Röntgendiffrakció Grama László 2012. május
Áramlási citometria Visegrády Balázs Biofizika előadás - 2012 Az áramlási citometria - fogalmak Áramlási citometria (flow cytometry) Eljárás, amellyel folyadékáramban lévő mikroszkópikus részecskék, pl. sejtek, kromoszómák egyedi tulajdonságait fizikai, kémiai, biokémiai, biológiai jellemzőit mérik Sejt sor6ng vagy FACS: Fluorescence- Ac6vated Cell Sor6ng Sejtek vagy részecskék elkülönítése, elválasztás mért paramétereik szerint 1
Az áramlási citometria alkalmazhatósága Részecskék (sejtek) számlálása sejtszupenzióban Biologiai és nem biologiai elkülönítése Élő és nem élő részecskék (sejtek) elkülönítése Nagyszámú, 10 5-10 6 számú részecske mérése percenként Részecskék fényszórásának és/vagy fluorescenciájának mérése SorZng : egyedi részecskék elkülönítése TörténeZ há]ér Áramlási citométer baktériumok detektálására aeroszolban (1947) Wallace Coulter - Coulter orifice (1953), az elektromos vezetőképesség változásait detektálta Kamentsky sorter (1965) 2
Az áramlási citometria fejlődése Az áramlási citometria alapjai Hidrodinamikai fókuszálás Fényszórás - lézer vagy Hg- gőz lámpával Fluoreszcencia detektálás ElektrosztaZkus részecske szétválasztás, vagy sorzng Többváltozós adat analizálás 3
Áramlási citométer - felépítés Fényforrás Áramlási rendszer (hidrodinamikai rendszer) OpZkai rendszer Detektáló rendszer Adatgyűjtés, adatanalízis SorZng Áramlási citométer - felépítés PMT 5 PMT 4 Minta Áramlási cella Dichroikus tükrök PMT 2 PMT 3 Fényszórás detektor Sávátersztő szűrők PMT 1 Laser 4
A hidrodinamikai rendszer Jel detektálás Hidrodinamikai fókuszálás A köpenyfolyadék (diam.: 200 μm) veszi körül a mintafolyadékot (20 μm) (lamináris áramlás) A mintafolyadékot az áramlási fej közepére fókuszálja A hidrodinamikai fókuszálás célja: a sejtek a lézerfény útjába való lokalizálása 5
OpZkai felépítés, adatgyűjtés Fényforrás: gerjesztő/megvilágító rendszer Lézerek (350-363, 420, 457, 488, 514, 532, 600, 633 nm) Argon ion, Krypton ion, HeNe, HeCd, Yag, szilárdtest Ívlámpák Higany- gőz, Hg- Xenon (megfelelő vonalak) Detektáló rendszer Fotoeletron- sokszorozó (PMTs) Fotodiódák Az előre irányuló szórás (Forward sca]er, FSC) mérése (gyakoribb) Oldal irányú fényszórás (side sca]er, SSC) mérése Fényszórás Előre- és oldalirányú fényszórás Előre irányuló fényszórás detektálása Előre irányuló fényszórás, FSC 6
Oldalirányú fényszórás Fényszórás alkalmazása Az oldalirányú fényszórás, SSC a sejtek granuláltságától függő jel Az előre irányuló fényszórás, FSC a sejtmére]el arányos jel 7
Fluoreszcens jel detektálás A gerjesztés hatására emi]ált fényt 90 - os szögben detektálják Több fluoreszcens jel egyidejű detektálása Több fluorofór együ]esen, vagy térben elkülönítve kerül gerjesztésre Az emissziós jeleket a dichroikus tükrök és sávszűrők beiktatásával választják szét 8
OpZkai rendszer Az emi]ált fény a fluoreszcens spektrum több régiójának jelét tartalmazza Hullámhossz alapján történő szétválasztás szükséges Dichroikus tükrök Sávszűrők A műszer felépítése 9
A fotodiódákról/pmt- ről származó jelet analóg- digitális átalakítók (ADC) számokká alakítják Analóg jelek Digitális jelek FSC SSC FITC Lézer késleltetés APC A számok konvertálása paraméterekké A fotodiódákról/pmt- ről származó jelet analóg- digitális átalakítók (ADC) számokká alakítják Jelszélesség "adatok száma (sebességtől függ) Csúcsmagasság fluorofór max. sűrűsége Terület a teljes fluorofór mennyiség Nincs holzdő 10
Sejtszeparálás sorzng A piezoelektromos kristály rezgése (30-40 MHz) cseppekre bontja a folyadékoszlopot ( break poin t). A cseppek vagy egy sejtet tartalmaznak vagy nem tartalmaznak semmit. A cseppek (sejteket) a mért fényszórás vagy fluoreszcencia jelek alapján kiválaszták ( gazng ) A cseppeetk poziwv vagy negawv töltéssel látják el. Ezután stazkus elektrosztazkus térben a cseppek mozgására merőlegesen erő hat, mellyel a szétválasztás történik A sorzng általábana sejtkultúrák poziwv populációjának elválasztására szolgál, további sej]enyészetekhez. Fluoreszcens jelölés - immunofluoreszcencia A sejtek (pl. leukociták) jellegzetes molekula kombinációt expresszálnak a sejt felszínén, ami függ a sejtek.. típusától differenciálódási stádiumától akzvációs állapotától egyéb funkcionális állapotától, kóros elváltozásától, differenciálódási mechanizmusoktól Tipikus detektálásuk monoklonális anztestekkel történik, amik a sejzelszíni anzgénekhez jötődnek Áramlási citometriás célra az anztesteket fluoreszcencensen jelölik direkt vagy indirek módon 11
Immunofluoreszcens jelölés (direkt) sejt Fuoreszcens festékkel jelölt anztestek Immunofluoreszcens jelölés (direkt vs. indirekt) sejt sejt 12
Fluoreszcens festékekkel szemben támaszto] követelmények: Emi]áljanak olyan hullámhosszon, ahol kicsi az autofluoreszcencia Az emissziós spektrum a lehető legkisebb ázedést mutassa a többi festék spektrumával (kompenzáció) Kvantumhatásfok, abszorpciós együ]ható legyen magas, azaz produkáljanak erős, jól detektálható fluoreszcenciát (érzékenység) Aspecifikus kötődés kimértékű Olcsó, egyszerű eljárás Ne módosítsák jelentősen a jelölt molekula tulajdonságait Fluoreszcencia kompenzáció FITC PE PE- TR PE- CY5 Két vagy több fluorofór egyidejű használatával a fluoreszcencia emissziós jelek egybe eshetnek A fluoreszcencia kompenzáció alkalmazásával az adatanalízis során a nemkívánatos jelázedéseket lehet kompenzálni 13
Az adatok tárolása, adazeldolgozás Az adatok elmentése ún. FCS (flow cytometry standatrd) file- ban történik, ahol minden sejtről az összes mért adat elmentésre kerül Adatanalízis - egyparaméteres hisztogram Események száma Események száma Jelintenzitás (pl. fluoreszcencia) Jelintenzitás a megvilágítás időtartama néhány μs opzmálisan 10 5-10 6 db/s a mérés sebessége 14
Fényszórás Forward Scatter Neutrophils Monocytes Lymphocytes 0 200 400 600 800 1000 90 Degree Scatter Humán fehérvérsejt Kapuzás Az összes lemért FL4 eloszlása. Csak a piros kapun (limfociták) belül lévő sejtek FL4 eloszlása. 15
Kapuzási lehetőségek SCATTER FLUORESCENCE IMAGE L M G Az adatok megjelenítése Kétdimenziós ábrázolási módok: 1. Dotplot: A 2 tengelyen 1-1 mért paramétert tűntetünk fel, az ábrán minden pont egy sejtnek felel meg 2. Density plot: az ábrán a pontok színe a sejtek számát jelenz 3. Contour plot: az azonos sejtszámú pontokat vonalakkal közk össze. 4. 3D plot (surface,felszín): a sejtek számát a z tengelyen ábrázolják (ritka) 16
Előkészítés: mintavétel (vérsejt), sejtkultúra, sejtkezelés, sejtek fixálása, fluoreszcens jelölés Tesztadatok felvéte, kontollok alkalmazása Kapuzás kiválasztása Kívánt mennyiségű adat gyűjtése az ado] kapun belül illetve sorzng Adazeldolgozás bármely későbbi időpontban A mérések menete A módszerben rejlő hibalehetőségek Asszimmetrikus sejtek orientációfüggő jelet adnak további teszt szükséges (pl. vvt) A kontrollok hiánya fals poziwv/ negawv eredményt adhat A centrási dogma ellenőrzése a fluoreszcens jel mindig arányos a kötö] fluorofór mennyiségével? 17
Az áramlási citométer diagnoszzkai alkalmazásai ImmunZpizálás áramlási citometriával Leukémia diagnózisa AIDS diagnoszzka (CD4+ T sejt szám alapján) 18
Sejtciklus és DNS tartalom analízis 1. A sejtek fixálása, permeabilizálása, hogy a DNS festékkel való jelölés 2. A DNS festék (pl. propidium jodid; DAPI; 7- AAD, stb) a sejtmagban sztöichiometrikusan kötődik a DNS- hez 3. A mért fluorszcencia intenzitása arányos a sejt DNS tartalmával. Alkalmazási terület: Daganatos sejtek elkülönítése, amik a normálisnál magasabb DNS tartalommal magasabb S és G2/M aránnyal rendelkeznek ApoptóZkus sejtek elkülönítése apoptózkus sejt Normális G0/G1 sejtek Sejtszám PI - Fluoreszcencia 19
Kromoszóma analízis A legtöbb humán kromoszóma áramlási citometriával elkülöníthető DiagnoszZkai alkalmazási területek, összegzés 20
AkZn filamentum/monomer arány meghatározása sejtekben A F/G- akzn arány eltolódása funkcionális zavart okoz miopázás betegségekben AkZn miopázás betegségekben fellelhető mutációt hoztunk létre sejtmodellben A mutáns akznt kék (Marina- Blue- conjugated secondary anzbody), G- akznt zöld (Alexa Fluor 488- conjugated DNaseI) és F- akznt piros (Texas- Red- conjugated phalloidin). A F/G- akzn arány relawv változása akzn miopázás betegségekben Visegrády B, Machesky L. 2010. Összefoglalás Áramlási citometria, FACS Hidrodinamikai fókuszálás Fényszórás, fluoreszcens jel detektálás Nagyszámú sejt többszempontú vizsgálata DiagnoszZkai, kutatási alkalmazások széles köre Felhasznált irodalom: Damjanovich S. Fidy J. Szöllősi J. (szerk.), Orvosi biofizika, Medicina Kiadó, 2006 Howard M. Shapiro: PracZcal Flow Cytometry, 4th EdiZon, ISBN: 978-0- 471-41125- 3 J.Paul Robinson, lecture, 2005 21
Köszönöm a figyelmet! www.biofizika.aok.pte.hu 22