfelelő szerkezeti és ebből adódó fizikai-kémiai tulajdonságokkal bíró molekulák képesek teljesíteni. A gyógyszermolekulák többsége ionizálható, savi illetve bázikus funkciós csoporttal/csoportokkal rendelkezik. Az ilyen molekulák testnedvekben való oldékonyságát, membránokon való átjutását és szervezetbeni eloszlását nagyban befolyásolja a molekula ionizáltsági állapota, amelyet az adott szöveti p, valamint a molekulák bázicitása határoz meg. Ez utóbbi tulajdonság jellemzésére használatos fizikai-kémiai paraméter a protonálódási állandó. A gyógyszermolekulák membránon való átjutási képességének becslésében ugyanakkor egy másik fontos tényező, a lipofilitás is szerepet játszik, amelyet a gyógyszerészetben leggyakrabban az oktanol/víz megoszlási hányadossal számszerűsítenek. Az oktanol amfifil molekula, e téren tehát a membránalkotó foszfolipidekhez hasonló tulajdonságokkal rendelkezik. A megoszlási vizsgálatokban használt vízzel telített formája mintegy 25 mol%-nyi vizet tartalmaz. Kimutatták, hogy ez a vízmennyiség kis halmazocskák formájában oszlik el az oktanolban úgy, hogy minden egyes halmazt poláris fejrészükkel a víz felé orientálódó 16 oktanolmolekula vesz körbe. Bár gyógyszerek megoszlási tulajdonságainak vizsgálatára egyre gyakrabban alkalmaznak liposzómákat és mesterséges membránokat, az oktanol/víz megoszlási hányados használatát egyszerű meghatározásának köszönhetően ezek a módszerek nem szorították ki. A gyógyszerkutatás egyik fő törekvése, hogy a fejlesztési fázisba jutott molekulák minél nagyobb hányada válhasson gyógyszerré. Tapasztalatok azt mutatják, hogy nagyon sok esetben a molekulák kedvezőtlen farmakokinetikai tulajdonságai szabnak gátat ennek a törekvésnek. Ezt megelőzendő fontos, hogy a kutatás lehető legkorábbi szakaszában ilyen irányú vizsgálatoknak vessék alá a gyógyszerjelölt 6

molekulákat. Ebben nagy segítséget nyújthat a farmakokinetikai folyamatokat befolyásoló fizikai-kémiai tulajdonságok ismerete, amelyeket vagy kísérletileg lehet meghatározni, vagy előrejelző programok segítségével lehet megbecsülni. Doktori munkám célja a gyógyszermolekulák két, talán legfontosabb fizikaikémiai paraméterének, a bázicitásnak és a megoszlási hányadosnak a vizsgálata volt abból a szemszögből, hogy a molekulák konformációs állapotának változása milyen hatást gyakorol e tulajdonságok alakulására. A konformer-specifikus bázicitás, mint fizikai-kémiai paraméter az irodalomban már leírt mennyiség, azonban ez idáig csak aminosavak jellemzésére használták. Ezért célul tűztük ki két, orvosi-gyógyszerészeti szempontból jelentős molekula, a hisztamin és az N-acetilcisztein rotamerek eloszlásának meghatározását a molekulák különböző protonáltsági állapotában, és a rotamer-specifikus bázicitások számítását. A konformer-specifikus megoszlási hányados definíciója bár elméletileg létezett, kísérleti meghatározása nem történt meg. Ezért célunk volt konformer-specifikus megoszlási hányadosok meghatározásának elméleti leírása, összefüggések létrehozása a makroszkopikus és konformer-specifikus paraméterek között, a kísérleti meghatározás kidolgozása oktanol/víz rendszerre, valamint néhány gyógyszermolekula konformerspecifikus megoszlási hányadosának gyakorlati meghatározása. Ez utóbbi vizsgálatokhoz az amfetamint és az antiasztmatikus hatású klenbuterolt választottuk. 7

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. Rotamer analízis A molekulák egyes kötéseik körül rotációra képesek, melynek során elvileg akár végtelen számú konformációt is felvehetnek. Ezek közül azonban csak néhány jelent potenciális energiaminimumot, amelyeket konformereknek nevezünk [1]. Amennyiben több forgástengellyel rendelkező molekulák esetében vizsgálatainkat csak egyetlen tengely körüli forgásra korlátozzuk, a kialakuló konformereket másképpen rotamereknek nevezzük [1]. A rotamerek egymásba folytonosan átalakulnak, egyedi életidejük a pikoszekundumos nagyságrendbe tehető. Vizsgálatuk ezért meglehetősen nehéz; a ma ismert analitikai módszerekkel normál körülmények között egymástól elválaszthatatlanok, együttes analitikai jelet szolgáltatnak. A rotamerek eloszlását kvantitatívan azok relatív koncentrációjával másnéven relatív életidejével, móltörtjével, betöltöttségével (populációjával) lehet jellemezni. Rotamerek betöltöttségének meghatározására leggyakrabban alkalmazott technika a mágneses magrezonancia spektroszkópia (NMR). Ennek alapja az elsőként Karplus által leírt összefüggés, mely szerint egy C C molekularészletben a háromkötéses (vicinális) proton proton közvetett csatolási állandó ( 3 J ) értéke függvénye a két C vektor közötti diéderes szögnek (φ) [2-4] (1. egyenlet): 3 J = A cos 2 φ B cosφ C ahol A, B és C tapasztalati úton meghatározott paraméterek. Mivel egy molekula különböző rotamerjeiben az ugyanazon két proton közötti diéderes szög eltérő, különböző lesz a csatolási állandóik értéke is. Később sok más háromkötéses csatolási állandóról is bebizonyították, hogy értékük függ a megfelelő magok közötti diéderes szögtől, pl. 1 13 C, 1 31 P, 1 19 F, 1 15 N, 13 C 31 P, 19 F 19 F stb., ezekről egy nemrégiben megjelent átfogó közlemény ad összefoglalást [5]. Bár rotamerek relatív koncentrációjának meghatározására ritkán egyéb mérési módszereket is alkalmaznak [6-7], ez idő szerint az NMR csatolási állandók segítségével történő rotamer analízis a legmegbízhatóbb, legjobban megalapozott módszer erre a célra. Ezért a továbbiakban csak ennek áttekintésével foglalkozunk. (1) 8

2.1.1. A rotamer analízis diszkrét modellje A legtöbb rotamer analízis azon az egyszerűsített elven alapul, hogy a végtelen számú konformációs állapot közül csak az energiaminimumokkal rendelkező konformerek előfordulásával számolnak. Nyílt szénláncú molekulák esetében egy kötéstengely körül általában három nyitott állású rotamer létezését feltételezik. A rotációs izomériát elsőként aminosavakon tanulmányozták [8-9], ezért a rotamer betöltöttség meghatározás elméleti alapjait e molekulák példáján szemléltetjük. Az 1. ábrán az α aminosavak C α C β kötéstengelye körüli rotáció során kialakuló három nyitott állású konformerjének Newman projekciós ábrázolása látható. 3 N R X 3 N B X 3 N A X B A COO - A R COO - R B COO - t (g) g (t) h (g-) 1. ábra α aminosavak nyitott állású rotamerjeinek Newman projekciós ábrázolása Az aminosavak rotamerjeinek Martin-féle jelölésmódja szerint [10] t jelet kap az a rotamer, amelyben a két legnagyobb térkitöltésű csoport, a karboxilát és az R csoport transz (anti-periplanáris) térállású (φ =180 ). A g és h rotamerekben ezek a csoportok gauche (szin-klinális) helyzetűek (φ = ± 60 ). A h rotamer a három nagy térkitöltésű csoportot, illetve a három hidrogént egymás közvetlen szomszédságában tartalmazza, így ez a konformer a sztérikusan legkedvezőtlenebb elrendeződésű (hindered). Peptidek konformerjeinek IUPAC jelölésmódját [11] alkalmazva aminosavakra t-vel vagy a-val (anti) jelöljük azt a rotamert, amelyben a C α és C β szénatomokhoz kapcsolódó szubsztituensek közül a Cahn-Ingold-Prelog rendszer szerint legmagasabb rangúak, esetünkben az amino és az R csoportok, transz térállásúak. g illetve g- jelölést kapnak azok a rotamerek, amelyekben a legmagasabb rangú csoporthoz (amino) képest a másik csoport (R) 60 -os illetve -60 -os elhelyezkedésű. Az 1. ábrán a rotamerek alatt zárójelben tüntettük fel a IUPAC szerinti jelölésmódot, azonban itt meg kell jegyezni, hogy szerin és cisztein esetében az R csoport ( O és S) magasabb rangú, mint az 9

amino csoport, így a rotamerek g és g- jelölésmódja felcserélődik. Mivel a későbbiek során általunk felhasznált irodalmak többségében a Martin-féle jelölésmód használatos, ezért a dolgozatban mindvégig ezt követem. Az aminosavak C α C β kötéstengelye körül két darab háromkötéses 1 1 csatolási állandó mérhető az AX illetve BX protonok között ( 3 J AX, 3 J BX ). A mért csatolási állandók a rotamerek egyedi csatolási állandóinak (J AXt,..., J BXh ) súlyozott összegei, ahol a súlyozási faktorok a rotamer móltörtek (f ) [12]: 3 J = f J f J f J (2) AX t AXt g AXg h AXh 3 J = f J f J f J (3) BX t BXt g BXg h BXh f f f 1 (4) t g h = A 2 4. egyenletekből következik, hogy a rotamer betöltöttségek számíthatók a mért csatolási állandók és a rotamer csatolási állandók ismeretében. Ugyanakkor az is megállapítható, hogy amennyiben egyes kötés körüli rotáció során három különböző rotamer kialakulását feltételezzük, két NMR csatolási állandó mérése szükséges a rotamer eloszlás teljes feltérképezéséhez. 2.1.1.1. árom kötéses NMR csatolási állandók meghatározása Vicinális csatolási állandók mérésére egydimenziós (1D) és kétdimenziós (2D) spektrumfelvételi módszerek egyaránt alkalmazhatók [13]. Kis molekulák esetében azonban legtöbbször 1D spektrum felvétele elegendő. Amennyiben a spinrendszer elsőrendű, azaz két egymással csatoló mag kémiai eltolódás különbsége nagyobb, mint a köztük lévő csatolási állandó tízszerese ( δ>10*j), a spektrumból a csatolási állandó közvetlenül leolvasható. Azonban sok esetben δ<10*j, ekkor a spinrendszer másodrendű analízise, illetve spinszimuláció szükséges a csatolási állandók pontos megállapításához [14]. A mért csatolási állandónak a lehető legpontosabbnak kell lennie, hiszen ennek bizonytalansága beépül a rotamer betöltöttségek hibájába. Manapság 1D méréssel a csatolási állandókat nagyon pontosan (<0,02 z hibával) meg lehet határozni. A 2D 10

mérések pontossága elvileg lehetne ugyanakkora, mint az 1D méréseké, de ebben az esetben a spektrumfelvételi idő meglehetősen hosszú lenne. Ezért a 2D méréssel meghatározott csatolási állandók pontossága általában kisebb, mint az 1D méréssel meghatározottaké (~0,1 z). A rotamer analízis döntő fontosságú lépése a diasztereotóp magok helyes asszignációja. Egy molekulában azok a csoportok állnak diasztereotóp viszonyban egymással, amelyek a hordozó molekulán végzett szimmetriaművelettel (tükrözés, forgatás) nem cserélhetők fel úgy, hogy az eredetivel azonos szerkezethez jussunk [15]. a a diasztereotóp csoportok bármelyikét királis vagy akirális csoporttal helyettesítjük, diasztereomerek sorozatát kapjuk. A diasztereotóp magok kémiailag elvileg sohasem egyenértékűek, tehát az NMR-el mérhető kémiai eltolódásuk különbözik. Ezzel ellentétben enantiotópok mindazok a csoportok, amelyek a hordozó molekulán végzett szimmetriaművelettel felcserélhetők úgy, hogy az eredetivel azonos szerkezetet kapjunk [15]. a az enantiotóp csoportok egyikét valamilyen akirális csoporttal helyettesítjük, akkor a másik csoport ugyanilyen helyettesítésével kapott szerkezet enantiomerjéhez jutunk. Akirális környezetben (oldószerben) az enantiotóp magok kémiailag ekvivalensek. α aminosavakban a A és B protonok diasztereotóp viszonyban állnak egymással (1. ábra). Asszignációjukra legegyszerűbb, de nem mindig használható módszer a legnagyobb betöltöttségű rotamer jóslása a kémiai szerkezet alapján. Ezt a módszert korábban gyakran alkalmazták aminosavak rotamer analízisénél, ahol feltételezték, hogy a transz rotamer, amely a két legnagyobb térkitöltésű csoportot egymástól a legtávolabb tartalmazza, az uralkodós [9, 16]. Némely esetben például az almasav lúgos közegben végzett rotamer analízisénél azt az ésszerű feltételezést használták a diasztereotóp protonok asszignációjára, hogy a két karboxilátcsoport közötti elektrosztatikus taszítás miatt ezeknek egymástól lehető legtávolabb kell elhelyezkedni [17]. Megbízhatóbb megoldás a heteronukleáris csatolási állandók ( 13 C 1, 31 P 1, 19 F 1, 15 N 1 ) használata, azaz amikor a rotamer betöltöttségeket kiszámítják mind a 1 1, mind a heteronukleáris csatolási állandókból [18-22]. Egyezést csak a helyes asszignáció esetében kapnak. A harmadik, munkaigényesebb módszer a metilén protonok egyikének sztereospecifikus deuterálása. Ezt gyakran alkalmazzák a szénhidrátok konformációanalízisében [23-27], de egyéb molekulák 11

esetében is találkozhatunk ezzel a megoldással (pl. amfetamin [28], 2 aril halopropánok [29], aminosavak [30-31]). 2.1.1.2. Rotamer csatolási állandók származtatása A rotamerek relatív életidejének meghatározásához elengedhetetlen a rotamer csatolási állandók ismerete. A 2 4 egyenletek megoldására kétparaméteres és hatparaméteres megközelítési módszereket alkalmaznak. A kétparaméteres megközelítés azon az egyszerűsítésen alapul, hogy a φ = ± 60 hoz tartozó gauche csatolási állandók értékei azonosak (J G ), és ugyanakkor nincs különbség az AX és BX protonok ilyen típusú csatolásai között sem. A kétparaméteres megközelítés szerint a 2 3. egyenletek a következő, egyszerűsített formában írhatók le: 3 J = f J f J f J (5) AX t G g T h G 3 J = f J f J f J (6) BX t T g G h G ahol J T és J G a transz és gauche rotamer csatolási állandók. Ezt az egyszerűsített módszert elsőként Pachler javasolta [9]. A megközelítés hiányossága, hogy nem veszi figyelembe a szubsztituensek térbeli elhelyezkedésének a csatolási állandóra gyakorolt hatását, amit pedig már a 60 as években leírtak [32-33]. Ennek ellenére a kétparaméteres megközelítési módot széles körben alkalmazzák főként aminosavak esetében, ahol bebizonyították, hogy a két és hatparaméteres megközelítéssel kapott rotamer betöltöttség értékek jó egyezést mutatnak [34-35]. Aminosavakra J T és J G értékeket először Pachler számított különböző aminosav mérésekből származó átlagos csatolási állandókból, és a J T és J G értékek közötti összefüggésből, amit hidroxi prolin analíziséből állapított meg [9]. A 3 J T =13,56 z és 3 J G =2,6 z értékek széleskörű alkalmazást nyertek aminosavak és peptidek analízisében [31, 36-38]. Martin eltérő módon hasonló paramétereket számított ( 3 J T =13,3; 3 J G =2,4 z) [35]. atparaméteres megközelítés esetén (2 3. egyenletek) a feladat jóval bonyolultabb, hiszen hat rotamer csatolási állandóra van szükség a betöltöttség számításához. Ilyen esetben az egyik lehetőség modellvegyületek használata. Általában 12

hattagú gyűrűs molekulák alkalmasak erre a célra, mivel ezek jobbára szék konformációban léteznek, melyben a diéderes szögek hasonlóak a nyílt láncú molekulák nyitott állású konformerjeinek diéderes szögeihez. Nagyon fontos, hogy olyan modellt válasszunk, amely az analizálni kívánt molekula szubsztituenseinek megfelelő elektronegativitású szubsztituenseket tartalmaz. Másik fontos kitétel a modellmolekulával szemben, hogy túlnyomórészt egyetlen domináns konformere legyen, mivel így képes egy adott rotamer csatolási állandóit közelíteni. Feeney aminosav rotamerek csatolási állandóit szubsztituált piridin és ciklohexilamin vegyületekből származtatta [34]. A transz csatolási állandókra 10,7 és 11,5 z, a gauche csatolási állandókra 2,0; 2,6; 3,8 illetve 4,5 z értékeket kapott. Jól látható, hogy a gauche csatolási állandók között jelentős különbségek vannak, míg a transz csatolások csak kevéssé térnek el egymástól. Nemrégiben Stenutz és munkatársai hasonló módszerrel határoztak meg szénhidrátok hidroximetil csoportjának konformáció analíziséhez rotamer csatolási állandókat, és szintén úgy találták, hogy a gauche csatolások széles tartományban változnak (1,8 5,0 z), míg a transz csatolási állandó értékei csak kis (0,4 z) különbséget mutatnak [39]. Egy másik módszer rotamer csatolási állandók származtatására a Karplus típusú egyenletek használata. A vicinális proton proton csatolási állandó diéderes szög függésének felfedezés óta bizonyították, hogy a diéderes szögön kívül sok más tényező is befolyásolja a csatolási állandó értékének alakulását. Ezek közül a legfontosabbak a szubsztituensek elektronegativitása, a szubsztituensek csatolódó protonokhoz viszonyított relatív térhelyzete, a kötéshosszak és kötésszögek. A mai Karplus típusú egyenletek többé kevésbé ezeket veszik figyelembe. Itt csak néhány fontosabb Karplus egyenletre térünk ki, részletes leírás ezekről két mostanában megjelent átfogó közleményben található [5, 40]. Talán a leggyakrabban használt általánosított Karplus egyenlet a aasnoot féle [41], amely figyelembe veszi a diéderes szöget (φ), a kapcsolódó atomok és a hidrogén közötti elektronegativitás különbséget ( χ i ) valamint a szubsztituensek egymáshoz viszonyított térhelyzetét (ξ i ) (7. egyenlet). Ez utóbbi paraméter értéke 1 vagy -1 lehet, annak megfelelően, hogy a szóban forgó protonoktól az adott szubsztituens az óramutató járásával megegyező vagy ellentétes irányban helyezkedik el (2. ábra). 3 J 2 = P1 cos φ P2 cosφ P3 χi{ P4 P5 cos ( ξi φ P6 χi )} (7) 2 13

S 3 - φ - S 2 S 1 S 4-2. ábra A pozitív (ξ i =1) illetve negatív (ξ i =-1) szubsztituensek definíciója a aasnoot egyenletben A P 1 P 6 paramétereket egy nagy adatbázisból (109 molekula 315 csatolási állandójából), mely főként merev szerkezetű hattagú gyűrűs molekulákból származott, tapasztalati úton határozták meg. ogy még pontosabban tudják figyelembe venni a szubsztituensek elektronegativitását, úgynevezett csoport elektronegativitásokat definiáltak (8. egyenlet): csoport α szubsztituens β szubsztituens i χ = χ P7 Σ χ (8) A 8. egyenletben P 7 szintén egy tapasztalati úton meghatározott paraméter. χ csoport nem egy valódi csoport elektronegativitás, hiszen csak az egy és két kötés távolságban kapcsolódó atomok (α és β szubsztituensek) elektronegativitásait veszi figyelembe, az ez után kapcsolódókat elhanyagolja. Colucci és munkatársai néhány évvel később létrehoztak egy olyan Karplus típusú egyenletet, amelyben empirikus úton meghatározott szubsztituens paramétereket használtak [44]. A parametrizálást azonban kicsi adatsoron végezték (19 molekula 49 csatolási állandójával), így a kapott egyenlet standard deviációja meglehetősen nagy (0,77 z). További fejlődést jelentett Imai és Õsawa Karplus típusú egyenlete, mely 11 kölcsönösen független paramétert vett figyelembe [43]. Ezek közül új változók voltak a Mullay féle csoport elektronegativitás [44], a szén szén kötés hosszúsága, a C C kötésszögek a C C rendszerben és a téren keresztüli kölcsönhatások. Az új egyenletet 198 csatolási állandóra illesztették, a kapott standard deviáció pedig 0,33 z. Bár ez az egyenlet megbízható, használata bonyolultsága miatt nem terjedt el. 1994-ben Altona és munkatársai továbbfejlesztették a aasnoot egyenletet azzal, hogy tényleges csoport elektronegativitásokat (szubsztituens konstansokat) hoztak létre monoszubsztituált és 1,1-diszubsztituált etán származékok proton proton csatolási 14

állandóiból (9. egyenlet) [45], és újra parametrizálták a 8. egyenletet [46]. Ez ugyan Imai és Õsawa Karplus típusú egyenletéhez képest visszalépést jelent, hiszen kötéshosszakat, kötésszögeket és téren keresztüli kölcsönhatásokat nem vesz figyelembe, azonban megbízhatósága a standard deviáció értéke alapján (0,36 z) csaknem ugyanolyan jó. 3 J = C C ( λ λ ) C λ λ (9) 00 01 1 2 012 1 A 9. egyenletben szereplő λ szubsztituens konstansok (50 szubsztituensre) és C paraméterek értékeit 84 csatolási állandóból a legkisebb négyzetek módszerével határozták meg. Egy másik fontos eredménye volt ennek a munkának, hogy vizsgálták oldószerek hatását a csatolási állandóra. Szubsztituált etán molekulák csatolási állandóit megmérték különböző oldószerekben, és azt találták, hogy olyan molekuláknál, amelyekben a kapcsolódó szubsztituens α atomja nemkötő elektronpárt tartalmaz (pl. O, N 2, OC 3 stb.), a csatolási állandó értéke eltérő lesz D 2 O ban és metanolban az egyéb szerves oldószerekben kapott értéktől. Ennek alapján két sorozat szubsztituens konstanst hoztak létre, az egyiket D 2 O és CD 3 OD közegre, a másikat egyéb szerves oldószerekre. Így a megfelelő közegű szubsztituens állandókat használva az Altona féle egyenletben, az oldószer hatását is figyelembe tudjuk venni a csatolási állandók számításakor [46]. A szubsztituens állandók ilyen típusú meghatározása azt is eredményezte, hogy vizes közegben a protonálódásra illetve disszociációra képes csoportok savas és bázikus formáira külön lehetett meghatározni szubsztituens elektronegativitás értéket. Abban az esetben, ha a szubsztituens α atomján történik a protonfelvétel vagy leadás, nagy különbségek lehetnek az elektronegativitás értékek között (pl. λ 1, 10 ; λ 0, 82). N = 2 = N 3 2 2.1.1.3. Iteratív módszer a rotamer betöltöttség és a rotamer csatolási állandók egyidejű számítására Fielding és Grant 3α hidroxi 2β (4 morfolinil) 5α () androsztán 17 on A gyűrűjének (3. ábra) szék és csavart kád konformációja közötti egyensúlyát vizsgálták különböző oldószerekben [47]. 15

Az A gyűrű csatolási állandói információt hordoznak a gyűrű konformációs egyensúlyáról. A mért csatolási állandók a tiszta szék és tiszta csavart kád konformációkban fellépő csatolási állandók súlyozott átlagai. A gyűrűben mérhető 7 csatolási állandó közül 6 ot lehet felhasználni az analízishez, mivel a 4β5α torziós szög a konformációs változásra meglehetősen érzéketlen. Így minden oldószerben egy hattagú egyenletrendszer lesz felírható. Feltételezve, hogy a tiszta szék és tiszta csavart kád konformációkban fellépő csatolási állandók a különböző oldószerekben megegyeznek (a különböző oldószerekben azonosak a megfelelő torziós szögek, valamint a szubsztituensek elktronegativitási tényezői sem függenek az oldószertől) legalább három oldószerben mért csatolási állandókra van szükség az egyenletrendszer megoldásához. Mivel 12 oldószerben megmérték a csatolásokat, egy túlhatározott egyenletrendszert kaptak, amelyből iterációval határozták meg a konformerek eloszlását, illetve csatolási állandóit. O 12 11 1 N 2 9 14 10 8 O A B C 3 5 7 4 6 13 D O 17 16 15 N Me O O N Szék Csavart kád 3. ábra 3α hidroxi 2β (4 morfolinil) 5α () androsztán 17 on szerkezete és az A gyűrű konformációs egyensúlya Abraham és munkatársai Fielding éhez hasonló módszert alkalmaztak fluoro szénhidrátok hidroximetil-csoportjának konformáció analíziséhez. Ehhez 1 1 csatolásokon kívül 1 19 F csatolásokat is felhasználtak [48]. Egy következő cikkükben elméletileg is tárgyalták a módszer alkalmazhatóságát, és megmutatták, hogy ha egy kötéstengely körül q vicinális csatolási állandót s oldószerben megmérnek, és a kötéstengely körüli rotációval p rotamer keletkezésével számolnak, akkor az s(q1) számú felírható egyenletben p(qs) számú ismeretlen fog szerepelni [49]. Ez azt jelenti, hogy ha 3 csatolási állandót tudunk mérni egy kötéstengely körül, és 3 rotamer keletkezésével számolunk, akkor minimum 9 oldószerben kell megmérni a csatolásokat 16

ahhoz, hogy az egyenletrendszerünk megoldató legyen. Példaképpen halogénezett etán származékok rotamer analízisét is végrehajtották ezzel a módszerrel. Ez a típusú rotamer analízis egzakt módszernek tűnik, mivel nem igényli a rotamer csatolási állandók becslését, ami a rotamer analízis fő bizonytalansági tényezője. Azonban felmerül a kérdés, hogy a rotamer csatolási állandók tényleg azonosak e a különböző oldószerekben? Ahogy a 2.1.1.2 fejezetben tárgyaltuk, Altona és munkatársai eltérést tapasztaltak szubsztituált etán származékok D 2 O és metanol valamint egyéb szerves oldószerekben mért csatolási állandói között. Ez a megfigyelés a szubsztituens elektronegativitások oldószerfüggését mutatja. Tehát ha a méréseket azonos típusú oldószercsoportban végzik, valamint igaz az a feltételezés, hogy a szék és kád konformációra jellemző torziós szögek a különböző oldószerekben azonosak, vagy csaknem azonosak, a rotamer csatolási állandók a különböző oldószerekben azonosnak tekinthetők. Gyakorlati szempontból azonban ez a módszer csak akkor alkalmazható, ha a vizsgált molekula konformerjeinek relatív életideje az oldószer változtatásával jelentős mértékben változik. 2.1.1.4. A rotamer betöltöttség számítás hibái A rotamer betöltöttség számítás hibájának döntő része a rotamer csatolási állandók bizonytalanságából adódó szisztematikus hiba. Kisebb mértékben természetesen a mért csatolási állandóból adódó random hiba is hozzájárul a teljes hibához. Feeney aminosav rotamerek betöltöttségének hibáját úgy számította, hogy a rotamer csatolási állandók bizonytalanságát ±0,3 z nek feltételezte. A betöltöttség hibái így ±4 8% nak adódtak [34]. Más források 0,2 0,3 z hibát feltételezve a rotamer csatolási állandókban, ±10% nak becsülték a betöltöttség hibáit [50]. Mivel egyik szerző sem írta le, milyen módszerrel számította a betöltöttség hibáit, így nem derül ki, mi okozhatja azt a logikusan nem magyarázható megfigyelést, hogy kisebb csatolási állandó hibát feltételezve a betöltöttség hibája nagyobb. Másik pontatlansága ezeknek a számításoknak az, hogy a rotamer csatolási állandók hibáját csak feltételezi, így egyáltalán nem lehetünk biztosak abban, hogy ez a valóságban 0,3 z alatt marad. 17

A hibák másik forrása az, hogy legtöbb esetben tökéletesen nyitott állású rotamerek létezését feltételezik. A kétparaméteres megközelítés esetén nincs lehetőség a pontos diéderes szög figyelembevételére. atparaméteres megközelítés esetén amennyiben a rotamer csatolási állandókat Karplus típusú egyenletből számítják, figyelembe tudják venni a pontos diéderes szög értékeket, amelyeket egy optimalizált geometriából kapnak meg [17, 51-53]. Egy következő hibaforrás lehet a torziós vibrálások elhanyagolása. Bock és Duus a nyitott állású konformerek körüli vibrációt is figyelembe vették szénhidrátok hidroximetil csoportjának konformációs analízisénél, és azt találták, hogy a torziós vibrálásnak nincs jelentős hatása a végeredményre [54]. Más szerzők szintén hasonló eredményre jutottak [53]. 2.1.2. A rotamer analízis folytonos eloszlás modellje Az irodalomban kétféle módszer található, amely a rotamerek eloszlását a teljes konformációs térben vizsgálja. E módszerek használata azonban nem terjedt el az irodalomban. A 60 as évek végén Lin leírta nemszimmetrikus 1,2 diszubsztituált etánok A 2 B 2 spinrendszerében mérhető vicinális csatolási állandóinak a rotáció potenciálfüggvényétől való függését [55-56]. Kísérleti módszert dolgozott ki rotamerek energiakülönbségének, és a rotációs gátnak vicinális csatolási állandókból történő meghatározására. Ezt a módszert később kiterjesztette triszubsztituált etánokra is [57-58]. A másik, a Džakula és munkatársai által kifejlesztett CUPID módszer (ContinUous ProbabIlity Distribution) vicinális homo- illetve heteronukleáris csatolási állandókat valamint mag Overhauser hatásokat (NOE) használ fel az eloszlásfüggvény leírásához [59-61]. A számításhoz szükség van a csatolási állandók szögfüggésének, valamint az NOE-t eredményező atomok közötti távolságok szögfüggésének ismeretére. 18

2.2. Molekuláris paraméterek konformációfüggése 2.2.1. A protonálódási állandó konformációfüggése 1974 ben Fujiwara és munkatársai közölték az első rotamer specifikus protonálódási állandókat szerin, aszparaginsav, hisztidin és fenilalanin aminosavakra [62]. Ennek elméleti alapjait a fenilalanin molekula és rotamerjeinek protonálódásán szemléltetjük (4. ábra). A 4. ábrán a rotamerek jelölésénél az alsóindex N és C jelentik az amino illetve karboxilát csoporton végbement protonálódást. N 2 N 3 C _ 2 C COO C _ 2 C COO Phe _ K 1 K 2 Phe N 3 C 2 C Phe 2 COO A X Ph X k 1t A Ph k 2 A X Ph OOC N 2 OOC N 3 OOC N 3 B t B t N B t NC X B Ph k Ph 1g k 2g X B Ph X B OOC N 2 OOC N 3 OOC N 3 A A A g g N g NC B X A k 1h B X A k 2h B X A OOC Ph N 2 OOC Ph N 3 OOC N 3 Ph h h N h NC 4. ábra Fenilalanin és rotamerjeinek protonálódási sémája Az aminocsoport és karboxilátcsoport protonálódását jellemző K 1 és K 2 makroszkopikus egyensúlyi állandók a következőképpen írhatók fel: 19

[Phe] [tn] [gn] [h ] K N 1 = = (10) [Phe ][ ] ([t] [g] [h])[ ] [Phe2 ] [t NC] [gnc] [h ] K NC 2 = = (11) [Phe][ ] ([t ] [g ] [h ])[ ] N N A rotamereket jellemző protonálódási állandók a makroállandókhoz hasonlóan definiálhatók: [t N ] k 1t = (12) [t][ ] ahol k 1t a t rotamer első protonálódási lépcsőjére jellemző egyensúlyi állandó. A rotamer koncentrációk kifejezhetők a megfelelő móltört (f) és a molekulakoncentráció szorzatával: ahol [t N ] = [Phe] (13) N f t N [t] = f t[phe ] (14) [t N ] [t N ] f t N = = (15) [t ] [g ] [h ] [Phe] N N N [t] [t] f t = = (16) [t] [g] [h] [Phe ] Behelyettesítve a 13 14 egyenleteket a 12 be kapjuk a rotamer specifikus protonálódási állandók számítására alkalmas összefüggést: k 1t ft [Phe] = f [Phe ][ ] t N = f t f N t K 1 Ebből látható, hogy a rotamerek protonálódási állandójának számításához szükség van a makroszkopikus protonálódási állandó (K 1 ) és a megfelelő protonáltsági állapotú rotamerek relatív koncentrációjának ismeretére (pl. f t, f tn...) Ez utóbbit olyan p nál lehet meghatározni, ahol szinte teljes mértékben csak az adott protonáltsági állapotban fordul elő a molekula. Fujiwara és munkatársai a rotamerek betöltöttségét a 2.1.1.2 fejezetben már ismertetett kétparaméteres megközelítéssel számították. A végeredményül kapott rotamer specifikus protonálódási állandó értékek a makroállandóktól 0,01 0,19 logk egységnyi intervallumban tértek el. A kettő vagy több átfedő protonálódást mutató bázikus centrumot tartalmazó molekulák esetében a csoportok bázicitásának teljes leírása a rota-mikroállandók (17) 20

segítségével lehetséges. Ez azt jelenti, hogy az egymástól elválaszthatatlan protonáltsági izomerek rotamer-specifikus protonálódási állandóit is meghatározzák. Ezidáig két aminosavmolekula, a cisztein és aszparaginsav esetében írták le ilyen részletességgel a funkciós csoportok bázicitását [63-64]. 2.2.2. A megoszlási hányados konformációfüggése A megoszlási hányados konformációtól való függését már a 70 es években felismerték, és többféle módszerrel vizsgálták. opfinger és munkatársa az oldószerfüggő konformációanalízist (SCAP) használták 20 különböző molekula oktanol/víz megoszlási hányadosának becslésére [65]. Azonban a vizsgált molekulák többsége viszonylag merev szerkezetű volt, így ebből a munkából nem lehetett következtetést levonni arra vonatkozólag, hogy a módszer alkalmas e mozgékony molekulák megoszlási hányadosának számítására. Későbbi tanulmányok szubsztituált hidroxikarbamidok mért és a ansch Leo féle fragmens módszerrel számolt oktanol/víz megoszlási hányadosainak különbségét a molekulák konformációs mozgékonyságával magyarázták [66-67]. 1979 ben megszületett a konformer specifikus megoszlási hányados fogalma [68]. Davis és munkatársai az egyedi konformerekhez rendelhető megoszlási hányadosként definiálták ezt az új paramétert. Ezen túl matematikai levezetések útján összefüggésbe hozták egy gyógyszermolekula biológiai aktivitását a receptoron hatékony konformer megoszlási hányadosával. Azonban ez a közlemény tisztán elméleti jellegű volt, az új paraméter kísérleti meghatározásának lehetőségével egyáltalán nem foglalkozott. Négy évvel később Pleiss és Grunewald konformációsan merev szerkezetű feniletilamin származékok megoszlását vizsgálta [69], és kiterjesztette Recker [70] és Leo [71-72] f fragmens logp számítási módszerét olyan korrekciós faktorokkal, amelyek a konformációt vették figyelembe. A 90 es években diasztereomerek megoszlását vizsgálva vontak le következtetéseket a sztereokémiai faktorok logp t befolyásoló hatására [73]. A diasztereomerek logp különbségét olyan szerkezeti és fizikai kémiai paraméterekkel hozták összefüggésbe, mint a van der Waals térfogat, a molekula teljes felülete, a poláris csoportok felülete, a dipólusmomentum, az ionizációs állandó, a hidrogén híd kötéslétesítési képesség. ogy 21

még mélyebb betekintést nyerjenek a konformer specifikus megoszlásba, különböző számítógépes módszereket dolgoztak ki. A molekuláris lipofilitás potenciál (MLP) a lipofilitás három dimenziós reprezentációja [74-75]. Nagy számú ionizálható, merev szerkezetű molekula (mono és diszubsztituált benzol származékok, védett aminosavak, ciklodipeptidek, stb.) MLP értékeit kiszámították, és korreláltatták a kísérletileg meghatározott logp értékekkel. Az így kapott összefüggés ezután alkalmazható volt egyéb molekulák MLP értékeiből történő logp predikciójára. Az MLP számos alkalmazása közül [76-78] különösen érdekes a morfin glukuronidok logp vizsgálata. A morfin 3 glukuronid és a morfin 6 glukuronid lipofilitás vizsgálatakor kiderült, hogy a vártnál jóval lipofilebbek [79]. Kvantummechanikai számítások azt mutatták, hogy a glukuronidok kétféle kitüntetett konformációs állapotban létezhetnek, egy nyújtott és egy összehajtott konformációban. Ez utóbbiban hidrogén híd kötés tud kialakulni a morfin szabad O csoportja és a glukuronsav karboxilátcsoportja között, amely a konformer lipofilitását megnöveli. Ezt a feltételezést a glukuronid konformerekre MLP módszerrel számolt logp értékek egyértelműen alátámasztották [76]. Az irodalom áttekintése azt mutatja, hogy a konformáció lipofilitásra gyakorolt hatása széles körű érdeklődésre tart számot. Bár a konformer specifikus megoszlási hányados elméleti számítása az MLP segítségével lehetővé vált, e paraméter kísérleti meghatározásának kidolgozása nem történt meg. 2.3. A vizsgált molekulák ismertetése 2.3.1. N acetilcisztein Az 5. ábrán látható N-acetilcisztein (2-acetamino-3-merkaptopropionsav) egyike a legkisebb gyógyszermolekuláknak. Széles terápiás profillal rendelkezik, legalább 12 különböző biológiai hatást tulajdonítanak neki [80-81]. Kezdetben fő felhasználási területe a paracetamol túladagolás toxikus hatásainak csökkentése volt, míg ma egyike a világszerte legszélesebb körben használt mukolitikumoknak [82]. További felhasználást nyer például a reumatoid arthritis [80] valamint hiperlipoproteinémia kezelésében [83], 22

rák terápiájában a citotoxikus és radioaktív károsodások csökkentésében [84], atheroszklerózis plakkok eltávolításában [85], stb. atásainak kialakításában feltételezhetően a tiolcsoportnak van jelentősége. Ez a funkció vesz részt a szabadgyökök megkötésben [86], a nyálka keresztkötött fehérjéiben lévő diszulfidhidak felhasításában [80], fémkomplex képzésben, valamint része a glutation (GS/GSSG) redox rendszernek is [87]. 3 C N COO O C 2 S 5. ábra Az (R)-N-acetilcisztein szerkezete In vivo viselkedését illetően számos elmélet született. Egyes publikációk azt igazolják, hogy az N-acetilcisztein képes membránokon penetrálni [83, 88], míg mások alacsony biohasznosíthatóságából és orális adagolás utáni alacsony alveoláris koncentrációjából következően tagadják ezt [84, 89]. Az N-acetilcisztein kémiai tulajdonságait illetően többirányú kutatások folynak. Vizsgálták a kristályszerkezetét [90], a fémionkomplex-képződését [91-92], az amid csoport fémion katalizálta protonleadását [93], valamint többféle módszerrel is meghatározták a protonálódási állandóit [91, 94-96]. 2.3.2. isztamin A 6. ábrán látható hisztamin (2-(1-imidazol-4-il)etilamin) egy óriási biológiai jelentőséggel rendelkező biogén amin. Számos fiziológiás hatást tulajdonítanak neki, amelyet az élő szervezetben hisztamin receptorokon keresztül fejt ki [97-98]. 1 receptoron kötődve simaizmok (bél, bronchusok, méh) kontrakcióját segíti elő, 2 receptoron keresztül növeli a gyomor sósavszekrécióját. A 3 receptor preszinaptikus elhelyezkedésű autoreceptor, amely befolyásolja a hisztamin szintézisét és felszabadulását a hisztaminerg neuronokból az agyban és néhány perifériás szövetben. 23

A néhány éve felfedezett 4 receptornak feltehetően az immunsejtek funkcióinak modulálásában van szerepe [99-101]. (τ) N 3 4 5 2 6(β) 7(α) 8 C 2 C 2 N 2 N (π) 1 6. ábra A hisztamin szerkezete és számozása A hisztamin annak ellenére, hogy kis molekula, sokféle formában (protonáltsági, tautomer, konformációs állapot) létezhet. Az amino és imidazolcsoportok protonálódásra képesek, erősen bázikus közegben (több mólos lúgoldatban) pedig a 4 es szénatomhoz kötött hidrogén disszociálhat. A nem protonált imidazol gyűrű tautomériára képes. Az aminoetil lánc egyes kötései körüli rotáció folytán eltérő konformerek alakulhatnak ki. E tulajdonságok következtében a hisztamin oldatban számos ionizációs, tautomer és konformációs állapotban fordul elő, melyek egymásba gyorsan át tudnak alakulni [102]. A hisztamin protonálódási egyensúlyait mind makroszkopikus [103-104], mind mikroszkopikus szinten tanulmányozták [105]. Fiziológiás p n 37 o C on fő formája az aminocsoporton protonált monokation, de élő szervezetben még előforduló alacsonyabb p n uralkodóvá válhat a dikation. A monokation ugyanakkor vizes közegben 80% ban N(τ) tautomer formájában létezik [106-107]. Röntgenkrisztallográfiás vizsgálatok a kristályos hisztamin semleges, monokationos és dikationos állapotában is a transz konformer létét igazolták [108-110]. Oldatban azonban mind a transz, mind a gauche konformerek előfordulnak, arányukat a mono és dikationos formára D 2 O közegben NMR mérésekkel meghatározták, és csaknem egyenlőnek találták [111-112]. A konformációs egyensúlyok tanulmányozására gázfázisban és oldatban számos elméleti kémiai számítást is végeztek, azonban ezek között az alkalmazott számítási módszertől függően eltérések mutatkoznak [113-116]. Bár a hisztamin receptorok aminosav sorrendje és egyéb molekuláris tulajdonságai ismertek [99, 117-119], a receptor 3D-szerkezete még nem áll rendelkezésre. Ezért következtetéseket arra vonatkozólag, hogy a hisztamin milyen formában kötődik az egyes receptorokon, csak indirekt úton, hisztamin származékok 24

szerkezet hatás összefüggéseiből tudtak levonni. Ilyen vizsgálatok utalnak pl. arra, hogy az N(τ) hisztamin monokation transz transz konformere az aktív a 1 és 2 receptorokon egyaránt [120-124], ugyanakkor feltételezik, hogy az 1 3 tautoméria szükséges a 2 receptor hatáshoz. Jóval kevesebbet tudunk a 3 as receptorról, de valószínűleg ott a gauche transz konformer a kötődni képes forma [122]. 2.3.3. Amfetamin A 7. ábrán látható amfetamin (1-fenilpropán-2-amin) egy közvetett módon ható szimpatomimetikum, hatását a periférián noradrenalin felszabadítása útján α- és β- receptorokon fejti ki. Emellett igen jelentős a központi idegrendszerre gyakorolt izgató, pszichostimuláns hatása. Éberséget, étvágytalanságot vált ki, a hangulatot javítja, az önbizalmat és koncentrálóképességet fokozza. Főként fiatalok körében elterjedt kábítószer, mely pszichés függőséget okoz. A központi idegrendszeri hatás szempontjából az ()-S enantiomer mintegy 3-4-szer hatékonyabb, mint az (-)-R [125]. C 2 N 2 C 3 7. ábra Az (S)-amfetamin szerkezete Az amfetamin konformációanalízisét Makriyannis és Knittel elvégezték a molekula bázikus és protonált formájában egyaránt [28]. Vizes közegben mindkét protonáltsági állapotban a metil és fenil csoportot transz helyzetben tartalmazó rotamer az uralkodó, míg a sztérikusan legkedvezőtlenebb elrendezésű rotamer, amelyben a három nagy térkitöltésű csoport egymás közvetlen szomszédságában helyezkedik el, csak nagyon kis mennyiségben fordul elő. Az amfetamin protonálódási állandója, oktanol/víz valamint kloroform/víz megoszlási hányadosa szintén megtalálható az irodalomban [72]. 25

2.3.4. Klenbuterol A 8. ábrán látható klenbuterol (1-(4-amino-3,5-diklórfenil)-2-[(1,1-dimetiletil)- amino]etanol) a szimpatomimetikumok közé sorolható, szelektív β 2 -receptorhatással bíró gyógyszermolekula. N 2 Cl Cl C 2 O N C 3 C C3 C 3 8. ábra Az (RS)-klenbuterol szerkezete Fő felhasználási területe az asztma terápiája [126]. A simaizomrelaxáló képessége mellett jelentős anabolikus hatással is rendelkezik, ebben a tekintetben a szteroidokhoz hasonlítható [127]. Elősegíti az izomzat növekedését és a testzsír csökkenését, ezért testépítők és atléták illegálisan használják izomzatuk növelésére, emellett az állattenyésztésben is felhasználják (szintén illegálisan) például szarvasmarháknál a hús/zsír arány növelése céljából [128]. Mivel az állatok májában és húsában jelentős mennyiségben képes felhalmozódni, az ilyen hús fogyasztása emberekben mérgezést is okozhat, mely főként szívrendellenességek formájában jelentkezik [129-130]. A klenbuterol királis molekula. A gyógyászatban ugyan racém formáját használják, de farmakológiai tanulmányok azt mutatják, hogy a (-)-R konfigurációjú enantiomer felelős a β 2 -receptor hatásért [131]. Fizikai-kémiai tulajdonságairól, mint a bázicitás és lipofilitás, valamint konformációanalíziséről semmilyen információ nem található az irodalomban. 26

3. KÍSÉRLETI RÉSZ 3.1. Anyagok, eszközök A vizsgálataink tárgyát képező molekulák, az N acetil L cisztein, hisztaminium klorid, D amfetaminium szulfát, DL klenbuterolium klorid a Sigma cégtől származtak. Az NMR mérésekhez használt deutériumoxid a Merck, a nátrium deuteroxid, deutérium klorid a Sigma termékei voltak. A megoszlási kísérletekhez UVspektroszkópiás minőségű n oktanolt (Fluka) használtunk. A szubsztituenskonstansok meghatározásához a 4 izopropilimidazolt és 2,6 dikloro 4 izopropilanilint a Semmelweis Egyetem Gyógyszerészi Kémiai Intézetében Dr. Kökösi József szintetizálta, az N tercierbutil izopropilamint az Aldrich cégtől szereztük be. A pufferek készítéséhez analitikai tisztaságú káliumhidrogénftalátot (Merck) és bóraxot (Sigma), valamint kétszer desztillált vizet használtunk. Az NMR spektrumok Bruker AM 200, Bruker AM 360, Bruker AM 400 valamint Bruker DRX 500-as készüléken készültek. Az oldatok p-jának mérését Orion 9103BN típusú kombinált üvegelektróddal felszerelt Radiometer PM93 p mérővel végeztük. A megoszlási hányadosok meghatározásához Jasco V-550 típusú UV/VIS spektrofotométert használtunk. 3.2. Vizsgálati módszerek 3.2.1. NMR spektrumfelvételek és meghatározások 1 1 csatolási állandó A protonspektrumok felvételénél minden esetben 90 os impulzust alkalmaztunk. A spektrumablakot és az adatpontok számát úgy állítottuk be, hogy a digitális felbontás 0,02 z/pont legyen. A spektrumok elemzését Mestrec 2.3 [132], illetve 1D WINNMR programokkal végeztük. A vizes oldatok mérésénél, amennyiben szükséges volt, a DO jel elnyomására előtelítést alkalmaztunk (9. ábra) [13]. 27

d1 p1 p2 aq 9. ábra Az előtelítéssel történő vízelnyomás pulzusszekvenciája A vízjel frekvenciáján 2 másodpercig kis teljesítményű besugárzást (p1) végeztünk, majd a besugárzás megszüntetése után adtuk ki a 90 os impulzust (p2), és detektáltuk a FID-et (aq). A rotamer-specifikus megoszlási hányadosok meghatározásához spektrumfelvételeket n-oktanolban, pontosabban D 2 O-val telített n-oktanolban is kellett készíteni, ami nem szokványos feladat. Mivel deuterált oktanol nem állt rendelkezésünkre, egy koaxiális betétbe D 2 O-t töltöttünk, majd ezt behelyeztük az oktanolos mintacsőbe, így tudtunk a készülék stabilizálására deutérium lockot alkalmazni. Az oldószer két nagyobb jelének (3,5 ppm-nél és 1,3 ppm-nél) elnyomására a klenbuterol oktanolos oldatában a protonok gerjesztését az 1-3 -3-1-es pulzusszekvenciával végeztük (10. ábra) [133-134]. p1: x, -x, -x, x, y, -y, -y, y p3: -x, x, x, -x, -y, y, y, -y aq: x, -x, -x, x, y, -y, -y, y d1 p1 d2 p3 d2 p3 d2 p1 aq 10. ábra Az 1-3 -3-1-es pulzusszekvencia A 90 os impulzust d2 időközökkel négy részletben (11,25-33,75-33,75-11,25 ) adtuk ki. A besugárzás frekvenciáját az oktanol 3,5 ppm-nél lévő jelére állítottuk, a d2 időintervallumot pedig a 3,5 ppm-es oktanol jel és az 1,3 ppm-es oktanol jel közötti z-ben mért távolság reciprokának vettük. A szekvencia eredményeképpen a besugárzó frekvencián és attól 1/d2 intervallumokra lévő jelek nulla intenzitásúak lesznek, az ezeken kívül eső jelek intenzitása a normál protonspektrum intenzitásától eltér. Ezen kívül a spektrum egyik illetve másik fele ellentétes fázisban lesz. E 28